CC BY
63УДК 616.5-08.615.2-092.9 Могильная Г. М., Фомичева Е. В.
МОРФОГЕННЫЕ ТРАНСФОРМАЦИИ ДЕРМЫ В ОТВЕТ НА ВВЕДЕНИЕ ФИЛЛЕРОВ
Кафедра гистологии с эмбриологией, ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет», 35060, ул. Седина, 4, Краснодар, Россия.
Для корреспонденции: Фомичева Евгения Васильевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры гистологии с эмбриологией, ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет», е-та1ЫЪтеу§@та11.ги
For correspondence: E.V. Fomicheva, Dr.Sci.Biol., the Department of histology and embryology Kuban State Medical University, е-mail: fomevg@mail.ru
РЕЗЮМЕ
В эксперименте изучены морфологические и гистохимические преобразования, происходящие в дерме в зоне локализации препаратов «Радиесс» (Merz America, Inc., Raleigh, NC, USA) и «Кристалис» (Lu-minera Derm.Ltd, Lod, Israel). Препараты вводили крысам-самцам субдермально в объёме 0,05 мл. Оценку результатов проводили спустя 4 месяца после инъекции филлера. Морфология компонентов дермы изучена в микропрепаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону, Маллори и Массону. Для типирования фибриллярных структур дермы использовали окраску пикросириусом красным, также было проведено иммуногистохимическое выявление коллагена I типа. Проведена морфометрия ядер клеток, дана оценка их оптической плотности и обьем ядерной массы. Показано, что в случае использования препарата радиесс имеет место активация процесса неоколлагенеза с образованием преимущественно коллагена I типа, этот эффект удерживается до 4-х месяцев после введения филлера. При использовании препарата «Кристалис» происходит увеличение объема аморфного компонента экстрацеллюлярного матрикса, объем фибриллярного компонента существенно не меняется и он формируется за счет коллагена I и III типов.
Ключевые слова: кристаллы гидроксиапатита, филллер, препарат «Радиесс», препарат «Кристалис», неоколлагеногенез.
MORFOGENIC TRANSFORMATION OF THE DERMIS IN RESPONSE TO THE INJECTION OF THE FILLERS
G. M. Mogilnaya, E. V. Fomicheva
Kuban State Medical University, Krasnodar, Russia
SUMMARY
The experiment studied the morphological and histochemical transformations taking place in the dermis in the area of Radiesse (Merz America,Inc.,Raleigh, NC, USA) and Kristalis ((Luminera Derm.Ltd, Lod, Israel). The drug was injected to the male rats subcutaneously in the volume of 0,05 ml. The outcome evaluation was held after 2 and 4 months after the injection of the filler. The morphology of the dermis components was studied in micro drugs, dyed with hematoxylin-eosin according to Van Gieson, Mallory and Masson. PIKRA-sirius red was used to type fibrillar structures of the dermis. Moreover, the immunohistochemical detection of type I collagen was conducted. The morphometry of the microspheres, the evaluation of their optical density and of the amount of nuclear mass were held. It has been found that, activation the process of neocollagenesis with the formation of type I collagen is happened in case of using Radiesse. This effect is maintained for 4 months after injection of the filler. In case of using the Kristalis, the amount of the amorphous component of the extracellular matrix is increased. The volume of the fibrillar component does not change significantly and it is formed with help of type I and III collagen.
Keywords: hydroxyapatite crystals, filller, Radiesse products, Kristalis products, neocollagenesis.
Современная эстетическая косметология достаточно широко и успешно использует дер-мальные филлеры, среди огромного их числа, по данным ASAPS (American society for aesthetic plastic surgery 2012), наиболее востребованы гиалуроновая кислота и кальций гидроксиапа-тит - препарат «Радиесс» (Radiesse). При этом гиалуроновой кислоте посвящено большое число работ, проливающих свет на механизм стимуляции этим филлером пролиферацию фи-бробластов, продуцирующих коллаген [1,2,3].
Препарат «Радиесс», также широко используемый в инъекционной контурной пластике, характеризуется как эффективный филлер [4,5,6], обладающий исключительной толерантностью, поскольку он лишен иммуногенно-сти, химически инертен, а эффект его влияния на фибробласты дермы трансформируется в процессе активации неоколлагеногенеза [7,8]. Однако последовательность процесса колла-геногенеза и его этапы при введении радиесса изучены недостаточно, а эффект стимуляции
неоколлагеногенеза поддерживается не всеми авторами [9]. Более того, для оценки филлера важным представляется срок его действия. Ранее нами уже были опубликованы результаты эксперимента по изучению патогенетических механизмов коллагеногенеза в ранние (2 недели) сроки после введения препарата радиесс [10].
