CC BY
0
Морфогенетические особенности дегенеративного поражения позвоночника у пациентов молодого и среднего возраста с болью в спине
^ Н.Г. Правдюк1, Н.А. Шостак1, Н.М. Швырева1, А.В. Новикова1, А.А. Буянова2
ФГАОУВО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова"Минздрава России, Москва 1 Кафедра факультетской терапии им. акад. А.И. Нестерова Лечебного факультета
2 ОСП "Научно-исследовательский клинический институт педиатрии им. акад. Ю.Е. Вельтищева"
Боль в спине, ассоциированная с поражением суставного аппарата позвоночника, занимает одно из лидирующих мест в структуре заболеваний опорно-двигательного аппарата. До недавнего времени прогрессирование боли в спине связывали с увеличением возраста пациентов, однако изменения межпозвонкового диска (МПД) дегенеративного характера были выявлены и у подростков и лиц молодого возраста. Одним из объяснений причин ранней манифестации дегенеративного поражения МПД, развития экструзий, поражения суставного аппарата позвоночника и возникновения боли в спине служит влияние генетических факторов. Целью исследования являлось изучение ассоциации полиморфизмов генов COL1A1, IL-ie, IL-6, VDR и MMP3 с морфологическими изменениями МПД и инструментальными признаками дегенеративного поражения позвоночника у пациентов молодого и среднего возраста. В исследование были включены пациенты с болью в спине и экструзией МПД. Генетическое исследование включало изучение полиморфизмов генов IL-1$ (rs1143627), IL-6 (rs1800795), COL1A1 (rs1800012), VDR (rs1544410), MMP3 (rs35068180). Фрагменты МПД пациентов, оперированных по поводу экструзии диска, были подвергнуты гистологическому анализу. Определены генотипы полиморфизмов, ассоциированные с дебютом боли в спине в молодом возрасте, — генотип G/G гена IL-1$ (р = 0,033), генотип C/C гена COL1A1 (р = 0,06), а также генотип C/T гена VDR (отсутствовал у здоровых лиц). Для старшей возрастной группы формирование боли в спине было связано с генотипом G/A гена IL-1$ (р = 0,028 для оперированных и р = 0,03 для находящихся на консервативной терапии), генотипом A/A гена COL1A1 (r = 0,38; p = 0,02), а также была выявлена обратная корреляционная связь генотипа C/T гена VDR с возрастом дебюта боли в спине (r = —0,25; р = 0,04). Ни у кого из молодых оперированных пациентов не встречался генотип A/A гена COL1A1. Здоровые лица контрольной группы в отличие от пациентов с болью в спине являлись носителями гомозиготного генотипа T/T гена VDR (p < 0,01), а генотип С/С гена VDR был характерен для пациентов с тотальным поражением позвонково-двигательного сегмента. Выявлена прямая корреляционная связь дегенеративных изменений позвоночника с генотипом 5A/5A гена MMP3 (r = 0,36; p = 0,003) и обратная — с генотипом 5A/6A (r = —0,36; p = 0,003). Отсутствие A-аллелей в гене IL-1$ у пациентов с болью в спине ассоциировалось с изменениями типа Modic II (r = 0,28; p = 0,03). Выявлена ассоциация генотипа G/G гена IL-6 с инструментальными признаками воспалительного отека и жировой трансформации костного мозга прилежащих тел позвонков и экструзией МПД (r = —0,4; p = 0,01). Наследственные предпосылки к раннему формированию боли в спине и тяжелому ее течению складывались из наличия гомозиготных вариантов генов IL-1$ (G/G), IL-6(G/G) и COL1A1 (С/С). Одновременное наличие 2 или 3 неблагоприятных полиморфных вариантов кандидатных генов статистически значимо чаще определялось у пациентов молодого возраста с показаниями к оперативному лечению.
Ключевые слова: боль в спине, дегенерация, экструзия межпозвонкового диска, замыкатель-ные пластины, полиморфизм гена, (геП43627), К-6 (к1800795), COL1A1 (ге1800012), УБЯ (к1544410), ММР3 (к35068180), изменения типа Modic.
Введение
Боль в нижней части спины является одной из ведущих причин инвалидизации согласно исследованию глобального бремени болезней в 2021 г. (https://www.thelancet. com/lancet/visualisations/gbd-compare), а число страдающих ею людей неуклонно увеличивается с возрастом. У 87% пациентов с болью в спине выявляется дегенеративное поражение межпозвонкового диска (МПД) при неинвазивной визуализации [1]. Индекс инвалидности Освестри у пациентов с люмбалгией прямо коррелирует со степенью дегенерации диска по данным магнитно-резонансной томографии (МРТ) (классификация Pfirrmann 2001 г.) [2].
