CC BY
45
УДК 616.36-002+616-006.324/572.7+612.015
ДИДЕНКО В.И., ОШМЯНСКАЯ Н.Ю., КЛЕНИНА И.А.
ГУ «Институт гастроэнтерологии НАМН Украины», г. Днепропетровск
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРОГРЕССИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА, АССОЦИИРОВАННОГО С ВИРУСОМ С
Резюме. В статье рассматриваются морфологические особенности ткани печени и изменения метаболизма компонентов внеклеточного матрикса в процессе прогрессирования хронического гепатита С. Проведено сравнение данных компьютерной морфометрии гистологических препаратов печени как дополнительного метода объективизации морфологического исследования и неинвазивных маркеров фиброза.
Ключевые слова: хронический вирусный гепатит С, фиброз, компьютерная морфометрия, компьютерный индекс фиброза, неинвазивные маркеры, гиалуроновая кислота, оксипролин.
Хронический вирусный гепатит С (ХГС) остается основной причиной цирроза печени (ЦП) и гепатоцел-люлярной карциномы (ГЦК). На сегодняшний день около 170 млн человек во всем мире инфицированы вирусом гепатита С (HCV). По данным ВОЗ, примерно 350 тыс. смертей в год связаны с HCV-инфекцией [1, 2]. Глобальное распространение, длительное, прогрессирующее, часто тяжелое течение с исходом в цирроз печени и возможное развитие ГЦК определяют актуальность данной проблемы.
Основной путь прогрессирования ХГС — развитие последовательных стадий фиброза с формированием на конечных этапах цирроза и рака печени. Фиброгенез в печени — универсальный процесс в ответ на любое повреждение, в т.ч. и вирусное, для которого характерно чрезмерное отложение экстрацеллюлярного матрикса в результате увеличения синтеза его компонентов и уменьшения скорости их разрушения [2]. К сожалению, клинические проявления заболевания часто возникают при выраженных морфологических изменениях органа, когда происходит истощение адаптационных и компенсаторных механизмов. Поэтому для своевременного назначения терапии, направленной
на уменьшение фиброза, важно раннее его выявление. Оценка степени фиброза также необходима для определения прогноза заболевания, отбора пациентов для специфической терапии и контроля за ее эффективностью [3].
В последнее время стали активно применяться неинвазивные и малоинвазивные методы диагностики фиброза (сывороточные маркеры и их индексы; методы, используемые для оценки изменения эластичности печени: магнитно-резонансная эластография, ультразвуковая эластография, эластометрия; определение скорости кровотока в портальной системе; дыхательные тесты). Однако следует отметить достаточно низкую достоверность этих методов при умеренном фиброзе (F1-2) и сложность в разграничении его ранних стадий [4, 5]. Если результаты значений нескольких тестов у конкретного больного различаются, то сделать выводы о стадии фиброза крайне сложно — для уточнения требуется биопсия печени. Результаты малоинвазив-
© Диденко В.И., Ошмянская Н.Ю., Кленина И.А., 2014 © «Гастроэнтерология», 2014 © Заславский А.Ю., 2014
№ 2 (52) • 2014
www.gastro.org.ua
37
Патологія печінки і жовчовивідної системи / Pathology of Liver and Biliary Excretion System
ных тестов должны интерпретироваться в сочетании с другими лабораторно-инструментальными методами подтверждения диагноза у каждого конкретного пациента [6].
К одному из малоинвазивных прогностических маркеров фиброза печени относится оксипролин (ОП). ОП — одна из основных аминокислот коллагена, позволяющая считать его маркером, который отображает катаболизм этого белка. Более 20 % оксипролинсодержащих пептидов, высвобождающихся из коллагеновых молекул, экскретируют-ся с мочой, а 80 % — метаболизируются в печени. В свободном состоянии находится только 1 % ОП, поэтому повышение уровня белковосвязанного ок-сипролина (ОПб/св) может свидетельствовать о нарушении синтеза коллагена [9]. Как результат процесса фиброгенеза следует рассматривать повышение концентрации гиалуроновой кислоты (ГК), которая продуцируется фибробластами и другими специализированными клетками соединительной ткани, играет структурную роль в соединительнотканном матриксе (протеогликан) и принимает участие в разных межклеточных взаимодействиях. Уровень ГК повышается при снижении функции ее удаления печенью и/или из-за повышения ее продукции в период воспаления (стимуляции) печени. Следует отметить, что при фиброзе печени происходит усиление распада углеводно-белковых компонентов соединительной ткани — гексозаминов (ГА), повышение их содержания свидетельствует об активности воспалительного процесса, длительность которого приводит к деструкции тканей печени [7]. Определение содержания сывороточных маркеров фиброза необходимо для дифференциальной диагностики цирроза/не цирроза печени, оценки степени фиброза печени, мониторинга функции данного органа в процессе лекарственной терапии [8].