Целью настоящего исследования является сравнительное изучение динамики клеточных компонентов и экстрацеллюлярного матрикса дермы в период пролонгирования срока действия филлеров до 4 месяцев после инъекции, кроме того нами будут использованы для сравнения два препарата на основе кристаллов гидроксиапатита.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В качестве вольюмайзеров нами были взяты препарат «Radiess» (Merz America, Inc.,Raleigh, NC, USA) а также разработанный в Израиле филлер с таким же составом и получивший название «Crystalis» (Luminera Derm. Ltd, Lod, Israel). Основу этих филлеров составляют микросферы размером 25-45 мкм, образованные кристаллами гидроксиапати-та кальция и транспортным гелем. При этом препарат «Кристалис» в отличие от препарата «Радиесс» характеризуется иррегулярностью микросфер и неровностью их поверхности.
Объектом исследования послужили беспородные крысы-самцы весом 200-250г (25 особей, ПЛЖ «Рапполово» Ленинградской области).
Эксперимент проводился с разрешения Этического комитета ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Крыс содержали в стандартных условиях с контролируемым режимом температуры и свободным доступом к воде и пище. Препарат вводили субдермально в объеме 0,05 мл в заднюю часть шеи (холку) всем экспериментальным животным одновременно. В группе интактных животных (контроль) использовали стерильный физиологический раствор в той же дозе. Оценку результатов проводили спустя 4 месяца после инъекции филлера. Для морфологического изучения использовали био-птаты кожи, которые подвергали стандартной гистологической обработке: фиксировали в 10% растворе забуференного формалина, гистологическую проводку осуществляли путем обезвоживания в этиловом спирте и заливки в парафин. Окраску полученных срезов проводили гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, а также с помощью реакций Маллори и Массона [11]. Для типирования фибриллярных структур дермы использовали окраску пикросириусом
красным по Dayan et al (1989) с последующим изучением микропрепаратов в поляризованном свете при скрещенном анализаторе и поляризаторе микроскопа МП-8, где превалирование красного спектра в поляризованном свете интерпретировали как показатель наличия коллагена I типа, а превалирование зеленого спектра - как факт присутствия коллагена III типа.
Иммуногистохимическое выявление коллагена было проведено с использованием моноклональных антител к коллагену I типа (ABCAM, USA) и системы визуализации (Nikon eclipse80i, Japan). Исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 4 мкм с полилизиновым покрытием. Постановку им-муногистологической реакции осуществляли согласно протоколам, прилагаемым к используемым антителам. Для завершения окрашивания осуществляли фоновое контрастирование срезов Hematoxylin II (Roshe, Швейцария). С целью контроля окраски использовали эталоны позитивных и негативных образцов. Полученные препараты изучали с помощью светового микроскопа Leika DM4000B (Германия). Для избирательного выявления ДНК использовалась реакция Фельгена [11], при этом стандартизированная продолжительность гидролиза ДНК в 5 NHCL при 200С составляла 20 минут. Продолжительность гидролиза была определенна серией предварительных исследований таким образом, чтобы кривая депуринизации ДНК не выходила на «плато». (Для определения общего количества ДНК в расчете на одно ядро напротив необходимо депуринизировать весь объем ДНК, что определяется выходом кривой гидролиза на «плато».) Это позволило определить устойчивость ДНК, функционирующей в составе нуклеопротеидного комплекса к кислотному гидролизу, а значит и ее функциональную активность. При этом учитывали, что активированная ДНК слабее связана с гистона-ми хроматина и менее устойчива к кислотному гидролизу, а значит интенсивность окраски «активированных» ядер по Фельгену при одинаковом времени гидролиза ДНК выше, чем у покоящихся. Полученные микропрепараты подвергали компьютерной морфометрии с использованием стандартизированных микрофотографий в формате TIF, полученных цифровой камерой для микроскопии DCM 310. Анализ полученных изображений проводили по компьютерной программе Scion Image фирмы Scion Corporation, сертифицированной в 2000 году National Institute of Heals (USA). Числовые значения результатов измерений выражали в единицах, заданных программой Scion Image. Измерению подвергали диаметры ядер
