CC BY
46
УДК 619:616-092:636.52/58
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТИМУСА ПТИЦ ПРИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЯХ
Е.Г. ТУРИЦЫНА ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» г. Красноярск, Российская Федерация
(Поступила в редакцию 18.01.2010)
Введение. В период адаптации к интенсивным технологиям в условиях промышленных птицеводческих предприятий птица испытывает многочисленные воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, которые приводят к развитию экстремальных состояний организма. Среди этих факторов особое место занимают нарушения технологических процессов и зоогигиенических параметров содержания [1], несбалансированное по питательным веществам, витаминам, микроэлементам кормление [2], зараженность кормов микроорганизмами, продуцентами токсинов [3,4].
Известно, что при стрессовых состояниях происходят значительные изменения в работе иммунной системы [5]. У птиц, особенно в период интенсивного роста, функциональные нарушения иммунной системы проявляются повышенной смертностью, неравномерными приростами, снижением массы тела и возросшим потреблением корма. Такая птица проявляет пролонгированную поствакцинальную реакцию и предрасположена к инфекционным заболеваниям, обусловленным не одним возбудителем, а являющимся следствием параллельного инфицирования птиц несколькими болезнетворными агентами, такими, как мико-плазма, кишечная палочка, пневмовирусы [6].
Влияние различных экстремальных факторов на структуру иммунных органов птиц на ранних этапах онтогенеза представляет особый теоретический и практический интерес, поскольку именно в этом периоде жизни иммунная система не достигла уровня функционирования взрослой птицы и наиболее чувствительна к патогенам. Наиболее полно состояние иммунного статуса организма в раннем постнатальном возрасте, по мнению Т.Е. Ивановской и других [7], отражает структура тимуса, являющегося филогенетически самым древним органом иммунной системы.
Цель работы - установить параметры морфологической диагностики состояния тимуса птиц при экстремальных состояниях, обусловленных инфекционными и неинфекционными факторами.
Материал и методика исследований. Материалом для морфологических исследований служил тимус цыплят первых трех месяцев жизни различных яичных кроссов (белый леггорн, родонит-2, хайсекс уайт и хайсекс браун) при экстремальных состояниях, вызванных нарушениями режимов инкубации, транспортными и температурными стрессами, многократными антигенными стимуляциями, алиментарным истощением, инфекционными заболеваниями (колисептицемией, респираторным микоплазмозом), неинфекционной патологией органов
пищеварения и дыхания. Материал взят от выбракованной вынужденно убитой и павшей птицы, всего 104 головы. При исследованиях использован как спонтанный, так и экспериментальный материал. Контролем служил тимус клинически здоровой птицы аналогичного возраста.
Для суждения о структурно-функциональном состоянии тимуса анализировали данные морфометрических, гистологических и гистохимических исследований. Морфометрические исследования включали определение абсолютной и относительной массы органа, его весовой индекс, соотношение площади коркового и мозгового вещества (индекс коры); плотность лимфоцитов в условном поле зрения коркового и мозгового вещества; количество митозов в субкапсулярной зоне коры на 1000 зарегистрированных клеток (митотический индекс); количество и размеры телец Гассаля в мозговом веществе.
Гистологические исследования проводили по общепринятым методикам, готовые парафиновые срезы окрашивали гематоксилином Эр-лиха и эозином, соединительную ткань исследовали по методу Малло-ри и Ван-Гизону, ретикулиновые волокна - по Футу [8]. Для гистохимического анализа полисахаридных соединений применяли ШИК-реакцию и комбинированную окраску по Моури. ДНК и РНК в клетках выявляли смесью метилового зеленого и пиронина в по Браше [9].
Морфометрические исследования проводили с помощью окуляр-микрометра МОВ-1-15х и окулярной сетки Г.Г. Автандилова. Достоверность обнаруженных морфометрических отличий оценивали с использованием ^критерия Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение. Технологические нарушения на птицефабриках можно зарегистрировать на всех этапах производственного цикла, начиная с цехов инкубации. Так, при неравномерном выводе, причинами которого явились нарушения параметров инкубации, часть вылупившихся цыплят подверглась передержке в выводных шкафах, что привело к мощному температурному стрессу в условиях дефицита воздуха и, как следствие, высокой смертности новорожденной птицы и неоднородности цыплят по живой массе. При вскрытии павших цыплят наблюдали признаки эмбрионального недоразвития: объемный нерассосавшийся желток в грудобрюшной полости, незарастание пупочного отверстия.