До настоящего времени не сформировано единого мнения о механизмах развития и прогрессирования дегенеративного поражения позвоночника. В подтверждение иммунного вклада в процесс дегенерации МПД рядом авторов получены данные об ассоциации острого эпизода боли в спине с повышением уровня провоспалитель-ных цитокинов интерлейкина-1Р (ИЛ-ф), ИЛ-6, ИЛ-10 и фактора некроза опухоли а в сыворотке крови; увеличение концентрации ИЛ-ip и ИЛ-6 также коррелировало с дегенеративным поражением и выраженностью боли в спине [3—5]. По данным других авторов, уровень цитоки-на ИЛ-6 коррелировал с воспалительным отеком костного мозга прилежащих тел позвонков — изменения типа Modic I [6]. Образование воспалительной микросреды в МПД приводит к постепенной деградации матрицы пульпозного ядра (ПЯ) и фиброзного кольца (ФК) за счет повышенной выработки литических ферментов, таких как матриксные металлопротеиназы (matrix metaUoproteinase, MMP) и ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs — дезинтегрин и ме-таллопротеиназа с мотивами тромбоспон-дина), повышается синтез коллагена I типа и снижается синтез коллагена II типа, что
Контактная информация: Правдюк Наталья Григорьевна, pravda547@yandex.ru
принципиально ухудшает эластические свойства диска. Метаболизм кальция в хондроцитах диска важен для минерализации протеогликанов. Изменения кон-формации рецепторов, которые влияют на абсорбцию витамина D, в итоге приводят к нарушению этого метаболизма. Накопление стареющих клеток в диске имеет большое значение в инициации и прогрес-сировании дегенерации МПД, так как они секретируют высокие уровни MMP и про-воспалительных цитокинов. Было высказано предположение, что витамин D может модулировать процессы аутофагии, а также играть цитопротективную роль в развитии процессов дегенерации [7].
Влияние генетических факторов на развитие и течение дегенерации МПД оценивалось ранее в разных популяциях, однако были обнаружены аллели, ассоциированные с повышением риска заболевания только в сочетании с внешними факторами или иными участвующими в патогенезе аллелями. Выделяют 3 категории кандидат-ных генов, варианты кодирования которых ассоциированы с различными формами дегенеративных изменений МПД: I категория включает генетические ассоциации со строительством структурных компонентов МПД (ген аггрекана, COL1A1 и др.);
II категория — гены, продуцирующие ферменты, которые вызывают деградацию мат-рикса диска, например, гены ММР3, IL-1Q, IL-6, TIMP-1 (tissue inhibitor of metaUoproteinase — тканевый ингибитор ММР);
III категория — гены, связанные с костной структурой (ген рецептора витамина D (VDR) и ген эстрогеновых рецепторов) [8, 9].
Дегенерация МПД является мультифак-ториальным процессом, и роль генов в его развитии может быть принципиально важной. Формирование групп риска раннего развития дегенерации МПД на основании клинических и генетических данных может способствовать профилактике прогресси-рования дегенеративных процессов в диске и суставах позвоночника, а также снизить риск инвалидизации пациентов трудоспособного возраста [10, 11].
Целью исследования явилось изучение ассоциации полиморфизмов генов С01,1А1, 11.-6, VDR и ММР3 с мор-
фологическими изменениями МПД и инструментальными признаками дегенеративного поражения позвоночника у пациентов молодого и среднего возраста.
Материал и методы
Работа проводилась на кафедре факультетской терапии им. акад. А.И. Нестерова Лечебного факультета ФГАОУ ВО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пиро-гова" Минздрава России при участии отделения нейрохирургии ГБУЗ "Городская клиническая больница № 67 им. Л.А. Воро-хобова" Департамента здравоохранения города Москвы. В исследование было включено 70 пациентов (30 мужчин, 40 женщин) с болью в спине, ассоциированной с дегенеративным поражением позвоночника. У части больных планировалось проведение микродискэктомии на поясничном уровне в связи с развившимся неврологическим дефицитом на фоне экструзий МПД.
Критерии включения: пациенты обоего пола в возрасте от 21 до 60 лет, наличие боли в нижней части спины, ассоциированной с экструзией МПД на поясничном уровне, подтвержденной на МРТ.
Критерии исключения: вторичный характер боли в спине (неоплазия, инфекция, травматическое поражение позвоночника, воспалительные спондилопатии), боль в спине висцеральной этиологии, возраст моложе 21 года и старше 60 лет, подтвержденный дифференцированный фенотип наследственных нарушений соединительной ткани.
Все участники подписали информированное согласие на проведение гистологического и генетического исследований.
Пациенты с болью в спине были разделены на группы по возрастному принципу: 1-ю группу составили 34 пациента молодого возраста (21—34 года), 2-ю группу — 36 пациентов старшего возраста
(35—60 лет). В соответствии с проводимой терапией обе группы были разделены на подгруппы А и Б: подгруппа А — пациенты с выполненным оперативным вмешательством — микродискэктомией (подгруппы 1А и 2А — молодые и старшего возраста), подгруппа Б — пациенты с болью в спине без оперативного вмешательства и с удовлетворительным ответом на консервативную терапию (подгруппы 1Б и 2Б — молодые и старшего возраста).
Контрольная группа для оценки генетических полиморфизмов была сформирована из 15 здоровых лиц без боли в спине (8 мужчин, 7 женщин; средний возраст 26,5 ± 3,0 года).
При анализе анамнестических данных учитывались продолжительность последнего болевого эпизода (в днях) и количество обострений в последние 12 мес. Офисные служащие, лица профессий, связанных с работой за компьютером, диспетчеры, врачи некоторых специальностей (цитологи, стоматологи, врачи скорой медицинской помощи), водители были объединены в группу профессий с вынужденным длительным (более 95% рабочего времени) пребыванием в положении сидя (13 лиц молодого возраста и 9 — старшего).
