CC BY
20
УДК 616-089.843 © Коллектив авторов, 2021
О.Р. Шантана12, Р.А. Хасанов1, Л.А. Булгакова1, Р.Д. Гайнутдинова1 МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И БИОМЕХАНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СТРУКТУРЫ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ ТРАНСПЛАНТАТОВ
1ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Минздрава России, г. Уфа 2ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Уфа
Цель исследования: оценка состояния волокнистого остова основного вещества и биомеханических свойств различных типов соединительной ткани.
Материал и методы. Исследовали образцы различных типов соединительной ткани человека: сухожилия различной локализации, дерму опорных участков стопы (сетчатый слой), висцеральные оболочки органов, реберный хрящ, подкожно-жировую клетчатку. Были использованы методы световой, поляризационно-оптической, электронно-сканирующей микроскопии, морфометрия, гистохимический анализ. Физико-механические свойства образцов оценивали на растяжение и сжатие.
Результаты и обсуждение. Проведена оценка состояния волокнистого остова основного вещества и физико-механических свойств исследуемых образцов. Результатом микроскопических исследований стали макро- и микрофотографии с различным увеличением. В результате морфометрических исследований были получены средние значения толщины пучков коллагеновых волокон и размеров межпучковых пространств. В итоге проведенных физико-механических испытаний образцов были получены данные об упругопрочностных свойствах ткани, а именно предел прочности, относительное удлинение, модуль Юнга. Проведенный гистохимический анализ показал степень содержания гликозаминогликанов в основном веществе.
Выводы. Определен комплекс универсальных методов для оценки структурных и физико-механических свойств различных соединительных тканей при изготовлении аллотрансплантатов.
Ключевые слова: соединительная ткань, фиброархитектоника, коллагеновые волокна, основное вещество, гликозами-ногликаны, морфометрия, поляризационно-оптический анализ.
O.R. Shangina, R.A. Khasanov, L.A. Bulgakova, R.D. Gainutdinova MORPHOLOGICAL AND BIOMECHANICAL ASSESSMENT OF VARIOUS TYPES OF CONNECTIVE TISSUE STRUCTURE IN THE MANUFACTURE OF TRANSPLANTS
Purpose: evaluation of the fibrous framework condition, basic substance and biomechanical properties of various types of connective tissue.
Material and methods. There were studied the specimens of various types of connective tissue: tendons of various localization, derma of the supporting foot areas (reticular layer), visceral membranes, costal cartilage, subcutaneous fat. We used the following methods: those of polarizing-optical, electron-scanning microscopy as well as morphometry, histochemical analysis. The physico-mechanic properties of the specimens were evaluated for tension and compression.
Results and discussion. There was carried out the assessment of the fibrous framework condition, basic substance and physico-mechanical properties of the specimens under study. Macro- and microphotographs with different magnification were the results of the microscopic studies. As a result of the morphometric studies there were obtained the thickness mean values of the collagen fiblre bundles and size of the interbundle spaces. As a result of the carried our physico-mechanical tests of the specimens we obtained data on elastic-strength properties of different tissues, namely tensile strength, relative elongation, Young modulus. The carried out his-tochemical analysis showed the glycosaminoglycan content degree in the basic substance.
Conclusions. A set of the universal methods is defined for the assessment of the structural and physico-mechanical properties of different connective tissues when manufacturing allotransplants.
Key words: connective tissue, fibroarchitectonics, collagen fibers, basic substance, glycosaminoglycans, morphometry, polariz-ing-optical analysis.
Важной задачей восстановительной хирургии является воссоздание целостности нарушенных функций органов и тканей [1,4,5,11]. Для решения этой задачи разрабатываются и внедряются в клиническую практику различные виды соединительнотканных трансплантатов (СТТ), позволяющие создавать в реципиентном ложе регенерат, по своим морфологическим и физико-механическим характеристикам соответствующий окружающим дефект тканям [3,6,8,9,12].
Цель исследования - подбор определенного комплекса методов для оценки мор-фофункционального состояния соединительной ткани в процессе изготовления алло-трансплантатов.
