CC BY
58
УДК 591.111.1:595.76
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИММУННЫХ КЛЕТОК НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ОТРЯДА COLEOPTERA
Целью данной работы является изучение морфофункциональных характеристик гемоцитов некоторых представителей отряда Coleoptera . Проведенные исследования позволили впервые осуществить типологию, дать морфофункциональные характеристики, а также определить упругость и адгезию к нанозонду мембраны гемоцитов представителей шести видов жесткокрылых..
Ключевые слова: гемоциты, упругость, адгезия.
Введение
Гемоциты насекомых представляют собой комплекс разных типов клеток, отличающихся морфологически и функционально. Гемоциты распознают чужеродные объекты, способны к фагоцитозу, инкапсуляции, коагуляции, обладают цитотоксическими свойствами. Эти защитные реакции проявлялись против болезнетворных организмов, паразитов и других инородных тел, попадающих в гемоцель [1, 2].
Особенности разных типов гемоцитов могут несколько отличаться между видами. В результате гемоциты насекомых остаются не до конца охарактеризованными из-за нехватки проведенных исследований по различным видам. В ряде случаев возникают экономические и этические проблемы с использованием позвоночных животных в биомедицинских экспериментах, поэтому насекомые были предложены в качестве альтернативной биомодели для токсикологических преклинических исследований.
Насекомые широко используются и в других областях биомедицины, в том числе в ней-робиологии [3]. Гематология - неотъемлемая часть преклинических исследований животных, и поэтому, требуется получить наиболее полные знания о гемоцитах насекомых, прежде, чем последние достигнут того же уровня в качестве биомодели, как некоторые позвоночные животные с точки зрения сравнительной клинической патологии. Кроме того, физиологические показатели могут использоваться в целях биоиндикации. Общее физиологическое состояние организма может быть охарактеризовано общим количеством гемоцитов в единице объема и соотношением их типов.
У насекомых выделяют от 3 до 7 типов форменных элементов гемолимфы. Так у представителей отряда Lepidoptera различают от 5 до 6 типов [4, 5, 6, 7], у Hemiptera 3-8 типов [8, 9], в гемолимфе Rhynchophorusferrugineus (Coleoptera) выделено 6 типов гемоцитов [10].
Ratcliffe и Price, исследуя гемолимфу 28 видов насекомых, идентифицировали 6 типов клеток: прогемоциты, плазматоциты, оеноциты, сферулоциты, тромбоциты, гранулоциты, в зависимости от размера, формы, способности к фагоцитозу и наличия гранул в цитоплазме [11]. В свою очередь М. Брехелин и Д Захари [12] различают 9 типов гемоцитов: прогемоциты, плазматоциты, оеноциты, сферулоциты, тромбоциты, гранулоциты GH1, GH2, GH3, GH4. Гра-нулоциты были названы иммуноцитами за их участие в фагоцитозе и инкапсуляции.
Цель данного исследования - охарактеризовать морфологию гемоцитов некоторых представителей отряда Coleoptera, выделить их типы, исследовать упругость цитоплазматиче-ской мембраны и адгезию зонда к мембране клетки.
Объекты и методы исследования
В исследованиях использованы представители видов Щелкун черный (Athous niger), Коровка семиточечная (Coccinella septempunctata), Трещалка лилейная (Lilioceris lilii), Жук-олень (Lucanus cervus), Хрущ майский восточный (Melolontha hippocastani), Жук-носорог (Oryctes nasicornis).
Исследования проведены с применением световой и сканирующей зондовой микроскопии. Гемолимфу насекомых набирали прикосновением предметного стекла к поперечному разрезу ноги и оставляли до полного высыхания препарата. Для изучения морфологических
А.А. Присный, Е.А. Гребцова
Белгородский государственный национальный исследовательский университет, Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85
E-mail: Prisny@bsu.edu.ru
особенностей гемоцитов использовали модифицированную окраску по Романовскому. Клетки фиксировали этиловым спиртом в течение 3-4 минут, затем препарат отмывали фосфатным буфером (pH 7.2). Окраску проводили азур-эозином по Романовскому 10 минут, после чего так же отмывали буфером. Препараты фотографировали и проводили линейные измерения с помощью анализатора изображений «Видео-Тест» (ООО «Микроскоп-Сервис», г. Санкт-Петербург).