Для изготовления микропрепаратов ткани МПД были использованы стандартные гистологические методики. Парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пирофуксином по Ван-Гизону для изучения соединительной ткани; толуидиновым синим для выявления кислых гликозаминогликанов; сафранином с целью определения соотношения протеогликанов и коллагеновых волокон; методом Маллори для выявления фибри-ноидного некроза. Подсчет клеток осуществлялся в 10 случайных полях зрения при общем увеличении микроскопа х100. Интенсивность окрашивания оценивалась в программе ImageJ: изображение конвертировалось в 8-битный формат, после чего интенсивность окрашивания оценивалась по шкале от 0 ед. (белый цвет) до 255 ед.
(черный цвет), а между этими значениями находились оттенки серого.
Для осуществления молекулярно-гене-тического анализа выделяли ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови. Смесь для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации фрагментов генов COL1A1, IL-I$, IL-6, VDR и MMP3 состояла из 1,5 мкл 25 ммоль MgCl2, 2 мкл 25 ммоль dNTP Mix, 0,25 мкл каждого праймера, 17,5 мкл ddH20, 0,5 мкл Taq-полимеразы и 2,5 мкл ДНК. ПЦР-про-дукты подвергались ферментной обработке эндонуклеазами рестрикции AluI (rs1143627 G/A, ген IL-Ip), NlalII (rs1800795 C/G, ген IL-6), Mscl (rs1800012 C/A, ген COL1AI), BsmI (rs1544410 C/T, ген VDR) и Tth111I (rs35068180 5A/6A, ген MMP3). Полученные фрагменты нуклеиновых кислот подвергались электрофоретическому разделению в 40% полиакриламидном геле.
Статистическая обработка данных проводилась с помощью программного пакета GraphPad Prism 8.0.1. Все полученные количественные параметры были проверены на соответствие нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уил-ка. Количественные параметры, имеющие нормальное распределение, представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. Параметры, имеющие распределение, отличное от нормального, представлены в виде медианы и верхнего и нижнего квартилей. Качественные показатели представлены как в абсолютных, так и в относительных (в %) величинах. Для установления различий между группами для нормально распределенных числовых показателей использовали t-критерий Стъюдента для 2 независимых выборок. В случае неподтверждения гипотезы о нормальном распределении для сравнения количественных данных применяли непараметрический U-критерий Манна-Уит-ни для несвязанных совокупностей. Для сравнения дихотомических показателей между независимыми выборками использовали критерий %2 Пирсона с поправкой Йейтса на непрерывность, точный кри-
терий Фишера для малых выборок. При невозможности применения критерия %2 Пирсона использовали Z-критерий (аналог ^критерия Стьюдента для долей), а для 0 и 100% — с поправкой для концевых точек. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. Корреляционный анализ проводился на основе непараметрической ранговой корреляции Спирмена.
Результаты
В 1-ю группу вошло 34 пациента (17 мужчин, 17 женщин; средний возраст 28,8 ± 3,0 года), во 2-ю группу — 36 пациентов (13 мужчин, 23 женщины; средний возраст 44,9 ± 4,0 года) (р < 0,05). Дебют заболевания характеризовался появлением болевого синдрома в спине и был отмечен в возрасте 27,5 (23—29,5) года у пациентов 1-й группы и в возрасте 34 (30,5—40) года у пациентов 2-й группы (р < 0,01).
Продолжительность боли в спине составила 1,5 (0,3—3,0) года в 1-й группе и 10 (5—13,5) лет во 2-й группе (р < 0,01). Пациенты молодого возраста, направленные на оперативное лечение, отмечали статистически значимо более частые рецидивы болевого синдрома в сравнении как с пациентами старшего возраста в обеих подгруппах (р = 0,01 для оперированных и р = 0,009 для получающих консервативное лечение), так и с пациентами этой же возрастной группы, получающими консервативную терапию (р = 0,006) (табл. 1).
При анализе продолжительности обострения была выявлена статистически значимо большая его длительность у пациентов молодого возраста, оперированных по поводу боли в спине, в сравнении с пациентами других подгрупп (р < 0,05).
При сравнительном анализе провоцирующих факторов в разных возрастных группах выявлено, что неадекватная физическая нагрузка приводила к развитию заболевания статистически значимо чаще у лиц старшего возраста (р = 0,049), длительное пребывание в положении сидя чаще
Признак Подгруппа 1А Подгруппа 1Б Подгруппа 2А Подгруппа 2Б
Количество обострений в год, абс. 4 (2-5) 3 (2-3) 3 (2-3) 2 (2-3)
Продолжительность последнего обострения, мес 3 (2-6) 1 (0,7-2) 1 (1-2,5) 1,5 (0,7-2)
являлось причиной боли в спине у лиц молодого возраста (р = 0,01). Сочетание нескольких факторов, вызывающих обострение заболевания, определялось статистически значимо чаще у лиц старшей возрастной группы (р = 0,02).