Целенаправленное исследование тимуса новорожденной птицы не выявило врожденной аплазии тимуса. Однако у 65% выбракованных цыплят с пониженной массой тела наблюдали гипоплазию органа, соответствующую задержке его морфогенеза в период инкубации. Индекс тимуса опускался до 0,97±0,2 при средних показателях 3,61±0,32 у здорового молодняка.
Морфологически гипоплазированный тимус характеризовался неровными фестончатыми контурами долек, рыхлым заполнением лимфоцитами коркового вещества, широкой субкапсулярной зоной с хорошо заметными ядрами эпителиальных клеток, единичными и мелкими тельцами Гассаля. Тем не менее, при иммунизации цыплят-гипотрофиков была установлена способность тимуса в той или иной степени реагировать на антигенные стимуляции. Более того, в зависи-
мости от степени врожденной гипоплазии дефекты тимуса при благоприятных условиях с возрастом исчезали.
Транспортным и, особенно, температурным стрессам подвергались новорожденные цыплята при перемещении из инкубатория в цеха выращивания, особенно в холодное время года. Развитие экстремального состояния связано с неспособностью цыплят первых дней жизни к самостоятельному поддержанию постоянной температуры тела и с проблемой равномерного прогрева помещений до оптимальной температуры 32оС на всех уровнях клеточных батарей.
Тимус реагировал на транспортный и низкотемпературный стресс уменьшением абсолютной массы, весового индекса и развитием акци-дентальной инволюции, степень которой находилась в прямой зависимости от силы и продолжительности действия экстремального фактора. При кратковременных стрессовых воздействиях (0,5-4 ч) в органе регистрировалась вторая стадия инволюции, при длительной транспортировке или нахождении в плохо прогретом цехе от 8 до 12 ч развивалась третья стадия инволюции в соответствии с классификацией Т.Е. Ивановской [7].
Морфологически вторая стадия акцидентальной инволюции характеризовалась сокращением коркового вещества и расширением мозговой зоны. Индекс коры уменьшался на 16-20%, снижалась пролифера-тивная активность клеток субкапсулярной зоны, что проявлялось падением митотического индекса на 4-6% по сравнению с интактной птицей. Корковая зона была неравномерно заполнена клетками - участки умеренного опустошения чередовались с мелкими очаговыми скоплениями лимфоцитов. Плотность лимфоцитов в мозговом веществе сокращалась, становились хорошо заметными скопления эпителиальных клеток. В области кортико-медуллярной границы возрастало число макрофагов и гранулоцитов. Количество мелких телец Гассаля увеличивалось в 1,6 раза по сравнению с исходным состоянием (Р<0,05). Абсолютная масса органа и весовой индекс опускались до нижних границ физиологической нормы, характерной для данного возраста.
Третья фаза инволюции характеризовалась снижением весового индекса тимуса до 1,5-2,0 вместо 3,5-5,5 у интактной птицы аналогичного возраста. Отмечалось значительное истончение коркового вещества, либо его полное исчезновение в отдельных участках. Индекс коры снижался в 2,2 раза по сравнению с показателями интактной птицы, митотический индекс сокращался в 2,5 раза. Помимо снижения уровня пролиферации лимфоцитов субкапсулярного слоя возрастала гибель кортикальных лимфоцитов, которая сопровождалась интенсивным притоком макрофагов и гранулоцитов, обеспечивающих фагоцитоз погибших клеток. По мнению ряда авторов [10, 11], интенсивный приток фагоцитов связан с отчетливо выраженным апоптозом Т-лимфоцитов, возникающим под действием кортикостероидов, высокий уровень которых характерен для стрессового состояния.
