CC BY
39
УДК 615.03: 616-092.9
А.В. Машанов Г.Г. Юшков В.В. Бенеманский М.М. Бун В.Г. Соболев М.Г. Воронков 2, А.Ю. Федорин 3
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ОДНОКРАТНОМ ВВЕДЕНИИ РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ ЦИНКСОДЕРЖАЩЕГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА «ЦИТРИМИН»
1 Ангарская государственная техническая академия (Ангарск)
2 Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского (Иркутск) 3 Центр внедрения технологий «Инноком» (Иркутск)
Получены данные о токсическом действии различных доз цинксодержащего фармакологического вещества «Цитримин». Токсическое действие проявилось в изменении основных морфологических, биохимических и иммунологических показателей. Полученные данные важны для. выбора дозы «Цитримина» как антидота.
Ключевые слова: «Цитримин», токсикологическое исследование, антидот
MORPHOFUNCTIONAL CHANGES IN EXPERIMENTAL ANIMALS AT SINGLE INTRODUCTION OF VARIOUS DOZES OF PHARMACOLOGICAL SUBSTANCE «CITRIMIN» CONTAINING ZINC
A.V. Masharav ‘, G.G. Yushkov 2, V.V. Benemanskiy ‘, M.M. Boon ‘, V.G. Sobolev ‘,
M.G. Voronkov 2, A.Yu. Fеdоrin 3
1 Аngаrsk State Tеchnicаl Аcаdеmy, Angarsk
2 Irkutsk Institute of Chemistry named after A.E. Favorsky, Irkutsk
3 Centre of Introduction of Technologies «Innocom», Irkutsk
We received, data about toxic action of various dozes of pharmacological substance «Citrimin» containing zinc. Toxic action was expressed, in change of basic morphological, biochemical and immunological indices. Findings are significant for choice of doze of «Citrimin» as antidote.
Key words: «Citrimin», toxicological research, antidote
Отчетливая широта распространения цинксодержащих средств на рынке фармацевтической продукции при недостаточном представлении о токсичности данных соединений требует выполнения необходимых исследований в целях внедрения действительно малоопасных и эффективных препаратов. К ним, в частности, относится и цинксодержащее фармакологическое вещество «Цитримин».
Цель работы: изучение динамики основных морфологических, биохимических, иммунологических показателей при однократном введении различных доз цинксодержащего фармакологического вещества «Цитримин».
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлся «Цитримин» — перспективный антидот смертельного отравления этанолом. Препарат представляет собой 2,8,9-тригидроцинкатран — внутримолекулярный трициклический комплекс трис(2-гидроксиэтил)амина (триэтаноламина) с ацетатом цинка ^п), отвечающий формуле (СН3СОО)^п • [(СН2СН2ОН)3^, плохо растворимый в воде, растворимый в этаноле (5 % об.) при нагревании. Соотношение триэтаноламина с ацетатом Zn составляет 1 : 1. Исследуемый препарат (порошок белого цвета) был синтезирован и предоставлен центром внедрения технологий «Инноком». Подлинность
химической структуры препарата подтверждена элементным анализом и ЯМР-спектроскопией.
Работа проведена в соответствии с «Методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» [11].
Эксперименты по изучению токсического эффекта «Цитримина», введенного в различных дозах, были выполнены в осенне-зимний период года на 240 белых нелинейных крысах-самцах собственного разведения массой 180 — 220 г (ветеринарное удостоверение 238 № 0018304 от 07.09.09 г.). На протяжении всего эксперимента животные содержались в условиях вивария.
Для испытаний выбран внутрижелудочный однократный способ введения препарата крысам как наиболее близкий к предполагаемому способу введения в организм человека в клинической практике. Для введения были выбраны следующие дозы: 4 г/кг, 0,4 г/кг, 0,04 г/кг, 0,004 г/кг. В расчете на каждую дозу набирались 5 подопытных и 5 контрольных групп по 6 животных в каждой. Контрольным животным вводился этанол (5 % об.). Объем вводимых растворов не превышал 1 мл (для крысы массой 200 г).
Подопытных и контрольных животных выводили из эксперимента путем цервикальной дислокации спинного мозга в шейном отделе позвоночника под эфирным наркозом на 1-е, 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки после введения «Цитримина» с соблюдением
Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным.