клеток дермы, оптическую плотность ядер, а также объем ядерной массы, характеризующий количество ядерного материала, приходящееся на единицу объема исследуемой ткани, которая рассчитывалась как процент стандартной площади видеоизображения микропрепарата при увеличении 40х10 занятой клеточными ядрами. При этом в зависимости от интенсивности окраски ядерная масса подразделялась на гипер - и гипохромную составляющую. Измеряемая площадь составляла 100х100 пиксел компьютерного монитора класса SVGA при его разрешении 600х800 пикселей. Измерение диаметров каждого ядра производили дважды по его длинной и короткой оси. Диаметры ядер использовали для расчета эллиптичности ядер, которая представляет отношение большего диаметра к меньшему. При этом динамика фактора эллиптичности оценивается как предиктор малигнизации [12]. Морфометрическое изучение соотношения аморфного и волокнистого компонентов соединительной ткани изучали по данным компьютерной морфометрии микропрепаратов, окрашенных по Ван-Гизону с использованием стандартизированных микрофотографий в формате TIF, полученных цифровой камерой для микроскопии DCM310 и программы Scion Image. Предварительно, по данным изучения малой площади видеоизображения равной 10х10 пиксел определяли градационные характеристики видеоизображения, соответствующие аморфному и волокнистому компоненту соединительной ткани, которые в дальнейшем использовали в измерениях. Соотношение аморфного и волокнистого компонента рассчитывали как процент площади видеоизображения микропрепарата при увеличении 40х10 занятой аморфным или волокнистым компонентами. Измеряемая площадь, как и при изучении ядерной массы, составляла 100х100 пиксел компьютерного монитора класса SVGA при его разрешении 600х800 пикселей. С целью оценки степени организованности формируемого фибриллярного компонента дермы использовали показатель энтропии [13]. Все цифровые данные подвергались статистической обработке по программе Microsoft ЕхсеП.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При изучении экстрацеллюлярного матрик-са дермы спустя 4 месяца после введения препарата «Радиесс» оказалось, что микросферы располагаются в виде небольших групп. При этом многие микросферы окружены оболочкой, формируемой фибробластоподобными уплощенными клетками, расположенными в один ряд. Местами целостность оболоч-
ки нарушается, и содержимое микросфер в виде мелких кристаллов диссоциирует между клетками, напоминающими мононуклеары.
В условиях окраски по Ван-Гизону и Мас-сону отчетливо видно, что вокруг зоны инъекции филлера располагаются неориентированные коллагеновые фибриллы, вероятно, завершающие моделирование архитектуры коллагенового волокна на основе самосборки уже за счет внеклеточного фибриллогенеза.
Спустя 4 месяца после введения препарата «Кристалис» зона инъекции также типируется за счет сохранившихся микросфер, многие из которых выглядят пустыми, лишь единичные из них сохраняют кристаллы. Вокруг этих микросфер выявляется скопление большого количества клеток, а самый глубокий из слоев напоминает уплощенные фибробласты. Снаружи от них типируется 2-3 ряда клеток, по морфологическому профилю соответствующих мононукле-арам. Вокруг участка инъекции филлера формируется достаточно широкая соединительнотканная капсула, содержащая коллагеновые фибриллы. Клеточных элементов здесь мало, а сама зона инъекции проявляет выраженный эффект «погружения» и глубоко сдвинута за пределы дермы. Изучение распределения коллагенов с помощью пикросириуса красного показало, что в зоне инъекции препарата «Радиесс» в поляризованном свете на участке с микросферами вокруг отдельных из них видны очень тонкие фибриллы, обнаруживающие красное свечение за счет коллагена I типа. Между этими волокнами встречаются короткие фибриллы (в виде «штрихов»), обнаруживающие желто-зеленое свечение, указывающее на присутствие коллагена III типа (рис.1). Вне зоны инъекции участки дермы содержат широкие волокна коллагена I типа.