199
Опустошение органа лимфоцитами сопровождалось активизацией эпителия долек. Эпителиальные клетки формировали в мозговой зоне обширные поля, имели объемную пенистого вида цитоплазму с вакуолями и мелкой пылевидной ШИК-положительной зернистостью. В местах скоплений эпителиальных клеток появлялись мелкие кистопо-добные структуры с секретом, дающим положительную реакцию на кислые мукополисахариды.
Количество телец Гассаля возрастало более чем в два раза по сравнению с исходным состоянием. Изредка находили тельца в состоянии гиалиноза или кератинизации. Коллагеновые волокна междольковой соединительной ткани утолщались и обильно инфильтрировались гра-нулоцитами. Опустошение тимуса лимфоцитами сопровождалось снижением его абсолютной и относительной массы в 1,5-2,0 раза.
Выраженные изменения гистоархитектоники тимуса были обнаружены при экспериментальном белковом голодании длительностью около трех недель, катарально-геморрагическом воспалении желудочно-кишечного тракта и патологических процессах органов дыхания. Морфологические изменения соответствовали третьей или четвертой стадиям акцидентальной инволюции. При четвертой стадии инволюции весовой индекс тимуса опускался до 1,0-1,5 ед.
Характерным морфологическим признаком четвертой стадии инволюции являлась инверсия слоев, при которой на фоне значительного опустошения органа клетками плотность лимфоцитов в мозговой зоне была в 1,8 раза больше, чем в корковом веществе (Р<0,01). Значительная масса лимфоцитов имела мелкие оптически плотные ядра. Пролиферация лимфоцитов не наблюдалась, о чем свидетельствовало отсутствие фигур митозов в субкапсулярной зоне. Эпителиальные клетки подвергались дистрофическому распаду, на месте их скопления формировались кистоподобные полости с клеточным детритом внутри. Практически исчезал субстрат, дающий положительную реакцию на кислые мукополисахариды, ШИК-позитивный материал в цитоплазме эпителиальных клеток не был обнаружен. Тельца Гассаля единичные и мелкие.
Самые глубокие нарушения структуры тимуса были зафиксированы при подострой и хронической формах колисептицемии, респираторном микоплазмозе или ассоциативном течении обеих инфекций. Они характеризовались развитием четвертой, но чаще пятой стадии акцидентальной инволюции, которая проявлялась полной атрофией тимуса. Он приобретал вид двух соединительнотканных тяжей с мелкими плоскими едва заметными дольками, лежащими вдоль трахеи. Деление долек на корковую и мозговую зоны отсутствовало. Лимфоциты с плотными мелкими ядрами формировали единичные очаговые скопления. Тельца Гассаля редкие, часто в состоянии обызвествления. В дольках разрастались аргирофильные волокна, что являлось признаком их коллапса. Соединительнотканная капсула была утолщена. Кол-лагеновые волокна междольковых прослоек грубые, сильно извитой формы.
Механизм развития акцидентальной инволюции тимуса у птиц при действии различных факторов до сих пор окончательно не изучен. Од-
нако имеются многочисленные сообщения об исследовании патогенеза инволюции тимуса у лабораторных животных (мышей и крыс). Так, было установлено, что при хроническом стрессе имеет место уменьшение числа предшественников Т-лимфоцитов в красном костном мозге и снижение уровня их хемоаттрактантов в тимусе [11], что способствует гипоплазии тимуса. Еще одним механизмом акцидентальной инволюции считается усиление миграции тимоцитов из тимуса в кровь и периферические иммунные органы [12]. Иммуногистохимические методы исследования позволили установить [13], что при хроническом стрессе не наблюдается увеличение числа ранних тимусных иммигрантов (ТЫ.1+ клеток) в периферические иммунные органы, более того, наблюдается уменьшение содержания этой фракции Т-лимфоцитов по сравнению с возрастным контролем. М.Ю. Капитоновой и другими [14] было показано, что на ранних этапах постнатально-го онтогенеза основными механизмами инволюции тимуса при хроническом стрессе являются избыточная гибель двойных позитивных Т-лимфоцитов и угнетение пролиферации корковых тимоцитов.