Материалом для гистологических и гистохимических исследований выбраны головной мозг, легкие, печень, желудок, почки подопытных и контрольных крыс. Органы фиксировали в 10% нейтральном формалине, осуществляли проводку и заливку в парафин + воск. С каждого блока получали серийные срезы толщиной 5 мкм и окрашивали их гематоксилин-эозином [8]. В нефиксированных срезах печени, приготовленных на криостате, гистохимически определяли по известным методикам [10] содержание общих липидов, гликогена, активность щелочной фосфатазы (ЩФ), сукцинат-дегидрогеназы (СДГ), моноаминоксидазы (МАО) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
Оценка функций нейтрофилов (лейкоцитов) определялась по их фагоцитарной способности в отношении бактерий Staphylococcus Aureus с подсчетом процента фагоцитоза, величин фагоцитарного числа (ФЧ) и фагоцитарного индекса (ФИ) [1, 3]. В сыворотке крови определяли уровни количественных маркеров процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) — ДК [4], МДА (ТБК-активных продуктов) [5, 7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Введение подопытным крысам «Цитримина» (DL50 — 5167 ± 1 000 мг/кг (мыши), 5 500 ± 1 250 мг/кг (крысы)) в дозе 4 г/кг не приводило к их гибели на протяжении 21 суток наблюдения.
На вскрытии на 1-е и 3-и сутки лишь со стороны печени отмечались небольшие изменения в виде утолщения и закругления ее краев, неравномерность окраски. Участки темно-вишневого цвета чередовались с коричневой окраской. При микроскопическом исследовании у животных, усыпленных на 3-и сутки, выявили следующие изменения: в печени — очаги умеренно выраженного полнокровия центральных вен и синусоидов. Цитоплазма гепатоцитов выглядела зернистой, что указывает на проявление умеренной белковой дистрофии. Клетки Купфера были набухшими, но количество их не увеличено. Эпителий желчных протоков оставался неизмененным, непролиферированным; в портальных трактах очагов воспалительной инфильтрации не выявлено.
В легких встречались сосуды среднего калибра с умеренно выраженным периваскулярным отеком. В головном мозге в области коры височной доли встречались участки с гиперхромными ядрами нейронов, а также с проявлениями слабовыражен-ного перицеллюлярного и периваскулярного отека глии. В средних структурах головного мозга эти проявления были более выраженными. Слизистая желудка выглядела неизмененной, в почках изменений также не выявлено.
На 7-е сутки после введения «Цитримина» на вскрытии отмечалась более бледная (светлокоричневая) окраска печени. При микроскопическом исследовании в печени выявлено выраженное полнокровие сосудов в системе портальных вен,
очаги полнокровия синусоидов. Гепатоциты — с явными признаками белковой и гидропической дистрофии, вплоть до полного отсутствия цитоплазмы (вид баллонной дистрофии), с гиперхромными ядрами. Клетки Купфера увеличены в размерах. Изменения в головном мозге аналогичны тем, которые были отмечены на 3-и сутки. Слизистая желудка, паренхима почек и легкие — без видимых изменений.
На 21-е сутки лишь в печени отмечалось полнокровие центральных вен и очаги расширенных синусоидов со скоплением эритроцитов. Гепатоциты — с умеренными проявлениями белковой дистрофии с просветлением перинуклеарных зон. Головной мозг, легкие, слизистая желудка — без изменений.
В печени ЩФ локализована в клетках эндотелия вокруг портальной и центральной вен как в синусоидах, так и в желчных канальцах. При гистохимическом исследовании печени на 1-е сутки выявлено увеличение активности ЩФ на 2 — 3 балла, снижение содержания гликогена у части животных на 2 — 3 балла, снижение активности МАО на 1 балл, увеличение содержания общих липидов у 3 из 6 животных на 1 балл. Активность СДГ и ЛДГ была на уровне контроля.
В последующие сроки исследования (3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки) отмечалась повышенная активность ЩФ с ее дальнейшим убыванием и практической нормализацией к 21-м суткам. Активность СДГ, МАО и ЛДГ была на уровне контроля. Содержание гликогена было снижено у 2 животных на 1 балл (14-е сутки).