Материал и методы
Были исследованы образцы следующих анатомических структур: сухожилия под-вздошно-реберной мышцы (СМ), дермы опорных участков стопы (ДП) (сетчатый слой), фиброзной капсулы почки (ФКП), реберного хряща (РХ), подкожно-жировой клетчатки (ПЖК). Основу предлагаемой методологии составили следующие методы изучения структуры биологических тканей - световая микроскопия, сканирующая электронная микроскопия, поляризационно-оптический анализ.
Количественные показатели (толщина пучков коллагеновых волокон и величина межпучковых пространств) определяли мор-фометрическим методом. Для определения
основного вещества соединительном ткани был использован гистохимический метод выявления гликозаминогликанов по Хейлу. Физико-механический потенциал образцов оценивали на растяжение и сжатие. Оценку фиб-роархитектоники соединительнотканных ал-лотрансплантатов проводили при помощи поляризационной микроскопии неокрашенных гистологических срезов толщиной 10 мкм.
Исследование и фотографирование образцов проводили с использованием поляризационного микроскопа МИН-8 и цифровой фотонасадки №соп Соо1р1х 4500 при скрещенных фильтрах. Для гистологических исследований срезы окрашивали гематоксилином и эозином, орсеином по Вейгерту и по Ван-Гизону. Для определения основного вещества соединительной ткани был использован гистохимический метод выявления глико-заминогликанов (ГАГ) по Хейлу. Микроскопические исследования проводили на световых микроскопах ШКАУАЬ и АХ10 ГМЛОЕЯ^Г (С.2е188, Германия).
Для ультраструктурного исследования СТТ использовали метод сканирующей электронной микроскопии. Микрофотографирование проводили на сканирующем электронном микроскопе 18М-840 (1ео1, Япония) при увеличениях 100-3000. Количественные показатели (толщину пучков коллагеновых волокон и величина межпучковых пространств) определяли морфометрическим методом. Для этого использовали микроскоп АХ10 ГМАОЕЯ -21 (С.2е188, Германия) с аппаратно-программным комплексом Ахюу18юп. Исследование физико-механических свойств алло-трансплантатов проводили на универсальной машине для испытания прочностных свойств материалов модели 1185 Г^ТЯОК (Англия).
Результаты и обсуждение
При микроскопическом исследовании структура сухожилия подвздошно-реберной мышцы представлена плотно упакованными пучками коллагеновых волокон (КВ), имеющих преимущественно однонаправленную ориентацию (рис. 1).
Исследование в поляризационном свете демонстрирует выраженный эффект двойного лучепреломления, что свидетельствует о высокой оптической активности пучков колла-геновых волокон, характерной для плотной оформленной соединительной ткани. На ска-нограммах прослеживаются тонкие солитар-ные волокна, образующие связочную систему сухожилия. Плотная упаковка и однонаправленность пучков КВ параллельно длинной оси сухожилия определяют высокие механические свойства, что является основным показателем для данного вида ткани, поэтому нами был сделан акцент на морфометрию и биомеханическое исследование.
Среднее значение толщины пучков КВ составило 47,49±10,37 мкм, величины межпучковых пространств - 19,17±3,57 мкм. Физико-механические свойства образцов сухожилия определялись при продольном растяжении. В результате испытаний были получены следующие показатели: предел прочности равен 104,5±3,3 МПа, относительное удлинение - 0,15±0,002. Модуль Юнга составил 1110,0±36,0 МПа. Гистохимическое исследование показало слабоположительную реакцию (+), что свидетельствует о незначительном содержание ГАГ в основном веществе исследуемых образцов сухожилия (рис. 2).