Морфологические изменения МПД в изученных когортах
Проведено морфологическое исследование МПД у 28 пациентов (14 пациентов из 1-й группы и 14 пациентов из 2-й группы), оперированных по поводу экструзии МПД поясничного отдела позвоночника. По данным гистологического исследования в обеих группах отмечено разволок-нение структур ФК МПД и его отек, нарушение четкости ламеллярной структуры ФК у 89% пациентов подгруппы 1А и у 30% пациентов подгруппы 2А. Выявлено статистически значимое увеличение количества ячеек и полостей внутри ФК у пациентов старшего возраста в сравнении с молодыми (р = 0,03). Клеточный состав ФК был представлен округлыми клетками небольшого размера с маленьким ядром и узкой светлой цитоплазмой, расположенными между волокнами ФК, преимущественно у за-мыкательных пластин (ЗП), соответствующими фибробластоподобным клеткам. Выявлено статистически значимо большее количество фибробластоподобных клеток в ФК у пациентов подгруппы 2А в сравнении с молодыми оперированными пациентами (13 (9—15) и 16 (12—17) соответственно; р = 0,04). Клетки были расположены поодиночке в наружных отделах ФК, по мере продвижения к центру диска выстраивались в цепочки. Матрикс ФК становился более рыхлым, приобретал более яркую оксифильную окраску — формировалась переходная зона МПД (рис. 1, 2).
Среди волокон переходной зоны в ПЯ располагались более крупные клетки с ба-зофильной цитоплазмой и ободком плотного метахроматичного матрикса вокруг — хондроцитоподобные клетки с признаками синтетической активности. Такие клетки чаще образовывали скопления (кластеры) — изолированные группы, окруженные общим плотным ободком межклеточного вещества. Часто кластеры обнаруживались вблизи трещин или разрывов основного вещества, что свидетельствует об их репара-тивно-синтетической функции.
Число хондроцитоподобных клеток было статистически значимо выше в препаратах пациентов подгруппы 2А, чем у пациентов подгруппы 1А (159 (145—170)
Рис. 1. Разволокнение структур ФК, небольшое количество клеточных элементов (препарат МПД пациента подгруппы 1А).
Рис. 2. Плотное прилегание волокон, большое число клеточных элементов — одиночные хон-дроцитоподобные клетки, цепочки фибро-бластоподобных клеток, единичные кластеры (препарат МПД пациента подгруппы 2А).
Рис. 3. Кластеры активные и в состоянии дистрофии (препарат пациента подгруппы 2А).
и 178 (160—188) соответственно; р = 0,01). У пациентов молодого возраста межклеточное вещество ПЯ было окрашено менее
интенсивно, чем у пациентов старшего возраста (220 (210-226) и 232 (220-234) ед. по шкале оттенков серого (grayscale value) соответственно; р = 0,03), что косвенно может свидетельствовать о низком содержании протеогликанов в его матриксе. Число и размер (количество клеток в кластере) кластеров ПЯ также были статистически значимо ниже в МПД у пациентов подгруппы 1А, чем у пациентов подгруппы 2А (10 (8-11) и 12 (10-13); р = 0,044; 7 (6-9) и 9 (8-11); р = 0,03 соответственно), что свидетельствовало о сниженном репаративном клеточном резерве. Хондроциты, находящиеся в состоянии дистрофии, статистически значимо чаще встречались в препаратах пациентов старшего возраста (55 и 72% соответственно; р = 0,01) (рис. 3).
При оценке количества участков распада, кальцинатов, оссификатов, вросших сосудов в тканях ФК и ПЯ в группах молодого и старшего возраста статистически значимых различий не выявлено. Участки некроза ЗП наблюдались у 4 пациентов (33%) молодого возраста и не встречались в старшей возрастной группе (р = 0,03).
Таким образом, МПД у пациентов молодого возраста с болью в спине (подгруппа 1А) имел следующие гистологические характеристики: низкое содержание кислых гликозаминогликанов в межклеточном веществе ПЯ, меньшее число неактивных хондроцитов, меньшее число кластеров и небольшой их размер, некротические участки ЗП. Интересно, что некротические процессы в ЗП и ФК, наличие клеток крови и оссификатов в ПЯ ассоциировались с длительным пребыванием в положении сидя (p < 0,05 для всех корреляций), что являлось фактором риска возникновения боли в спине в молодом возрасте. Образование трещин в ЗП ассоциировалось с продолжительностью обострения боли в спине, которая имела тенденцию к увеличению у пациентов подгруппы 1А (табл. 2).
Для МПД пациентов старшей возрастной группы было характерно более ярко окрашенное ПЯ, значительное количество хондроцитов, как неактивных, так и дистро-
Таблица 2. Взаимосвязь морфологических изменений в МПД с продолжительностью последнего болевого эпизода и длительностью пребывания в положении сидя у пациентов молодого возраста с болью в спине
Морфологические изменения Фактор Коэффициент корреляции Спирмена R р
Оссификаты в ПЯ Длительное пребывание в положении сидя 0,53 0,04
Клетки крови ПЯ Длительное пребывание в положении сидя 0,53 0,04
Распад ФК Длительное пребывание в положении сидя 0,54 0,009
Распад ЗП Длительное пребывание в положении сидя 0,58 0,004
Оссификация ЗП Длительное пребывание в положении сидя 0,43 0,045
Трещины ЗП Продолжительность последнего обострения 0,47 0,027
Таблица 3. Распределение частоты полиморфизма rs1800012 гена COL1A1 в изученных когортах (абс. (%))
Генотип 1-я группа 2 -я группа Контрольная группа Р1-2 Р1-К р2-К
C/C 25 (83) 18(58) 8 (62) 0,0486 0,124 0,830
C/A 4 (13) 10 (32) 3 (23) 0,072 0,352 0,410
A/A 1 (4) 3 (10) 2 (15) 0,565 0,212 0,212
Примечание. По критерию %2: р1 2 = 0,0956; р1 = 0,225 р2-К = 0,764.