г^
г \ -v
* ' А ■
■ -V
, - ч
Ч- ' А- . *. I
Рис.1. Окраска пикросириусом красным. Поляризационная микроскопия. Зона введения препарата Радиесс. (0б.40х; 0к.10х)
Использование иммуногистохимической реакции на коллаген I типа показало, что после введения препарата «Радиесс» в зоне с микросферами типируются очень тонкие фибриллы, окрашивающиеся в светло-коричневый цвет, это коллаген I типа. Здесь же локализуется большое количество активных фи-бробластов, содержащих крупные интенсивно окрашенные гранулы проколлагена (рис.2). Много гранул разбросано и в зоне экстрацел-люлярной дермы, аморфный матрикс которой обнаруживает слабую диффузную реакцию.
Рис.2. Иммуногистохимическая реакция на коллаген I типа. Зона введения препарата «Радиесс». (Об.20х; Ок.Юх)
После введения препарата кристалис в срезах, окрашенных пикросириусом красным, содержимое микросфер не типируется. Стенки сохранившихся микросфер образованы тонкими фибриллами, обнаруживающими превалирование красного спектра за счет коллагена I типа. Здесь же располагаются фибриллы, обнаруживающие зеленое свечение это коллаген III типа (рис.3).
Иммуногистохимическая реакция на коллаген I типа в микропрепаратах после инъекции «кристалис» позволила выявить наличие слабой диффузной реакции экстрацеллюляр-ного матрикса дермы и интенсивной фибро-бластов. Вокруг пустых микросфер можно увидеть очень тонкие фибриллы светло-коричневого цвета, кнаружи от которых располагаются многочисленные ядра (рис.4).
Поскольку описанный процесс синтеза коллагена инициируется функциональным статусом ядер, мы провели изучение ядер клеток, расположенных на двух территориях. Первая-это ядра клеток, окружающих микросферы, и вторая-это ядра клеток, расположенных между микросферами. Оказалось, что в зоне инъекции препарата «Радиесс» средняя оптическая плотность ядер вокруг микросфер составила 130,02+2,03(p<0,01), что с учетом специфичности реакции Фельгена на ДНК указывает на
Рис.3. Окраска пикросириусом красным. Поляризационная микроскопия. Зона введения препарата «Кристалис». (Об.40х; Ок.Юх)
Рис.4. Иммуногистохимическая реакция на коллаген I типа. Зона введения препарата «Кристалис». (Об.40х; Ок.Юх)
большую функциональную активность этих ядер. В то же время ядра клеток, расположенных между микросферами, обнаруживают оптическую плотность, равную 126,11 + 1,32 ф<0,05). В случае использования препарата кристалис средняя оптическая плотность ядер вокруг микросфер наименьшая-121,29+2,6 ф<0,01). Во всяком случае, здесь можно говорить о том, что ядра клеток в зоне инъекции препарата «Кри-сталис» отличаются меньшей функциональной активностью ДНК, определяемой в реакции Фельгена меньшим числом чувствительных к кислотному гидролизу макромолекул. Морфо-метрия объема ядерной массы после инъекции препарата «Радиесс» относительно уровня контроля показала практически соответствие их объема (рис.5). Тогда как соотношение гипо- и гиперхромных ядер сдвигается в сторону увеличения числа гипохромных ядер с более функционально активной ДНК и средний показатель для них составляет 18,7+0,05 ф<0,001), количе-
2017, т. 7, № 2
крымскии журнал экспериментальном и клиническои медицины
ство гиперхромных ядер снижается. Соотношение диаметров ядер, интерпретируемое как показатель эллиптичности для ядер в зоне вокруг микросфер, составляет 2,3 + 0,13 (р>0,05), и практически не отличается от ядер контрольной группы. После инъекции препарата криста-лис объем ядерной массы проявляет тенденцию к увеличению, но статистически это увеличение не достоверно. Что касается объема гиперхром-ных ядер, то, в целом, этот показатель приближается к норме. Средняя оптическая плотность
ядер клеток, расположенных вокруг микросфер, ниже уровня контроля, что указывает на снижение их функциональной активности. В ядрах клеток между микросферами функциональный статус напротив нарастает. Показатель эллиптичности ядер клеток, расположенных между микросферами, с препаратом кристалис возрастает до 2,79+0,25 (р<0,001), превышая и уровень контроля, и показатель, вычисленный для препарата «Радиесс». Ядра клеток вокруг микросфер напротив снижают фактор эллиптичности.