На сегодняшний день золотым стандартом в диагностике фиброза печени остается гистологическое исследование биоптатов. Результаты исследования позволяют определить степень активности и стадию фиброза, выявить ЦП, ГЦК, оценить результаты терапии при повторном исследовании [9, 10]. Оптимальным способом получения биоптата печени является чрескожная пункционная трепан-биопсия печени (ЧПТБП) под непрерывным ультразвуковым контролем с последующим гистологическим анализом материала по одной из принятых систем (Knodell, Ishak, Metavir) [3, 9].
Компьютерная морфометрия гистологических препаратов используется как дополнительный метод объективизации морфологического исследования. Компьютерный индекс фиброза (КИФ) — это полученное на цифровом изображении соотношение площади коллагена к общей площади биоптата [11]. Структурный коллаген (например, в стенке сосудов и подкапсулярных областях, которые не связаны с развитием фиброза) не учитывается при расчетах. У пациентов с ХГС-инфекцией КИФ может служить
предиктором клинической декомпенсации [12]. Поскольку фиброзирование печени влияет на внутрипеченочное сосудистое сопротивление и развитие портальной гипертензии, была доказана корреляционная взаимосвязь между КИФ и портальным градиентом давления [13].
Таким образом, количественная оценка фиброза при исследовании биоптатов печени, полученных методом трепан-биопсии, является перспективной в качестве прогностического маркера, средства для оценки эффективности антифибротической терапии и подтверждения достоверности неинвазивных и малоинвазивных маркеров фиброза.
Цель исследования: изучить морфофункциональные и биохимические особенности, характеризующие развитие и прогрессирование фиброза печени у больных хроническим гепатитом, ассоциированным с вирусом С.
Материал и методы
Обследовано 19 пациентов с ХГС обоих полов — 47,4 % мужчин, 52,6 % женщин, средний возраст (54,7 ± 3,7) года, которые проходили лечение в отделении заболеваний печени и поджелудочной железы ГУ «Институт гастроэнтерологии НАМН Украины». Всем пациентам выполнено УЗИ органов брюшной полости, проведены стандартные биохимические, серологические и вирусологические исследования. Выполнено 19 ЧПТБП, одновременно у каждого пациента были взяты 3 биоптата из различных зон печени (VII сегмент). ЧПТБП выполняли под непрерывным УЗ-контролем, под местной анестезией полуавтоматической иглой Colt Shot 16 G. После вмешательства осуществлялся динамический УЗ-контроль в течение 48 часов.
Для гистологических исследований биоптаты фиксировали в 10,0% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали парафином. Гистологические срезы толщиной 3—5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и по Маллори в мод. Слинченко. Для целей компьютерной морфометрии биоптаты фотографировали и осуществляли измерения с помощью программы Image Pro Plus version 3.0.00.00. Оценку степени активности процесса и стадии фиброза проводили по шкале Metavir.
Изучали диагностическую значимость сывороточных маркеров фиброза у больных ХГС путем оценки содержания ОП свободного (ОПсв) и ОПб/св [14], ГК [15] и ГА [16], контрольную группу составили 20 относительно здоровых людей. Статистическая обработка результатов исследования производилась методами вариационной статистики, реализованными стандартным пакетом прикладных программ Statistica for Windows 6.0.
Результаты и обсуждение
У большинства больных были выявлены гепатит с умеренной активностью (42,11 %) и единичные полные либо неполные фиброзные септы (31,58 %)
38
Гастроентерологія, ISSN 2308-2097
№ 2 (52) • 2014
Патологія печінки і жовчовивідної системи / Pathology of Liver and Biliary Excretion System
Рисунок 1 — Оценка активности процесса и стадии фиброза по шкале Metavir
(рис. 1). Умеренная или выраженная воспалительная инфильтрация портальных трактов и перипортальной зоны была наиболее часто встречающимся признаком, наблюдалась в 84,2 % всех случаев, у 36,8 % больных обнаружены внутридольковые лимфоцитарные инфильтраты без некроза гепатоцитов, а у 15,8 % — сформировавшиеся лимфоидные фолликулы. При этом все случаи обнаружения лимфоидных фолликулов относились к поздним стадиям развития заболевания.