111 ;
Рис. 1. Структурная организация сухожилия. Световая микроскопия. Окраска по Ван-Гизону. Ув. х200
Рис. 2. Слабоположительная реакция на содержание ГАГ в ткани сухожилия. Гистохимическая реакция по Хейлу с до-краской эозином. Ув. х200
Фиброархитектонику дермы опорных участков стопы можно охарактеризовать как коллагено-волокнистый каркас, образованный извилистыми, способными к растяжению волокнами. Пучки КВ, переплетенные во всех направлениях, имеют сложную пространственную ориентацию, что подтверждает световая микроскопия препаратов, окрашенных по Ван-Гизону. Поляризационно-микроскопи-ческое исследование демонстрирует высокий уровень оптической активности коллагеновых волокон. Сканирующая электронная микроскопия показала разнонаправленный характер пучков КВ, связанных между собой системой тонких волокон и фибрилл (рис. 3).
Рис. 3. Ультраструктура дермы опорных участков стопы.
Сканирующая электронная микроскопия. Ув. х2500
В связи с тем, что структура ДП имеет неориентированный тип коллагенового остова, присущего плотной неоформленной соединительной ткани, в котором волокнистые элементы расположены без определенной геометрической закономерности, проведение полноценного морфометрического анализа не представляется возможным. Гистохимическое исследование ДП по Хейлу свидетельствует о значительном содержании ГАГ в составе основного вещества расположенного между пучками КВ (рис. 4).
Характерной особенностью ДП является способность к ремоделированию коллаге-новых и эластиновых волокон в направлении их удлинения и соответственно, возвращения им исходной спиральности, утраченной при растяжении. Этим объясняются высокие упругопрочностные свойства ДП, что подтверждается результатами физико-механических исследований: относительное удлинение образцов ДП составило 0,6±0,06, значение предела прочности - 12,9±0,7 МПа. Параметр модуля Юнга составил 23,5±1,2 МПа.
Рис. 4. Положительная реакция Хейла на содержание ГАГ в основном веществе дермы опорных участков стопы. Гистохимическая реакция по Хейлу с докраской эозином. Ув. х400
Изучение фиброархитектоники фиброзной капсулы почки, которая относится к плотной неоформленной соединительной ткани, показало, что в структуре ткани определяются два слоя КВ: внутренний - рыхлый и наружный - более плотный. На препаратах, окрашенных по Ван Гизону, внутренний слой
представлен множеством тонких, разнонаправленных, переплетенных КВ между собой (диаметр 1-3 мкм) и их пучками, имеющими рыхлую организацию (рис. 5).
Данные сканирующей электронной микроскопии свидетельствуют о том, что наружный слой представляет собой извилистую и компактную тонковолокнистую сеть, образованную как отдельными плотно лежащими КВ, так и их пучками. Данные гистохимического анализа наглядно демонстрируют высокое содержание ГАГ в основном веществе ткани. При проведении поляризационной микроскопии образцов ФКП КВ показали высокую оптическую активность. Из-за трехмерной организации пучков КВ данной ткани морфометрический анализ не показателен. Физико-механическое исследование проводить в данном случае также нецелесообразно, так как трансплантаты, изготовленные из ФКП, как правило, не несут биомеханической нагрузки.
Рис. 5. Структура фиброзной капсулы почки: 1 - наружный слой; 2 - внутренний слой. Окраска по Ван-Гизону. Ув. х100
Для реберного хряща, который относится к скелетной ткани, характерна структура, представленная территориальным и межтерриториальным межклеточным матриксом из переплетенных КВ и фибрилл, образующих лакуны, что отчетливо прослеживается на сканограммах (рис. 6).
■кг-р я шш п^н -шг . . ка
Рис. 6. Архитектоника реберного хряща. Сканирующая электронная микроскопия. Ув. х500
Наружные волокна стенок лакун переходят непосредственно в волокнистый каркас межтерриториального матрикса, в котором КВ ориентированы в направлении вектора
действия сил основных нагрузок. Пространство между коллагеновыми структурами заполнено основным веществом. Поляризационная микроскопия демонстрирует высокую оптическую активность КВ хряща (рис. 7).