Морфологические изменения внутренних органов подопытных крыс при введении «Цитрими-на» в дозе 0,4 г/кг имели такую же картину, как и при введении препарата в дозе 4 г/кг, но в меньшей степени выраженности.
Следует обратить внимание на повышение активности ЩФ в желчных капиллярах. Эта тенденция отмечалась при воздействии «Цитримина» в дозе как 4 г/кг, так и 0,4 г/кг, повышение активности было очень выраженным (до 3 баллов) по отношению к контролю.
Морфологических и гистохимических (в печени) изменений внутренних органов при воздействии «Цитримина» в дозах 0,04 и 0,004 г/кг не выявлено.
Данные патоморфологического исследования позволяют заключить следующее: при обнаруженной белковой (зернистой) дистрофии (БЗД) размеры гепатоцитов увеличены, они выглядели набухшими, в цитоплазме повышено содержание воды. Зернистость цитоплазмы обусловлена резким набуханием митохондрий, отмечается дезорганизация их крист, наблюдается расширение канальцев эндоплазматической сети, появление мелких вакуолей и дегрануляция в ее зернистой части, инволюция пластинчатого комплекса Голь-джи, что привело к появлению светлых гепатоци-тов. Повышается активность ЩФ в пограничных мембранах гепатоцитов с увеличением содержания
общих липидов и снижением гликогена. Белковая (зернистая дистрофия) — типичное изменение гепатоцитов при действии алкоголя и ряда медикаментов, характеризуется как адаптивная реакция клетки.
Прогрессирование БЗД, дальнейшая гидратация и светлое набухание клетки обозначают собой появление гидропической (в т.ч. баллонной) дистрофии (ГД). Гепатоциты при ГД увеличены в
2 раза и более, их цитоплазма кажется оптически пустой, коагуляты цитоплазматических белков определяются у клеточной мембраны и в перину-клеарной зоне. Ядра полиморфны, в них наблюдаются отек и набухание хроматина, его уплотнение и маргинация, появление вакуолей. Границы клеток подчеркнуты. Снижается содержание гликогена, повышается активность ЩФ [6].
Следует отметить и то, что ЩФ — металлофер-мент, в состав его активного центра входит атом Zn. Каждый мономер содержит три металлосвязывающих центра. Лишенный ионов Zn фермент теряет активность, но восстанавливает ее после добавления металла [12]. Одной из причин роста активности ЩФ в данном эксперименте стало наличие Zn в составе «Цитримина». Также известно, что ЩФ принимает участие в процессе утилизации гликогена.
Частичное угнетение активности МАО на 1-е сутки при дозах «Цитримина» 4 и 0,4 г/кг обусловлено окислением SH-групп фермента продуктами ПОЛ ДК и МДА [2], уровни которых существенно превышали контрольные показатели (4 г/кг: ДК, контроль — 0,11 ± 0,01, ед. опт. пл./мл при AD = 272 нм, опыт — 0,31 ± 0,05 нмоль/мл (p < 0,01); МДА, контроль — 5,60 ± 0,47 нмоль/мл, опыт — 8,03 ± 0,35 нмоль/мл (p < 0,01); 0,4 г/кг: ДК, контроль —
0,25 ± 0,03 нмоль/мл, опыт — 0,30 ± 0,06 нмоль/мл; МДА, контроль — 6,44 ± 0,56 нмоль/мл, опыт — 8,20 ± 0,31 нмоль/мл (p < 0,05)).
Наши наблюдения свидетельствовали о том, что при введении «Цитримина» в дозах 4 г/кг (фагоцитоз: контроль — 64 ± 2,6 %, опыт — 93 ± 1,8 % (р < 0,001); ФЧ: контроль — 1,79 ± 0,08 %, опыт — 5,78 ± 1,02 % (р < 0,05); ФИ: контроль — 1,13 ± 0,04 %, опыт — 5,27 ± 1,16 % (р < 0,05)) и 0,4 г/кг (фагоцитоз: контроль — 59 ± 2,0 %, опыт — 85 ± 1,8 (р < 0,001)) интенсификация процесса фагоцитоза на 1-е сутки наблюдения сопровождается повышенным расходом гликогена. Гликоген является важным источником энергии, обеспечивающим физиологические функций лейкоцитов, в т.ч. их участие в фагоцитарной реакции организма. Уменьшение содержания гликогена в клетках в процессе фагоцитоза происходит за счет его интенсивной биотрансформации [9].