фически измененных, повышенное число кластеров, в том числе большого размера, расположенных преимущественно вблизи трещин, а также наличие свободных полостей в ткани ФК. Большинство выявленных гистологических характеристик соответствуют морфологической картине МПД на разных этапах онтогенеза и отражают адаптивные репаративные процессы в диске.
Изучение генетических полиморфизмов
При изучении частоты полиморфизма ге1800012 гена COL1A1 была выявлена тенденция к накоплению гомозиготного варианта аллеля (С/С) у пациентов с болью в спине — у 83 и 58% лиц молодого и старшего возраста соответственно (р = 0,0486) (табл. 3).
Генотип С/С полиморфизма гена COL1А1 (геШ0012) определялся у 93% пациентов подгруппы 1А, статистически значимо чаще, чем у пациентов подгруппы 2А (р = 0,01). Генотип С/А (р = 0,037) чаще выявлялся у лиц подгруппы 2А, чем у опе-
рированных пациентов молодого возраста (подгруппа 1А) (рис. 4).
Гомозиготный генотип A/A в подгруппе 1А не встречался. При проведении корреляционного анализа была выявлена обратная связь между генотипом C/C и возрастом появления боли в спине (r = —0,33; р = 0,008) и прямая связь между генотипом A/A и возрастом появления боли в спине (r = 0,38; p = 0,02), из чего следует, что аллель rs1800012-C ассоциируется с дегенерацией МПД.
При изучении полиморфизма rs1143627 гена IL-1$ было установлено, что гетерозиготный вариант G/А гена IL-1$ статистически значимо чаще выявлялся у пациентов подгруппы 2A, а генотип A/A гена IL-1$ был характерен для здоровых лиц контрольной группы (табл. 4).
Так, 7 пациентов (50%) подгруппы 1А имели генотип G/G по полиморфизму rs1143627 гена IL-1$, что статистически значимо чаще в сравнении со здоровыми лицами контрольной группы (р = 0,033). У пациентов подгрупп 2А и 2Б с высокой
И Подгруппа 1А □ Подгруппа 1Б ■ Подгруппа 2А □ Подгруппа 2Б И Контрольная группа
Рис. 4. Частота встречаемости генотипов по полиморфизму ге1800012 гена СОШ^1 у обследованных.
Генотип А/А Генотип G/A Генотип G/G
Н Подгруппа 1А □ Подгруппа 1Б ■ Подгруппа 2А □ Подгруппа 2Б И Контрольная группа
Рис. 5. Частота встречаемости генотипов по полиморфизму ге1143627 гена в изученных когортах.
частотой определялся генотип G/A в сравнении как с пациентами подгруппы 1А (р = 0,015 и р = 0,017 соответственно), так и со здоровыми лицами контрольной группы (р = 0,028 и р = 0,03 соответственно). Здоровые молодые лица имели генотип G/G чаще, чем пациенты старшего возраста (p < 0,01 для оперированных пациентов и p = 0,016 для пациентов, получающих консервативную терапию). Пациентов с генотипом G/G в подгруппе 1А было больше, чем в подгруппе 2Б (p = 0,036) (рис. 5).
Обнаружена обратная корреляция МРТ-признаков дегенеративного поражения МПД (экструзии МПД), тел позвонков и фасеточных суставов с генотипом A/A,
прямая корреляция с генотипом G/A, а также прямая корреляция генотипа G/G со стенозированием позвоночного канала и реактивными изменениями тел позвонков типа Modic (табл. 5).
При анализе частоты полиморфизма rs1800795 гена IL-6 в основных и контрольной группах статистически значимых различий не выявлено. Генотип G/G наблюдался у 5 пациентов (36%) подгруппы 1А, что чаще (р = 0,037), чем в подгруппе 2А, где этот генотип определялся у 1 пациента (5%). В подгруппе 2А преобладал гомозиготный генотип C/C (58%). При корреляционном анализе была выявлена обратная связь генотипа G/G гена IL-6 со средней
Таблица 4. Распределение частоты полиморфизма ге1143627 гена в изученных когортах
(абс. (%))
Генотип 1-я группа 2 -я группа Контрольная группа Pl-2 Pl-K P2-K
A/A 9 (30) 3 (9) 9 (60) 0,0359 0,0538 0,0002
G/A 10 (33) 22 (67) 4 (27) 0,0118 0,742 0,0137
G/G 11(37) 8 (24) 2 (13) 0,716 0,098 0,325
Примечание. По критерию %2: р1 = 0,0198; р1 = 0,118; р2- < 0,001. к '
DOJ
Таблица 5. Взаимосвязь вариантов кодирования гена 1в с МРТ-признаками дегенеративного поражения позвоночника
Генотип Фактор Коэффициент корреляции r р
А/А Число экструзий -0,34 0,006
Остеофиты тел -0,39 0,002
позвонков
Остеоартрит фасеточных суставов -0,27 0,036
Грыжи -0,31 0,01
G/A Возраст пациентов 0,27 0,03
Число МПД 0,30 0,02
с признаками
дегенерации
Грыжи 0,27 0,02
Остеоартрит фасеточных суставов 0,33 0,01
G/G Стеноз позвоночного канала 0,28 0,02
Изменения типа 0,28 0,03
Modic
степенью дегенерации дисков (r = —0,28; р = 0,03), остеоартритом фасеточных суставов (r = —0,26; р = 0,044), изменениями типа Modic II (r = —0,4; р = 0,01) по данным МРТ.