Л'ччл )Х Ь(
тивности КВ оболочек жировых ячеек и кол-лагеновой стромы. На сканограммах наблюдаются плотно расположенные и слабоизвилистые пучки КВ тяжей стромы. Морфомет-рическая оценка волокнистых структур стромы ПЖК показала, что плотность КВ межпучковых пространств составила 19,3±2,22%. Ячеистая структура ПЖК придает ей объем, а упругость и эластичность обеспечивает развитая сеть эластиновых волокон. Наличие сети эластиновых волокон подтверждают результаты световой микроскопии окраски ор-сеином по Вейгерту (рис. 9).
Рис. 7. Архитектоника реберного хряща.
Поляризационная микроскопия. Объектив 20. Гомаль 3
Показательными методами исследования реберного хряща (РХ) являются поляризационная и сканирующая электронная микроскопии. Применение гистологических красителей в данном случае нецелесообразно, так как высокое содержание ГАГ в основном веществе РХ не позволяет рассмотреть в препаратах волокнистую структуру коллагенового остова. Морфометрические исследования РХ не проводились в связи с особенностью его структуры. Важным для РХ являются его упруго-прочностные свойства. Проведенные физико-механические исследования на сжатие показали, что предел прочности РХ составил 10,8±0,8 МПа, относительное укорочение -0,26±0,08.
Исследование фиброархитектоники подкожно-жировой клетчатки при помощи световой микроскопии показало ярко выраженную ячеистость структуры данной ткани. Крупные, различной формы жировые дольки диаметром от 30 до 70 мкм окружены колла-геново-эластическими оболочками. Между жировыми ячейками расположены соединительнотканные пластины и коллагеновые тяжи (рис. 8).
Рис. 8. Структура подкожно жировой клетчатки. Окраска по Ван-Гизону. Ув. х60
Данные поляризационной микроскопии свидетельствуют о высокой оптической ак-
Рис. 9. Сеть эластических волокон подкожно-жировой клетчатки. Окраска орсеином. Ув. х400
Данные биомеханических испытаний подкожно-жировой клетчатки (ПЖК) показывают, что при сжатии относительное ее укорочение в среднем составило 1,21±0,01.
Выводы
По нашему мнению, методы исследования структуры КВ при помощи световой микроскопии препаратов, окрашенных по Ван-Гизону, и поляризационной микроскопии неокрашенных срезов являются для всех видов соединительной ткани универсальными, за исключением исследования РХ [10]. Кроме того, для плотной оформленной волокнистой соединительной ткани (на примере сухожилия), также информативными методиками являются морфометрия и биомеханика [6].
В процессе изготовления соединительнотканных трансплантатов (СТТ) необходимо сохранить целостность пучков КВ и избежать увеличения межпучковых пространств, так как в противном случае произойдет разволок-нение ткани и, как следствие, снижение ее биомеханических свойств. Сохранность КВ и их прочностных свойств является необходимым условием для СТТ, применяемых при укрепляющих операциях. Для СТТ, изготовленных из плотной неоформленной волокнистой соединительной ткани (дерма опорных участков стопы), основными показателями являются сохранность фиброархитектоники пучков КВ и содержание ГАГ, а также упру-годеформативных свойств.
Поэтому при изготовлении СТТ из дермы, кроме универсальных методов, необходимо проведение гистохимического анализа и физико-механических испытаний [8]. Для соединительнотканных трансплантатов, изготовленных из фиброзной капсулы почки, важным фактором является степень сохранности волокнистого остова и основного вещества ткани. В связи с этим, кроме результатов световой и поляризационной микроскопии, важными являются данные гистохимического анализа [9]. Соединительнотканные трансплантаты, изготовленные из РХ, применяются в операциях, где трансплантат несет физико-механическую нагрузку, поэтому упруго прочностные свойства в данном случае являются приоритетными [7,8]. Кроме этого, необходимо проведение анали-
за состояния ГАГ и традиционных методов исследования КВ [2].