При многофакторном корреляционном анализе изучаемых показателей было зафиксировано наличие взаимосвязи между выраженностью инфильтрации портальных трактов, стадией фиброза (г = 0,53,
p < 0,019) и КИФ (г = 0,58, p < 0,008). В большинстве случаев (88,345 %) отмечалась белковая дистрофия различной степени выраженности, затрагивающая регионы от нескольких клеток до обширных сливных полей. Прогрессирование процесса вплоть до развития баллонной дистрофии отмечалось у 11,76 %. Жировая дистрофия, в том числе и фокальный крупнокапельный стеатоз, наблюдалась в 31,59 % всех случаев. Феномен краевого стояния лимфоцитов в синусоидах встречался у 47,4 % всех больных, в основном на начальных стадиях развития фиброза, что позволяет отнести его к одному из ранних признаков прогрессирования заболевания, что подтверждается выявленной слабой обратной связью между КИФ и частотой встречаемости данного признака (г = —0,45, p < 0,05) (рис. 2).
На ранних стадиях фиброза соединительная ткань представляла собой перипортальные узлы более плотной структуры. Расходящиеся от них тонкие лучи рыхлого фиброза проникали между гепатоцитами, часть из которых находилась в состоянии атрофии. На более поздних стадиях встречаются нежные перфорированные и более плотные полные и неполные септы, изолированные в паренхиме толстые фиброзные волокна, остатки вен и портальных трактов с пролапсом гепатоцитов и аберрантные паренхиматозные вены (рис. 3).
100
90
50
40
30
20
10
і к
го
■fcr ьг: о
S
а:
і оГ
О I О. ф
-8-
о
о.
н
о
ск
ск
-8- S
о о О- о.
ск
го
-8- !
О _1_
£- g
у 5
г5- го
ч. ю
— •— >s
-О ГО -s I Q-.pS
£ 5*8
Р і 5, sf
:■&<»
^ го >5
_0 Q_ _Q X t- I J3 -D I
Ц ®
ГО S
O.'Q" to о і Щ-
Рисунок 2 — Качественная морфологическая оценка биоптатов печени у больных ВГС
0
Рисунок 3 — Стадии фиброза по шкале Metavir. Окраска по Маллори в мод. Слинченко. Ув. х 40
№ 2 (52) • 2014
www.gastro.org.ua
39
Патологія печінки і жовчовивідної системи / Pathology of Liver and Biliary Excretion System
Таблица 1 — Количественная оценка стадии фиброза и апоптоза у больныхХГС
Показатель 1-я степень (n = 5) 2-я степень (n = 6) 3-я степень (n = 3) 4-я степень (n = 5)
M m M m M m M m
Компьютерный индекс фиброза 0,049 0,011 0,068 0,021 0,199 0,002 0,273 0,035
Апоптоз (количество клеток в 5 последовательных полях зрения) 3,8 2,009 5,7 0,615 4,3 0,918 2,0 0,836
Таблица 2 — Биохимические показатели сыворотки крови пациентов с ХГС
Биохимический показатель Контрольный показатель (n = 20) ХГС (n = 19)
М ± m М ± m
ОПсв, мкмоль/л 10,9 ± 2,1 5,09 ± 0,48**
ОПб/св, мкмоль/л 136,04 ± 4,30 151,73 ± 5,94*
ГК, г/л 0,76 ± 0,12 1,24 ± 0,20*
ГА, ммоль/л 5,61 ± 0,22 4,58 ± 0,25**
Примечания: * — р < 0,05; ** — р < 0,01; достоверность изменений между показателями пациентов с ХГС по сравнению с контрольной группой.
Анализ КИФ в сравнении с полуколичественной оценкой подтвердил наличие сильной корреляционной связи между КИФ и стадией фиброза по шкале Metavir (г = 0,89, p < 0,002). Также выявлена взаимосвязь между КИФ и инфильтрацией портальных трактов (r = 0,58, p < 0,008), КИФ и степенью активности гепатита (r = 0,59, p < 0,007).