В 1-й группе 71% пациентов с дегенеративным поражением позвоночника являлись носителями 2 или 3 неблагоприятных аллелей кандидатных генов IL-1$, IL-6 и COL1A1 одновременно.
При изучении частоты полиморфизма rs1544410 гена VDR было выявлено, что носителями генотипа T/T являлись 13 обследованных (87%) контрольной группы, это количество было статистически значимо
выше, чем в обеих группах больных (23% в 1-й группе и 30% во 2-й группе) (табл. 6).
Генотип T/T по полиморфизму rs1544410 гена VDR в группах больных был ассоциирован с формированием стеноза позвоночного канала (r = 0,51; р = 0,00002). Среди здоровых лиц не обнаружено носителей гетерозиготного генотипа C/T, что может указывать на потенциальную связь с повышенным риском развития заболевания. Выявлена обратная корреляция генотипа C/T гена VDR с возрастом появления боли (r = —0,25; р = 0,04) и числом МПД с признаками дегенерации (r = —0,32; р = 0,01). Не обнаружено статистически значимых различий между группами по генотипу C/C. Тем не менее этот генотип был ассоциирован с числом дегенеративно-измененных МПД (r = 0,29; р = 0,02), экструзиями МПД на уровне LIV—Lv (r = 0,31; р = 0,01), а также с формированием секвестров (r = 0,33; р = 0,007).
Статистически значимых различий по частоте полиморфизма rs35068180 гена ММР3 между группами выявлено не было. Обращает на себя внимание инверсия распределения аллелей у лиц подгруппы 2Б — более распространенный генотип 5A/6A и менее частый генотип 5A/5A в отличие от генотипов остальных когорт, включая здоровых лиц, у которых генотип 5A/5A встречался чаще гетерозиготного. Однако при статистическом анализе не было обнаружено значимых различий.
Выявлена прямая корреляция образования экструзий МПД с генотипом 5A/5A (r = 0,36; p = 0,003) и обратная корреляция — с генотипом 5A/6A (r = —0,36; p = 0,003), что свидетельствует о возможной связи носительства генотипа 5A/5A
Таблица 6. Распределение частоты полиморфизма ге1544410 гена VDR в изученных когортах (абс. (%))
Генотип 1-я группа 2-я группа Контрольная группа Р1-2 Р1-К р2-К
C/C 7 (23) 11 (34) 2 (13) 0,378 0,397 0,1028
C/T 16 (54) 12 (36) 0 (0) 0,175 0,040 0,151
T/T 7 (23) 10 (30) 13 (87) 0,533 <0,001 <0,001
Примечание. По критерию %2 р1 = 0,363.
гена ММР3 с предрасположенностью к ка-таболическим процессам МПД и раннему формированию экструзий в поясничном отделе позвоночника.
Варианты аллелей генов, с высокой частотой выявляемые у пациентов подгруппы 1А, ассоциировались с отсутствием четкой структурной организации ПЯ (ген COL1A1, генотип C/C) (r = - 0,49; р = 0,009), обеднением клеточного состава ФК (ген IL-1ß, генотип G/G) (r = - 0,4; р = 0,042), низким числом кластеров ПЯ (ген IL-6, генотип С/С) (r = 0,49; р = 0,01). Однако в то же время генотип G/G гена IL-6 находился в обратной взаимосвязи с дистрофическими изменениями клеток ФК (r = -0,6; р = 0,002), что может косвенно подтверждать первичное поражение центральных отделов МПД в молодом возрасте. Гетерозиготные генотипы генов-кандидатов, с более высокой частотой наблюдающиеся у лиц старшего возраста, ассоциировались с дезорганизацией ФК (ген COL1A1, генотип с/а) (r = -0,58; p < 0,001), дистрофическими изменениями клеток наружных отделов МПД (ген IL-1ß, генотип G/A) (r = 0,46; p = 0,029), кластеров в ПЯ (ген IL-6, генотип С/G) (r = 0,52; p = 0,04). Генотип A/A гена IL-1ß, определяемый у здоровых лиц, ассоциировался с высокой пролиферативной активностью клеточных элементов (r = 0,56; p = 0,02), а также находился в обратной взаимосвязи с дистрофическими и некротическими изменениями клеток ФК (r = -0,47; p = 0,02), что косвенно указывает на его протективное значение. Генотип T/T гена VDR, наблюдаемый преимущественно в контрольной группе, ассоциировался с отсутствием полостей в ПЯ (r = -0,6; p = 0,01) и плотным матриксом ФК МПД (r = 0,47; p = 0,02), что демонстрирует роль экспрессии этого гена в стабильности матрикса МПД. Выявлена ассоциация генотипа 5A/6A гена ММРЗ, в большей степени характерного для лиц подгруппы 2Б (старшего возраста, без хирургического вмешательства), с увеличением числа клеточных элементов, как одиноч-
ных (r = 0,67; p = 0,004), так и образующих группы (r = 0,54; p = 0,02), в матриксе ПЯ.