Морфологическая реакция тимуса на антигенные стимуляции принципиально отличалась от структурных сдвигов, возникающих при стрессовых состояниях, белковом голодании и продолжительных бактериальных инфекциях. Антигенные стимуляции птицы вирусвакци-нами вели к увеличению абсолютной и относительной массы иммунных органов. В течение первых суток после иммунизации суточных цыплят против болезни Марека абсолютная масса тимуса возрастала на 5-6%, относительная - на 6-15% по сравнению с исходным состоянием. При одновременной стимуляции суточной птицы несколькими антигенами разница достигала 20%.
Увеличение абсолютной массы тимуса, прежде всего, было обусловлено пролиферацией лимфоцитов субкапсулярного слоя долек, о чем свидетельствовал рост митотического индекса почти в 4,7 раза, расширение корковой зоны и увеличение индекса коры на 55% по сравнению с тимусом здоровой невакцинированной птицы аналогичного возраста (Р<0,01). Плотность лимфоцитов в условном поле зрения коры возрастала на 5%, в мозговом веществе - на 13%. Нарастала пи-ронинофилия субкапсулярной зоны. Появлялись очаговые разрежения лимфоцитов коры, напоминающие картину «звездного неба». Усиливалась секреция кислых мукополисахаридов в местах скопления эпителиальных клеток мозгового вещества. Пролиферативные процессы сопровождались полнокровием органа, отечностью и разрыхлением междольковой соединительной ткани, активизацией эндотелия мелких сосудов.
Кратковременная гиперплазия тимуса, развивающаяся в ответ на введение любых живых вирусвакцин, характерна для первой стадии акцидентальной инволюции. Развитие первой фазы инволюции тимуса возможно не только при иммунизации живыми вакцинами, но и в первые часы после заражения патогенными возбудителями, однако зафиксировать продромальный период инфекционного процесса у птицы в производственных условиях не удалось.
При длительных интервалах между иммунизациями (12-14 дней и более) кратковременная гиперплазия тимуса сменялась опустошением органа лимфоцитами, характерным для второй или третьей стадии ак-цидентальной инволюции, что, возможно, связано с иммуносупрес-сивными эффектами самих вакцинных вирусов, в том числе вирусвак-цин против болезни Марека, ньюкаслской и инфекционной бурсальной болезни.
Сокращение интервалов между вакцинациями и ревакцинациями до 2-5 суток, обусловленное необходимостью проведения многократных плановых иммунизаций в ограниченный период выращивания молодняка птицы, вело к развитию в тимусе лимфофолликулярной гиперплазии, характеризующейся появлением в дольках лимфоидных олликулов, которые в нормальной железе не встречаются. Лимфо-олликулярная гиперплазия тимуса, по мнению ряда авторов [7,10, 15], является результатом аутоиммунных и аллергических реакций организма и сопровождается снижением функциональной активности железы за счет сокращения зрелых форм Т-лимфоцитов и изменения секреции биологически активных веществ.
Первое появление фолликулов без центров просветления, локализующихся в области коркового вещества, было зафиксировано у 60-дневных цыплят. В тимусе 95-дневной птицы были обнаружены единичные лимфоидные фолликулы со светлыми центрами, расположенные в области кортико-медуллярной границы долек. По завершении программ вакцинаций, включающих до 14-16 антигенных стимуляций, в тимусе 110-120-дневной птицы помимо выявления лимфоидных фолликулов обнаружено повсеместное плазматическое пропитывание стенок мелких кровеносных сосудов, возникающее, возможно, под действием циркулирующих иммунных комплексов, способных фиксироваться на органах и тканях.
Заключение. Результаты проведенных исследований позволяют утверждать, что экстремальные состояния организма птиц сопровождаются изменением структуры тимуса. Характер морфологических изменений разнообразен и зависит от вида этиологического фактора. При нарушениях режимов инкубации учащаются случаи врожденного недоразвития, т.е. гипоплазии тимуса. При транспортных и низкотемпературных стрессах, белковом голодании, патологических процессах органов пищеварения и дыхания, бактериальных инфекциях развивается акцидентальная инволюция, степень развития которой находится в прямой зависимости от силы экстремального фактора и продолжительности его воздействия. Многократные иммунизации молодняка птицы приводят к развитию лимфофолликулярной гиперплазии тимуса.