Гепатоциты в состоянии апоптоза (конденсация хроматина, эозинофильная дегенерация) и апопто-тические тельца располагались рассеянно по всей поверхности дольки и группами поблизости от фиброзной ткани. Однако не выявлено достоверной взаимосвязи между количественной оценкой апоптоза и другими морфологическими показателями, что может говорить об относительной независимости процессов апоптоза от структурных изменений печени.
В норме процесс фиброгенеза уравновешивается процессами фибринолиза, то есть удаления избытка компонентов внеклеточного матрикса при помощи протеолитических ферментов. При ХГС наблюдается смещение этого равновесия, возникает нарушение баланса между процессами синтеза и распада компонентов внеклеточного матрикса с преобладанием процессов фиброгенеза, которые постепенно приводят к конечной стадии фиброза печени — циррозу. Анализ содержания сывороточных маркеров фиброза у больных с ХГС выявил достоверное повышение содержания ОПб/св на 12 %, до (151,73 ± 5,94) мкмоль/л (p < 0,05), по сравнению с контрольной группой, что свидетельствовало о повышении активности процессов синтеза соединительной ткани (табл. 2).
Выявлено снижение содержания в сыворотке крови ОПсв (маркера распада коллагена) на 53,3 %, до
(5,09 ± 0,48) мкмоль/л (p < 0,01), с параллельным повышением содержания ГК у 65,6 % пациентов на 63,2 %, до (1,24 ± 0,20) г/л, (p < 0,05). Была выявлена высокая корреляционная взаимосвязь (r = 0,78, p < 0,05) между КИФ и уровнем ГК сыворотки крови. Снижение содержания ГА у 42,0 % больных на 18,3 %, до (4,58 ± 0,25) ммоль/л (p < 0,01), свидетельствовало о преобладании процессов фиброза над процессами воспаления, что подтверждалось корреляционной взаимосвязью ОПсв/ ГА (r = 0,71, p < 0,05).
Выводы
1. Морфологической особенностью прогрессирования ХГС являются выраженная плотная лимфо-плазмоцитарная инфильтрация портальных трактов и перипортальной области, внутридольковые лимфоцитарные инфильтраты и формирование лимфоидных фолликулов, а также трансформация мелкокапельной жировой дистрофии в фокусы крупнокапельного сте-атоза.
2. Показатель КИФ коррелирует со стадией фиброза (r = 0,89, p < 0,002) и более полно описывает тяжесть фибротических изменений, в связи с чем его использование позволяет повысить точность исследования.
3. У пациентов с ХГС выявлены изменения метаболизма компонентов внеклеточного матрикса, что проявлялось в увеличении синтеза коллагена и снижении его распада. Параллельное снижение содержания ОПсв и ГА, повышенное содержание ГК у пациентов с ХГС свидетельствовали об активности процесса фиброза, что согласовывалось с данными при использовании показателя КИФ.
Список литературы
1. Epidemiological Pattern of Hepatitis B and Hepatitis C as Etiological Agents for Hepatocellular Carcinoma in Iran and Worldwide [Electronic resource] / A. Zidan [at al.] // Hepatitis Monthly. — 2012. — Mode of access: http://hepatmon. com/?page = article&article id = 9172. — Date of access: 24.10.2012.
2. Stephen L. C. The Natural History of Hepatitis C Virus (HCV) Infection / S.L. Chen, T.R. Morgan // International Journal of Medical Sciences. — 2006. — Vol. 3, № 2. — Р. 47-52.
3. Зубов А.Д. Диагностическое значение пункционной биопсии печени при хроническом вирусном гепатите С [Электронный ресурс] / А.Д. Зубов // Новости медицины и фармации. — 2009. — Режим доступа: http://www.mif-ua. com/archive/article/8444. — Дата доступа: 10.05.2009.
40
Гастроентерологія, ISSN 2308-2097
№ 2 (52) • 2014
Патологія печінки і жовчовивідної системи / Pathology of Liver and Biliary Excretion System
4. Pai N.P. Rapid hepatitis C tests: better than the gold standard? / N.P. Pai, K. Sollis, R.W. Peeling // Expert Review of Molecular Diagnostics. — 2013. — Vol. 13, № 3. — P. 221-223.