Полученные данные могут свидетельствовать об ассоциации полиморфизмов изучаемых генов с процессами организации соединительной ткани МПД, его метаболизмом, распределением клеточного состава и количеством клеток, а также с активностью хондроцитов.
Обсуждение
По данным многочисленных генетических исследований, было выявлено более 80 генных мутаций, связанных с дегенеративным поражением позвоночника [11]. Определены генетические полиморфизмы, которые способствуют потере структурной целостности, ухудшению гидрофильных свойств диска, повышению экспрессии провоспалительных цитокинов. Регуляция активности цитокинов и протеаз, экспрессия рецепторов-агонистов и антагонистов генетически детерминирована.
Полиморфизм rs1800012-A гена COL1A1 встречается у 13,5% здоровых людей, чаще всего в популяции евреев ашкенази (19,9%), реже всего - у восточных азиатов (0,128%), в российской популяции - у 17,67% здоровых и у 14,06% больных, согласно данным RuSeq [12, 13]. При высоком распространении генотипа C/C в популяции (является референсным) заболевание, вероятно, развивается при наличии факторов риска или при сочетании с другими полиморфизмами. Известно, что носительство аллеля rs1800012-C связано с меньшей вероятностью поражения МПД [14]. В более раннем исследовании было показано, что генотип rs1800012 T/T у греков и голландцев ассоциирован со значимым риском прогресси-рования дегенерации диска в сравнении с генотипами G/T и G/G [15].
Полиморфизм rs1143627-A гена IL-1ß встречается у 56,4% здоровых людей, чаще всего у европейцев (65,7%) и реже всего - в африканской популяции (39,6%) [12]. Гомозиготный генотип A/A гена IL-1ß был характерен для здоровых лиц в нашем ис-
следовании. Вероятно, при наличии каких-либо дополнительных факторов он может способствовать развитию боли в спине в молодом возрасте с благоприятным вариантом течения заболевания. Генотип G/G обусловливает развитие заболевания в молодом возрасте и более тяжелое его течение, приводящее к быстрому формированию показаний к оперативному вмешательству, что согласуется с результатами нашего исследования. Гетерозиготный генотип G/A ассоциируется с развитием боли в спине в возрасте старше 35 лет с клинико-инстру-ментальными признаками остеоартрита позвоночника. В исследовании A. Biczo et al. аллель G был связан с лучшим ответом на микродискэктомию (отношение шансов (ОШ) 1,49; p = 0,049 в логарифмической аддитивной модели) [16].
Полиморфизм rs1800795-G гена IL-6 встречается у 68,3% здоровых людей, чаще всего в восточно-азиатской популяции (100%) и реже всего — в европейской (47,4%) [12]. Гомозиготный вариант rs1800795 G/G в большей степени свойственен пациентам молодого возраста, что также не противоречит нашим данным, и ассоциирован с тяжелым течением боли в спине, однако без выраженного дегенеративного поражения позвонков, смежных с дегенеративно-измененным МПД. Согласно данным мета-анализа, аллель rs1800795-G достоверно связан с поражением МПД дегенеративного характера (ОШ 1,38; 95% доверительный интервал (ДИ) 1,16-1,64; p = 0,0002) [17]. В финском эпидемиологическом исследовании наличие генотипа rs1800795 Т/Т ассоциировалось с 3-кратным повышением риска экструзий и боли в спине у трудоспособных лиц молодого возраста [18].
Роль полиморфизмов гена VDR неоднократно продемонстрирована в развитии остеоартрита и остеопороза [19, 20]. Не менее значимым является влияние генотипа VDR на сульфатирование протеогли-канов диска и свойства МПД, а также на формирование боли в спине. Так, гетерозиготный генотип rs1544410 C/T гена VDR ассоциируется с развитием боли в спине в
молодом возрасте и при значительно выраженных дегенеративных изменениях, что не противоречит данным нашей работы. Генотип rs1544410 C/C в большей степени характерен для пациентов старшего возраста и ассоциирован c поражением позвоночника дегенеративного характера. Генотип rs1544410 T/T характерен для здоровых лиц без боли в спине, однако при развитии заболевания в молодом возрасте определяет более тяжелое его течение. Полиморфизм rs1544410-T встречается у 33,9% здоровых людей, чаще всего в популяции евреев аш-кенази (41,7%) и реже всего — в европейской популяции (4,94%) [12]. У пациентов с дегенерацией МПД генотип rs1544410 C/C влиял на прогрессирование заболевания, тогда как T-аллель был протективным [21]. Наличие T-аллеля было связано с тяжестью дегенеративного поражения, включая экструзии МПД [22]. Интересно, что рецессивный гомозиготный тип наследования, как было показано ранее, ассоциирован с более тяжелой деградацией диска, чем доминантный [23].
Полиморфизм rs35068180-6A гена MMP3 встречается у 64,6% здоровых людей, чаще всего в африканской популяции (89,2%), реже всего — в европейской (49,8%) [12]. Носительство аллеля rs35068180-5A гена MMP3 связывают с дегенерацией поясничного диска (ОШ 1,96; 95% ДИ 1,33-2,89) [24]. В китайском исследовании в группе подростков было выявлено, что полиморфизм -1306С/Т (rs243865) гена ММР2 определяет транскрипцию и экспрессию гена и связан с повреждением МПД [25].