Рис.5. Характеристика ядер клеточного компонента дермы спустя 4 месяца после введения филлеров (ЯМ-ядерная масса; ВК-волокнистый компонент; АК-аморфный компонент; *- достоверность
отличия контроля не ниже Р<0,05)
После инъекции препарата кристалис объем ядерной массы проявляет тенденцию к увеличению, но статистически это увеличение не достоверно. Что касается объема гиперхромных ядер, то в целом этот показатель приближается к норме. Средняя оптическая плотность ядер клеток, расположенных вокруг микросфер, ниже уровня контроля, что указывает на снижение их функциональной активности. В ядрах клеток между микросферами функциональный статус напротив нарастает. Показатель эллиптичности ядер клеток, расположенных между микросферами, с препаратом «Кристалис» возрастает до 2,79+0,25 (р<0,001), превышая и уровень контроля, и показатель, вычисленный для препарата радиесс. Ядра клеток вокруг микросфер напротив снижают фактор эллиптичности.
Изучение объема фибриллярного и аморфного компонентов экстрацеллюлярного матрик-са дермы в зоне инъекции «Радиесс» позволило выявить характерное увеличение объема именно волокнистого компонента, который в числовом выражении в среднем составил 36,8 + 1,2 (р<0,001) и был в 2 раза выше, чем в контроле (рис.5). При этом образовавшиеся волокна характеризуются относительно высоким уровнем
энтропии 3,0+1,12 (р<0,001), что указывает на перестройку структурной организации моделируемых микроструктур. Однако объем аморфного компонента в этих условиях снижается.
Таким образом, сравнительная характеристика изменений, наблюдаемых в дерме в ответ на введение филлеров, в состав которых входят кристаллы гидроксиапатита, показала, что в случае использования препарата радиесс имеет место активация процесса неоколлагенеза, удерживающаяся до 4-х месяцев наблюдения, при этом синтез коллагена связан с экскрецией клетками фибробластами в зону экстра-целлюлярного матрикса дермы проколлагена, который приступает к образованию межмолекулярных связей с формированием коллагено-вых фибрилл. При использовании препарата кристалис существенного увеличения объема волокнистого компонента не наблюдается. Интересно, что в случае использования этого филлера по сравнению с препаратом радиесс происходит увеличение объема аморфного компонента экстрацеллюлярного матрикса.
Итак, полученные данные позволяют считать, что филлеры, включающие кристаллы гидроксиапатита, влияют на со-
став экстрацеллюлярного матрикса за счет активации деятельности фибробластов.
В основе этой активации, по мнению ряда авторов [3,14], лежит эффект механического воздействия на клетки фибробласты с последующей их локальной пролиферацией, а затем и функциональной активацией, приводящей к синтезу коллагена. При этом типируемые в зоне экстрацеллюлярного матрикса волокна относятся к коллагенам и I, и III типов. Однако, волокна тонкие, расположены иерархически, что может указывать на незавершенность этапа внеклеточного фибриллогенеза с формированием в зоне дермы не зрелых кол-лагеновых волокон, а коллагеновых фибрилл.
ВЫВОДЫ
1. При использовании препарата радиесс происходит активация процесса неоколлаге-ногенеза с образованием преимущественно коллагена I типа, и этот эффект удерживается до 4-х месяцев после введения филлера.
2. Ядра клеток дермы, расположенные вокруг микросфер с препаратом ра-диесс, характеризуются увеличением оптической плотности в результате нарастания функциональной активности их ДНК.
3. Введение препарата «Кристалис» активирует в дерме продукцию аморфного компонента экстрацеллюлярного матрикса, объем фибриллярного компонента существенно не меняется и он формируется за счет коллагена I и III типов.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
I.Brandt F.S.et al. Hyaluronic acid gel fillers in the management of facial aging. Clin. Intery Aging.2008:3(1):153-15
2.Owosho A.,Elizabett A. Bilodeau, Yu et al. Orofacial dermal fillers: foreign body reaction, histopathologic features, and spectrometric studies. Oral and maxillofacial pathology.2014; 117:5.
3.Quan T. , Wang F., Shao Y. et al. Enhancing structural support of the dermal microenviroument activates fibroblast, endothelial cells, and keratinocytes in aged human skin in vivo. J.Invest.Dermatol.2013; 133: 658-657.
4.Redbord K.P., Busso M., Hanke C.W. Soft-tissue angmentation with hyaluronic acid and calcium hydroxyl apatite fillers. DermatolTher. 2011; 24(1): 71-81.