Большинство морфологических сдвигов в тимусе носит обратимый характер, однако чем глубже структурные изменения, тем больше времени требуется на восстановление органа, что способствует резкому ослаблению его функциональных возможностей и потенцирует риск развития приобретенного иммунодефицита.
Комплексная диагностика состояния иммунной системы птиц, включая морфологическую оценку, позволяет специалистам своевременно принимать адекватные меры по коррекции и восстановлению функциональной деятельности иммунной системы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мезенцев, С.В. Факторы, снижающие иммунную стабильность организма птицы и меры борьбы с ними / С.В. Мезенцев // БИО. 2002. С.4-7.
2. Лагуткин, Н. А. Иммунные ответы птиц на кормление / Н.А. Лагуткин // Животноводство России. 2003. № 8. С.30-33.
3. Рождественская, Т.Н. Микоплазмозы птицы: особенности эпизоотологии, диагностики и профилактики / Т.Н. Рождественская, А.Н. Борисенкова, С.В. Панкратов // Сельскохозяйственные животные. 2006. N° 3. С. 38-40.
4. Biro, K. Tissue distribution of ochratoxine A as determined by HPLC and ELISA and histopathopogical effects in chickens / K. Biro [et al.] // Avian Pathol. 2002. Vol. 31. №. 2. P.141-148.
5. Сапин, М.Р. Иммунная система, стресс и иммунодефицит / М.Р. Сапин, Д.Б. Никитюк. М.: Джангар,2000. 184 с.
6. Монтиэль, Э. Значение иммунной системы для промышленного птицеводства / Э. Монтиэль // БИО. 2003. С. 2-5.
7. Ивановская, Т.Е. Патология тимуса у детей / Т.Е. Ивановская [и др.]. СПб.: СОТИС, 1996. 270 с.
8. Автандилов, Г.Г. Основы патологоанатомической практики / Г.Г. Автанди-лов. М.: РМАПО, 1994. С. 372-407.
9. Кононский, А.И. Гистохимия / А.И. Кононский. Киев: Выща шк., 1976. С. 87-88.
10. Харченко, В.П. Болезни вилочковой железы / В.П. Харченко [и др.]. М.: Триада, 1998. 232 c.
11. Domínguez-Gerpe, L. Evolution of the thymus size in response to physiological and random events throughout life / L. Domínguez-Gerpe, M. Rey-Méndez // Microsc. Res. Tech., 2003. Vol. 62. № 6. Р. 464-476.
12. Padgett, D.A. How stress influences the immune response / D.A. Padgett, R. Glaser // Trends Immunol., 2003. Vol. 24. №8. P.444-448.
13. Капитонова, М.Ю. Динамика Thy-1 лимфоцитов в иммунных органах растущего организма при хроническом стрессе / М. Ю. Капитонова [и др.] // Int. J. Immunorehabilitation, 2003. Vol. 5. № 2. P.147-148.
14. Капитонова, М. Ю. Акцидентальная инволюция тимуса в растущем организме при воздействии различных видов стрессоров / М. Ю. Капитонова [и др.] // Морфология. 2006. Т.130. № 6. С.56-61.
15. Yassin, S.F. Surgery of the Thymus Gland [Electronic resource] / Said Fadi Yassin // eMedicine Specialties. Thoracic Surgery, 2009. Vol.4. URL: http: // emedi-cine.medscape.com/article/427053-overview (дата обращения 12.08.2009).
УДК 636.52/.58.034
ПРОФИЛАКТИКА СТРЕССА У РЕМОНТНОГО МОЛОДНЯКА ЯИЧНЫХ КУР
А.И. КИСЕЛЕВ РУП «Опытная научная станция по птицеводству» г. Заславль, Минская обл., Республика Беларусь, 223036 В.Ю. ГОРЧАКОВ, О.В. АЖЕЛЬ УО «Гродненский государственный аграрный университет» г. Гродно, Республика Беларусь, 230008
(Поступила в редакцию 18.01.2010)
Введение. Перевод птицеводства на промышленную основу внес существенные коррективы в технологию и организацию производства яиц и мяса птицы на птицефабриках. Это наложило определенный отпечаток на характер поведенческих реакций молодняка кур, от которых в значительной степени зависит здоровье, уровень продуктивно-