В условиях нашего эксперимента активность СДГ, ключевого регуляторного фермента, наиболее мощного сукцинат-оксидазного пути энергопродукции, на протяжении всего периода наблюдения находилась на уровне контроля. Активность же ЛДГ, ключевого фермента углеводного обмена, также не превышала контрольных значений, за
исключением 1-х суток наблюдения при дозе «Цитримина» 0,4 г/кг. Таким образом, «Цитримин» практически не оказывает влияния как на энергетический обмен в целом, так и на окислительные процессы в ткани печени в частности. Наличие Zn в составе «Цитримина» не оказало стимулирующего действия на ЛДГ, которая так же, как и ЩФ, является цинксодержащим ферментом.
По морфологическим показателям дозы «Цитримина» могут быть охарактеризованы следующим образом: 4 г/кг — действующая, 0,4 г/кг — пороговая, 0,04 и 0,004 г/кг — недействующие. Полученные данные важны для выбора дозы «Цитримина» как антидота.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеева О.Г., Волкова А.П. Изучение фагоцитарной реакции нейтрофилов крови в токсикологических экспериментах // Гигиена и санитария. — 1966. — № 8. — С. 70 — 75.
2. Брусова Е.Г. Флюориметрический скополетин-пероксидазный метод определения активности моноаминоксидазы в тромбоцитах человека // Бюлл. эксперимент. биол. и мед. — 1983. - Т. ХСУ1, № 12. - С. 116-118.
3. Волкова А.П., Тернов В.И. Методика исследования фагоцитарной реакции нейтрофилов крови у мелких лабораторных животных // Лабораторное дело. - 1965. - № 12. - С. 712-715.
4. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лабораторное дело. - 1983. - № 3. - С. 33-36.
5. Гончаренко М.С., Латинова А.М. Метод оценки перекисного окисления липидов // Лабораторное дело. - 1985. - № 1. - С. 60-61.
6. Карташова О.Я., Терентьева Л.А., Залцма-не В.К., Максимова Л.А. Патология гепатоцитов при вирусных и токсических повреждениях печени // Вестн. АМН СССР. - 1983. - № 11. -С. 74-81.
7. Коробейникова Э.Н. Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой // Лабораторное дело. - 1989. - № 7. - С. 8-10.
8. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - Л. : Медицина, 1969. - 424 с.
9. Назырова Д.Р., Вахидов Б.В. Содержание гликогена в лейкоцитах крови в процессе фагоцитоза у больных острой дизентерией и вирусным гепатитом // Лабораторное дело. - 1982. - № 7. -С. 13-15.
10. Пирс Э. Гистохимия. - М., 1962. - 962 с.
11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общ. ред. члена-корреспондента РАМН, проф. Р.У. Хабриева; 2-изд., перераб. и доп. -М. : ОАО Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.
12. Творогова М.Г., Титов В.Н. Щелочная фосфатаза: методические приемы исследования и диагностическое значение (обзор литературы) // Лабораторное дело. - 1991. - № 6. - С. 10-17.
Сведения об авторах
Машанов Антон Владимирович - аспирант НИИ биофизики Ангарской государственной технической академии (665830, г. Ангарск, ул. Партизанская, д. 1, а/я 4380; тел.: 8 (3955) 51-29-79, факс: 8 (3955) 52-34-69; e-mail: [email protected]). Юшков Геннадий Георгиевич - кандидат медицинских наук, профессор, заместитель директора по научной работе НИИ биофизики Ангарской государственной технической академии.
БенеманскийВиктор Викторович - доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник НИИ биофизики Ангарской государственной технической академии.
Бун Марк Михайлович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник НИИ биофизики Ангарской государственной технической академии.
Соболев Виктор Григорьевич - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник НИИ биофизики Ангарской государственной технической академии.
Воронков Михаил Григорьевич - академик РАН, руководитель группы элементоорганических соединений при советнике РАН Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН.
Федорин Андрей Юрьевич - директор центра внедрения технологий «Инноком».