По нашим данным, наследственные предпосылки к раннему формированию боли в спине и тяжелому ее течению складываются из наличия гомозиготных генотипов изученных нами полиморфизмов генов IL-1ß (G/G), IL-6 (G/G) и COL1A1 (C/C), что может свидетельствовать о полигенном типе наследования заболевания. Одновременное наличие 2 или 3 неблагоприятных полиморфных вариантов канди-датных генов статистически значимо чаще определялось у пациентов молодого воз-Лечебное дело Z.ZOZ^IJO
раста с показаниями к оперативному лечению (осложненная экструзия МПД). Тяжелое течение заболевания с формированием поясничного стеноза ассоциировалось с генотипом rs1143627 G/G гена IL-1$ и генотипом rs1544410 T/T гена VDR в обеих возрастных группах больных. В контрольной группе 87% здоровых лиц являлись носителями генотипа rs1544410 T/T гена VDR. У 45% пациентов с болью в спине вне зависимости от возраста и проводимого лечения статистически значимо чаще выявлялся генотип C/T.
Заключение
Результаты исследования приближают нас к решению вопроса персонифицированного подхода к терапии боли в спине. Возможность целенаправленного влияния на экспрессию генов с целью эффективной
профилактики дегенеративного поражения МПД у молодых лиц является перспективным направлением предиктивной медицины (профилактическая генная терапия), на шаг опережая репаративные технологии (имплантация аутологичных клеток, выделенных из МПД, имплантация стволовых клеток, комбинации непрямой генной инженерии и тканевой инженерии и др.) в ведении пациентов с болью в спине.
Конфликт интересов. Авторы заявляют, что данная работа, ее тема, предмет и содержание не затрагивают конкурирующих интересов.
Источники финансирования. Авторы заявляют об отсутствии финансирования при проведении исследования.
Со списком литературы вы можете ознакомиться на нашем сайте www.atmosphere-ph.ru
Morphogenetic Features of Degenerative Disk Disease in Young and Middle-aged Patients with Back Pain N.G. Pravdyuk, N.A. Shostak, N.M. Shvyreva, A.V. Novikova, and A.A. Buyanova
Back pain associated with damage to the articular apparatus of spine has one of the leading places in the structure of diseases of musculoskeletal system. Until recently the progression of back pain was associated with an increase in the age of patients, however, degenerative changes in intervertebral disks (IVDs) were detected in adolescents and young people. Genetic factors are one of the possible causes for early manifestation of degenerative disk lesions, the development of extrusions, damage to the articular apparatus of spine, and the appearance of back pain. The aim of the study was to evaluate the associations of polymorphisms of the COL1A1, IL-1P, IL-6, VDR, and MMP3genes with morphological disk changes and instrumental signs of degenerative disk disease in young and middle-aged patients. The study included patients with back pain and IVD extrusion. The genetic assay included the study of polymorphisms of IL-1P (rs1143627), IL-6 (rs1800795), COL1A1 (rs1800012), VDR (rs1544410), and MMP3 (rs35068180) genes. Fragments of IVD removed from patients with extrusions were subjected to histological analysis. The following genotypes were associated with the onset of back pain at a young age: the G/G genotype of IL-1P gene (p = 0.033); the C/C genotype of COL1A1 gene (p = 0.06); as well as the C/T genotype of VDR gene (absent in healthy individuals). For the older age group, back pain was associated with the G/A genotype of IL-1P gene (p = 0.028 for operated subjects and p = 0.03 for patients receiving conservative treatment) and the A/A genotype of COL1A1 gene (r = 0.38; p = 0.02). An indirect correlation was found for C/T genotype of VDR gene and age of pain onset (r = —0.25; p = 0.04). The A/A genotype of COL1A1 gene was not found in young operated patients. Unlike patients with back pain, healthy individuals in the control group carried the homozygous T/T genotype of VDR gene (p < 0.01) and the C/T genotype of VDR was typical for patients with total damage to the vertebral-motor segment, regardless of age. A direct correlation was found between degenerative spinal changes and 5A/5A genotype of MMP3 gene (r = 0.36; p = 0.003) and an indirect correlation was identified for genotype 5A/6A (r = —0.36; p = 0.003). The absence of A-alleles in the IL-1P gene in patients with back pain was associated with Modic type II changes (r = 0.28; p = 0.03). An association was discovered between the G/G genotype of IL-6 gene and clinical and instrumental signs of inflammatory edema, fatty transformation of bone marrow in adjacent vertebral bodies, and IVD extrusion (r = —0.4, p = 0.01). Hereditary prerequisites for the early formation of back pain and its severe course comprised the presence of homozygous variants of IL-1P (G/G), IL-6 (G/G), and COL1A1 (C/C) genes. The simultaneous presence of 2 or 3 unfavorable polymorphic variants of candidate genes was statistically more often determined in young patients with indications for surgical treatment.
Key words: back pain, degeneration, intervertebral disc extrusion, endplates, gene polymorphism, IL-1P (rs1143627), IL-6(rs1800795), COL1A1 (rs1800012), VDR (rs1544410), MMP3 (rs35068180), Modic change.