Трансплантаты, изготовленные из ПЖК, используются при заполнении объемных дефектов различных тканей. В связи с этим при изготовлении СТТ из соединительной ткани со специальными свойствами необходимо сохранить объем, упругость и эластичность, характерные для данной ткани. Наглядными методами исследования ПЖК являются биомеханика, окраска орсеином по Вейгерту, а также классические методы изучения структуры КВ.
Предложенные методы и методики могут быть рекомендованы для комплексной оценки структурных и физико-механических свойств биологических тканей при изготовлении СТТ и дальнейшего их применения в хирургической практике.
Сведения об авторах статьи: Шангина Ольга Ратмировна - д.б.н., профессор, ведущий научный сотрудник, зав. лабораторией консервации тканей, зам. генерального директора ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Минздрава России, профессор кафедры анатомии человека ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450075, г. Уфа, ул. Р. Зорге, 67/1. E-mail: alloolga@mail.ru.
Хасанов Руслан Алмазович - ведущий научный сотрудник лаборатории консервации тканей, кандидат фармацевтических наук ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Минздрава России. Адрес: 450075, г. Уфа, ул. Рихарда Зорге, 67/1. Тел. 8(347)286-00-27. E-mail: khrusall@mail.ru.
Булгакова Людмила Александровна - научный сотрудник лаборатории консервации тканей, кандидат биологических наук ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Минздрава России Адрес: 450075, г. Уфа, ул. Рихарда Зорге, 67/1. Тел.: 8(347)286-00-27. E-mail: mila.bulg@list.ru.
Гайнутдинова Раушания Дамировна - научный сотрудник лаборатории консервации тканей, кандидат биологических наук ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Минздрава России. Адрес:450075, г. Уфа, ул. Рихарда Зорге, 67/1. Тел.: 8(347)286-00-27. E-mail: rushanagai@mail.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. Максимович, М.М. Заготовка аллотрансплантатов для клиник / М.М. Максимович, Н.В. Отцецкая, С.В. Тараненко // Материалы V Всероссийского симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (17-18 мая 2012 г., Уфа). - Уфа, 2012. - С. 39.
2. Идентификация гликозаминогликанов в соединительной ткани при имплантации различных биоматериалов. / Л.А. Мусина [и др.] // Морфологические ведомости. - 2006. - № 1-2 (приложение № 1). - С. 194-196.
3. Морфологическая оценка структурно-модифицированного сухожильного трансплантата для офтальмохирургии / Л.А. Мусина [и др.] // Морфология. - 2010. - Т. 137, №4. - С. 136-137.
4. Мусин, У.К. Реваскуляризация хориоидеи биоматериалом «Аллоплант» при лечении гемофтальма / У.К. Мусин, Р.З. Нурхаки-мов // Материалы V Всероссийского симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (17-18 мая 2012 г., Уфа). - Уфа, 2012. - С. 83-84.
5. Нигматуллин, Р.Т. Очерки трансплантации тканей / Р.Т. Нигматуллин. - Уфа: Ксерокс СТМ, 2003. - 160 с.
6. Нигматуллин, Р.Т. Биомеханические свойства эластинового биоматериала при деформации на сжатие / Р.Т. Нигматуллин, Р.З. Кутушев, Ю.С. Первушин // Морфология. - 2020. - Т. 157, №2-3. - С. 153-154.
7. Сравнительный анализ пластических свойств аллотрансплантатов гиалинового хряща / О.Р. Шангина [и др.] // Морфология. -2019. - Т. 155, № 2. - С. 323.
8. Шангина, О.Р. Упругодеформативные свойства комбинированных аллотрансплантатов для восстановления стенок орбиты / О.Р. Шангина, Л.А. Мусина // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2015. - №12. - С. 300-302.
9. Шангина, О.Р. Морфологическая оценка соединительнотканных аллотрансплантатов для урологических операций / О.Р. Шангина, Л.А. Мусина // Морфология. - 2014. - Т. 145, №3. - С. 218.
10. Шангина, О.Р. Поляризационно-оптический анализ как метод оценки сохранности волокнистого остова аллотрансплантатов / О.Р. Шангина, Л.А. Булгакова // Морфология. - 2018. - Т. 153, №3. - С. 313.