Данные по свойствам упругости и адгезии были получены с использованием сканирующего зондового микроскопа Интегра Вита NT-MDT в режиме атомно-силовой спектроскопии при наложении нагрузки в 10 локальных участках клеточной поверхности. Полученные «силовые кривые» обрабатывали с помощью программного обеспечения «Ef3» (NT-MDT, Зеленоград). Так же на полученных сканах измеряли линейные размеры клеток, результаты обрабатывали при помощи программного обеспечения «Nova 1.0.26 Build 1397» (НТ МДТ).
Полученные данные обрабатывали с использованием методов вариационной статистики.
Результаты и их обсуждение
У каждого из исследованных видов насекомых было выделено по 3 типа клеток.
Тип 1 - наиболее часто встречающиеся клетки, округлой или овальной формы (рис. 1). Цитоплазма содержит большое количество гранул. Образуют псевдоподии типа филоподий. Ядро крупное, расположено в центре. Средняя длина клеток составила 11.04±2.65 мкм, ширина 9.15±2.4 мкм, 1.28±о.43 мкм.
ит.
Рис. 1. Гемоцит типа 1
Тип 2 - этот тип клеток характеризуется наименьшими размерами. Форма круглая, псевдоподий не образуют (рис. 2). Ядро крупное, чаще всего занимает всю клетку. Средняя длина клеток составила 5.51±о.73 мкм, ширина 4.82±о.97 мкм, высота о.98±о.з мкм.
Тип 3 - клетки веретеновидной или овальной формы. Ядро в виде эллипса, размещено в центре. Могут образовывать псевдоподии. Средняя длина клеток составила 10.97±3.34 мкм, ширина 4.82±2.оо мкм, высота 1.3±0.34 мкм (рис 3).
Для определения особенностей деформационных характеристик гемоцитов было проведено изучение упругих свойств мембраны с помощью атомно-силовой микроскопии (табл. 1). Упругость мембраны определяется особенностями липидного состава и организацией белковых структур.
Обращают на себя внимание сравнительно высокие значения ошибки средней. Это связано с тем, что разные участки клеток имеют разные показатели упругости из-за особенностей плазматической мембраны и локализации внутриклеточных органоидов.
Адгезия - прилипание друг к другу находящихся в контакте поверхностей, за счет электростатических сил, природа которых разная для разных материалов. Причина адгезии - электростатические силы на границе раздела двух тел, возникающие благодаря образующемуся в контакте двойному заряженному слою. В ходе исследования были определены показатели силы адгезии клеточной мембраны различных типов гемоцитов к нанозонду (табл. 2).
Рис. 2. Гемоцит типа 2 Рис. 3. Гемоцит типа 3
Таблица 1
Упругость гемоцитов у представителей отряда Coleoptera (кПа)
Типы клеток Athous niger Coccinella septempunctata Lilioceris lilii Lucanus cervus Melolontha hippocastani Oryctes nasicornis
Тип 1 16.0±4.1 27.6±8.9 17.5±3.1 27.1±7.3 22.1±9.2 14.8±4.4
Тип 2 20±2.2 24.2±3.4 20.5±3.3 22.2±9.7 23.1±4.8 21.2±3.2
Тип 3 11.4±1.8 25±5-6 10.3±1.6 24.2±4.9 24.2±8.3 16.1±4.9
Таблица 2 Сила адгезии гемоцитов у представителей отряда Coleoptera (нН)
Типы клеток Athous niger Coccinella septempunctata Lilioceris lilii Lucanus cervus Melolontha hippocastani Oryctes nasicornis
Тип 1 14.2±3.4 49.7±9.7 67.2±21.9 60.2±27.2 124.9±41.5 30.06±4.8
Тип 2 15.6±2.8 48.8±9.3 40.2±9.1 42.2±13.4 146.3±76.3 35.8±4.3
Тип 3 16.2±3.1 45.0±8.0 36.1±5.3 48.5±8.8 100.8±49.1 36.6±8.4
Заключение
В результате проведенных исследований осуществлена типология и дана морфофунк-циональная характеристика гемоцитов трех клеточных типов для представителей шести видов, принадлежащих к отряду Coleoptera.