5.Rich L., Whittaker P.Collagen and picrosirius red staining: a polarized light assessment of fibrillarhue and spatial distribution. Braz. J. Morphol.Sci. 2005;22 ( 2): 97-104
6.Voigts R., Devore D.P., Grazez J.M. Dispersion of calcium hydroxylapatite accumulation in the skin animal studies and clinical practices.Dermatol Surg. 2010; Supplement 1:798-803.
7.BerlinA.L.,HussainM., Goldberg D.J. Calcium hydroxyapatite filler for facial rejuvenation: ahistologic and immunohistochamical analysis.Dermatol. Surg.2008; 34: 64-67.
8.Yutskovskaya Y., Kogan E., Leshunov E. A randomized, split-face, histo-morphologic study comparing a volumetric calcium hydroxylapatite and a hyaluronic acid-based dermal fillers. Jornal of drugs in dermatology.2014;13:47-52.
9.Holzapfel A.Soft-tissue augmentation with calcium hydroxyapatite //Arch.FacialPeast Surg.2008; 10(5):335-338.
10.Могильная Г.М., Фомичева Е.В., Терехов А.Я., Блатт Ю.Е. Динамика компонентов дермы в ответ на введение филлеров. Современные проблемы науки и образования.2015;( 4). URL: www.science-education. ru/127-21161.
11.Pearce A. Histochemistry. Theoretical and applied. London.1968: 561.
12.Sabo E., Beck A., Montgomery E.et all. Computerized morphometry as an aid in determining the grade of displasia and progression to adenocarcinoma in Burrets esophagus. Laboratory Investigation.2006;86:1261-1271.
13.Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. М.: Медицина;1990: .338-342.
REFERENSES
1.Brandt F.S. et al. Cazzaniqa. Hyaluronic acid gel fillers in the management of facial aging.Clin. InteryAging.2008:3(1):153-159.
2.Owosho A., Elizabett A. Bilodeau, Yu et al. Orofacial dermal fillers : foreign body reaction, histopathologic features, and spectrometric studies. Oral and maxillofacial pathology.2014; 117:5.
3.Quan T. , Wang F., Shao Y. et al. Enhancing structural support of the dermal microenvironment activates fibroblast, endothelial cells, and keratinocytes in aged human skin in vivo. J.Invest.Dermatol.2013; 133: 658-657.
4.Redbord K.P., Busso M., Hanke C.W. Soft-tissue angmentation with hyaluronic acid and calcium hydroxyl apatite fillers. Dermatol Ther. 2011; 24(1): 71-81.
5.Rich L., Whittaker P.Collagen and picrosirius red staining: a polarized light assessment of fibrillarhue and spatial distribution. Braz. J. Morphol.Sci. 2005;22 ( 2): 97-104
6.Voigts R., Devore D.P., Grazez J.M. Dispersion of calcium hydroxylapatite accumulation in the skin animal studies and clinical practices. Dermatol Surg. 2010; Supplement 1:798-803.
7. BerlinA.L.,HussainM., GoldbergD.J. Calcium hydroxyapatite filler for facial rejuvenation: a histologic and immunohistochamical analysis. Dermatol. Surg.2008; 34: 64-67.
8.Yutskovskaya Y., Kogan E., Leshunov E. A randomized, split-face, histomorphologic study comparing a volumetric calcium hydroxylapatite and a hyaluronic acid-based dermal fillers. Jornal of drugs in dermatology.2014;13:47-52.
9.HolzapfelA.Soft-tissue augmentation with calcium hydroxyapatite //Arch.FacialPeast Surg.2008; 10(5):335-338.
10.Mogil'naja G.M., Fomicheva E.V., TerehovA.Ja., Blatt Ju.E.Dinamika komponentov dermy v otvet na vvedenie
fillerov. Sovremennye problemi nauki i obrazovanija.2015;( 4). URL: www.science-education.ru/127-21161.(In Russ)
11.Pearce A. Histochemistry. Theoretical and applied. London.1968: 561.
12.Sabo E., Beck A., Montgomery E.et all. Computerized
morphometry as an aid in determining the grade of displasia and progression to adenocarcinoma in Burrets esophagus. Laboratory Investigation.2006;86:1261-1271.
13.Avtandilov G.G.Medicinskaja morfometrija.M.: Medicina;1990: .338-342. (In Russ)