11. Шангина, О.Р. Принципиальные основы технологии изготовления аллогенных биоматериалов / О.Р. Шангина, Р. А. Хасанов // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2020. - Т. 22, №5. - С. 165.
12. Щербаков, Д.А. Восстановление переднелатеральной стенки верхнечелюстного синуса аллогенными биоматериалами / Д.А. Щербаков, А.И. Лебедева, А.И. Каримова // Гены и Клетки. - 2014. - Т. 9, №2. - С. 104-109.
REFERENCES
1. Maksimovich M.M. Otetskaya N.V., Taranenko S.V. Zagotovka allotransplantatov dlya klinik (Preparation of allografts for clinics). Materials of the V All-Russian symposium with international participation «Aktual'nye voprosy tkanevoi i kletochnoi transplantologii» («Topical issues of tissue and cell transplantology»), Ufa. 2012:39 (in Russ.).
2. Musina L.A. [et al.]. Identifikatsiya glikozaminoglikanov v soedinitel'noi tkani pri implantatsii razlichnykh biomaterialov (Identification of glycosaminoglycans in connective tissue during implantation of various biomaterials). Morfologicheskie vedomosti (Morphological newsletter). 2006;(1-2, app. № 1):194-196 (in Russ.).
3. Musina L.A. [et al.]. Morfologicheskaya otsenka strukturno-modifitsirovannogo sukhozhil'nogo transplantata dlya oftal'mokhirurgii (Morphological evaluation of a structurally modified tendon graft for ophthalmic surgery). Morfologiya (Morphology). 2010;137(4):136-137 (in Russ.).
4. Musin U.K., Nurkhakimov R.Z. Revaskulyarizatsiya khorioidei biomaterialom «Alloplant» pri lechenii gemoftal'ma (Revascularization of the choroid with the «Alloplant» biomaterial in the treatment of hemophthalmos). Materials of the V All-Russian symposium with international participation «Aktual'nye voprosy tkanevoi i kletochnoi transplantology» («Topical issues of tissue and cell transplantology»), Ufa. 2012:83-84 (in Russ.).
5. Nigmatullin R.T. Ocherki transplantatsii tkanei (Essays on tissue transplantation). Ufa, Kseroks STM. 2003:160 (in Russ.).
6. Nigmatullin R.T., Kutushev R.Z., Pervushin Yu.S. Biomechanical properties of elastin biomaterial under compression deformation. Morfologiya (Morphology). 2020;157(2-3):153-154 (in Russ.).
7. Shangina O.R. [et al.]. A comparative analysis of the plastic properties of hyaline cartilage allografts. Morfologiya (Morphology). 2019;155(2):323 (in Russ.).
8. Shangina O.R., Musina L.A. Elastic-deformative properties of combined allografts for the restoration of the orbital walls. Vestnik Oren-burgskogo gosudarstvennogo universiteta (Bulletin of the Orenburg State University). 2015;(12):300-302 (in Russ.).
9. Shangina O.R., Musina L.A. Morphological evaluation of connective tissue allotransplants for urological operations. Morfologiya (Morphology). 2014;145(3):218 (in Russ.).
10. Shangina O.R., Bulgakova L.A. Polarization-optical analysis as the evaluation method of the allograft fibrous skeleton preservation. Morfologiya (Morphology). 2018;153(3):313 (in Russ.).
11. Shangina O.R., Khasanov R.A. Printsipial'nye osnovy tekhnologii izgotovleniya allogennykh biomaterialov (Fundamentals of the technology for the manufacture of allogeneic biomaterials). Vestnik transplantologii i iskusstvennyh organov (Russian journal of transplantology and artificial organs). 2020;22(5):165 (in Russ.).
12. Shcherbakov D.A., Lebedeva A.I., Karimova A.I. Replacement of the anterior-lateral wall of the maxillary sinus with allografts. Geny i Kletki (Genes and Cells). 2014;9(2):104-109 (in Russ.).