Показатели упругости и адгезии клеточной мембраны к нанозонду характеризуют иммунные клетки насекомых как потенциально функционально активные.
Список литературы
1. Brookman J.L., Ratcliffe N.A., Rowley A. F. Optimization of a monolayer phagocytosis and its applications for studying the role of prophenoloxidase system in the wax moth, Galleria mellonella // Journ. of Insect Physiology. - 1989. - Vol. 34. - P. 337-346.
2. Ratcliffe N.A., Rowley A.F. and Fitzgerald, S. W., Invertebrate immunity: basic concepts and recent advances // International Review of Cytology. - 1985. - Vol. 97. - P. 183-349.
3. Rubinsztein D. C. Lessons from animal models of Huntington's disease // Trends Genet. - 2002 -Vol. 18 - P. 202-209.
4. Ayvali C., Cul N. Surface ultrastructure of the larval haemocytes of turnip moth Agrotis segetum Denis and Shiff. Lepidoptera: Noctuidae // Commun. Fac. Sci. Univ. Ank. Serie C. - 1988. - Vol. 6. - P. 199-204.
5. Bartninkaite I. Dynamics of the hemolymph structure of the nettle moth in various biotopes and its influence on the trophic relations of the insect // Acta Zoologica Lituanica. Entomologia. - 1998. - Vol. 8. - № 3.
6. Bartninkaite I., Ivinskis P., Rimsaite J. Scarce Large Blue (Maculinea teleius) hemolymph studies in different populations of Lithuania // Ekologia. - 2006. - № 4. - P. 34-39.
7. Falleiros A.M. F., Gregorio E.A., Hemocitos fagocitarios em larvas de Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera, Pyralidae) // Revista Brasileira de Zoologia. - 1995. - Vol. 12. - P. 751-758.
8. Berger J., Slavickova K. Morphological Characterization of Hemocytes in the Adult Linden Bug, Pyr-rhocoris apterus (L.) (Heteroptera) // Zool. Stud. - 2008. - Vol. 47. - P. 466-472.
9. Hypsa V., Grubhoffer L. Two hemocyte populations in Triatoma infestans: ultrasturctural and lectin-binding characterization // Folia parazitologica. - 1997. - Vol. 44. - P. 62-70.
10. Ebrahimi L., Niknam G. Hemocyte responses of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemli-
neata, and the greater wax moth, Galleria mellonella, to the entomopathogenic nematodes, Steinernema feltiae and Heterorhabditis bacteriophora // Journal of Insect Science. - 2011. - Vol. 11. - № 75. - P. 8-21.
11. Ratcliffe N.A., Rowley A.F., Insect responses to parasites and other pathogens // Florida: C. R. C. Press. - 1987. - P. 123-254.
12. Brehelin M., Zachary D. Insect haemocytes: a new classification to rule out the controversy // Heidelberg: Spring Verlag. - 1986. - P. 37-48.
FEATURES OF IMMUNE CELLS OF SOME REPRESENTATIVES OF COLEOPTERA
A.A.Prisny,E.A.Grebcova
Belgorod State National Research University, Pobedy St, 85, Belgorod, 308015, Russia
E-mail: Prisny@bsu.edu.ru
The purpose of the given work is studying characteristics cells some representatives of group Coleoptera. The conducted researches have al- lowed to carry out for the first time typology, to give characteristics, and al- so to define elasticity and adhesion to nanozond membranes cells repre- sentatives of six kinds of Coleoptera.
Keywords: haemocytes, elasticity, adhesion.