5. A new index for non-invasive assessment of liver fibrosis /
N. Ichino [at al.]// World Jornal of Gastroenterology. — 2012. — Vol. 16, № 38. — P. 4809-4816.
6. Неінвазивні методи діагностики фіброзу печінки / Є.С. Сірчак та ін. // Український журнал хірургії. — 2012. — № 1 (16). — С. 76-83.
7. Енюков И.С. Методи, алгоритми, програми багатомір-ного статистичного аналізу/И.С. Енюков. — М.: Фінанси і статистика, 1986. — 86 с.
8. Викел П. Статистика / П. Викел, Д. Доскман. — М., 1983. — 42 с.
9. Trifan A. Checkmate to liver biopsy in chronic hepatitis C? / A. Trifan, C. Stanciu // World Jornal of Gastroenterology. — 2012. — Vol. 18, № 39. — P. 5514-5520.
10. Correlation between fibroscan, liver biopsy, and clinical liver function in patients with hepatitis C virus infection after renal transplantation / Munoz R. [at al.] // Transplantation Proceedings. — 2009. — Vol. 41, № 6. — P. 2425-2426.
Діденко В.І., Ошмянська Н.Ю., Кленіна І.А.
ДУ «Інститут гастроентерології НАМН України», м. Дніпропетровськ
МОРФОЛОГІЧНА Й БІОХІМІЧНА ОЦІНКА ПРОГРЕСУВАННЯ ХРОНІЧНОГО ГЕПАТИТУ, АСОЦІЙОВАНОГО З ВІРУСОМ С
Резюме. У статті розглядаються морфологічні особливості тканини печінки й зміни метаболізму компонентів позаклітинного матриксу в процесі прогресування хронічного гепатиту С. Проведене порівняння даних комп’ютерної морфометрії гістологічних препаратів печінки як додаткового методу об’єктивізації морфологічного дослідження й неінвазивних маркерів фіброзу.
Ключові слова: хронічний вірусний гепатит С, фіброз, комп’ютерна морфометрія, комп’ютерний індекс фіброзу, не-інвазивні маркери, гіалуронова кислота, оксипролін.
11. Bedossa P. Sampling variability of liver fibrosis in chronic hepatitis C/ P. Bedossa, D. Dargere, V. Paradis// Hepatology. — 2003. — 38 (6). — 1449-1457.
12. The Laennec grading system for assessment of hepatic fibrosis: validation by correlation with wedged hepatic vein pressure and clinical features/R. Kutami, N. Girgrah, I. Wanless [et al.]/ Hepatology. — 2000. — 32. — 407A.
13. Histological-hemodynamic correlation in cirrhosis-a histological classification of the severity of cirrhosis/ S. Nagula, D. Jain, R.J. Groszmann, G. Garcia-Tsao // J. Hepatol. — 2006. — 44 (1). — 111-117.
14. Осадчук М.А. Белковосвязанный оксипролин плазмы крови при остром вирусном гепатите/М.А. Осадчук, В.М. Капустин //Лабораторное дело. — 1987. — № 7. — С. 16-18.
15. Gold E.W. The quantitative spectrophotometric estimation of totalsulfatedglycosaminoglican levels/E.W. Gold//Biochemi-ca et Biophysica Acta. — 1981. — Vol. 673. — P. 408-415.
16. Горячковський О.М. Клінічна біохімія: Довідковий посібник / О.М. Горячковський. — 2-е вид., вип. і доп. — Одеса: Астропринт, 1998. — 608 с.
Получено 23.05.14 ■
Didenko V.I., Oshmyanskaya N.Yu., Klenina I.A.
State Institution «Institute of Gastroenterology of National Academy of Medical Sciences of Ukraine», Dnipropetrovsk, Ukraine
MORPHOLOGICAL AND BIOCHEMICAL EVALUATION OF PROGRESSION OF CHRONIC HEPATITIS ASSOCIATED WITH C VIRUS
Summary. The article deals with the morphological features of the liver tissue and changes in the metabolism of extracellular matrix components during progression of chronic hepatitis C. There has been carried out the comparison of computer morphometry of histological liver samples as an additional method of objectification of morphological study and and non-invasive markers of fibrosis.
Key words: chronic viral hepatitis C, fibrosis, computer morphometry, computer index of fibrosis, non-invasive markers, hyaluronic acid, hydroxyproline.
№ 2 (52) • 2014
www.gastro.org.ua
41
