CC BY
71
УДК 591.169:577.344
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ТУЧНЫХ КЛЕТОК КОЖИ МЫШЕЙ В ХОДЕ ЗАЖИВЛЕНИЯ
ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЫ
О.В. Столбовская1, Е.Е. Лаврушина2, Е.С. Панюшева1, Р.М. Хайруллин1
Ульяновский государственный университет, 2Димитровградский технический колледж
В данном исследовании представлены результаты изучения морфофункционального состояния тучных клеток в ходе репаративной регенерации ожоговых ран у мышей в условиях воздействия светодиодного излучения красного диапазона.
Ключевые слова: тучные клетки, регенерация ожоговых ран кожи мышей, светодиодное излучение красного диапазона.
Введение. Кожа формирует внешнюю поверхность тела, обеспечивает поддержание целостности организма. Повреждение кожи влечет за собой развитие разнообразных патологических состояний. Термический ожог кожи - один из видов травмы, возникающей при действии на ткани организма высокой температуры (пламя, кипяток и др.) [12, 13]. Отличительными особенностями процесса заживления ожоговых ран являются торможение лейкоцитарно-макрофагальной реакции на ранних стадиях травматического воспаления, вторичное углубление деструктивных изменений в ожоговой ране, длительная задержка нормализации сосудисто-тканевой проницаемости, угнетение функциональной активности клеток лимфоидно-гистиоцитар-ного и фибробластического рядов [3, 6, 10, 13]. Ожоговая травма часто сопровождается развитием деструктивных процессов в лимфо-идных органах [1, 4, 11]. В клинической практике при комплексном лечении последствий ожоговых травм наряду с лекарственными препаратами используется фототерапия с применением низкоинтенсивного лазерного излучения красной и инфракрасной частей спектра, светодиодного излучения красного диапазона (СДИКД) [2, 5, 6, 9, 10]. СДИКД обладает хорошей проницаемостью, выраженными биологическими эффектами на различные клеточные и тканевые структуры, что определяет успех его применения при коррекции функциональных нарушений и лечении пато-
логических процессов [6, 7, 9, 10, 16]. Эффективность фототерапии СДИКД при заживлении раневого регенерата определяется также и локализацией места облучения. Так, при прямом воздействии красного света на ожоговую рану кожи и при опосредованном действии СДИКД на проекцию тимуса регенерация сопровождается сокращением сроков формирования полноценной соединительной ткани, изменениями функциональной активности клеток соединительной ткани на отдельных звеньях регенерационного процесса [1, 8, 15]. Для понимания механизмов, лежащих в основе модулирующего влияния красного излучения на процессы репаратив-ной регенерации соединительной ткани ожоговой раны кожи, важным является изучение функциональной активности тучных клеток. Тучные клетки синтезируют и секретируют биологически активные вещества, с помощью которых регулируется проницаемость капилляров и гомеостаз соединительной ткани на протяжении всего процесса заживления ран
[11, 13, 14].
Цель исследования. Сравнительное изучение реакции тучных клеток раневого ожогового регенерата в ходе заживления у мышей при различных способах воздействия СДИКД: непосредственно на ожоговую рану и чрескожно на область проекции тимуса.
Материалы и методы. Для нанесения ожоговой травмы применялся термокоагулятор. Подаваемое на него напряжение регули-
ровалось с помощью трансформатора. Температура нагрева обжигающей поверхности (пластинки размером 1x5 мм) во всех опытах составляла 360±20 °С. За двое суток до нанесения контактного ожога животным проводили депиляцию участков кожи с помощью сернистого натрия, а затем под нембутало-вым наркозом моделировали термическую рану в центре спины (площадью 5 мм2 каждая). Время контакта обжигающей пластинки было выбрано экспериментально и составило 2 с. Термическое воздействие в выбранном диапазоне приводило к поражению кожи, сходному с ожогом Шб степени у человека [8, 12], с формированием плотного струпа белого цвета, отчетливо заметного на фоне интактной кожи. При этом развивался некроз, поражающий все слои и структуры дермы.
В качестве источника СДИКД нами использовался прибор, излучающим устройством которого являются арсенид-галлий-алюминиевые кристаллы красного спектра свечения с длиной волны 0,62-0,68 мкм, помещенные в пластмассовый корпус типа «карандаш», в сочетании с блоком питания. Источник характеризуется следующими параметрами: средняя мощность излучения -2,5 мВт; импульсная мощность излучения -5 мВт; частота повторения импульса - 50 Гц; длительность импульса - 5 мс.
При определении дозы светотерапии учитывались средняя мощность излучения источника (мВт), диаметр светового пятна, попадающего на рану или кожу (см), и время (экспозиция), в течение которого проводилось облучение (с) [8, 15]. Плотность мощности вычисляли по формуле ПМ = W / (пг2), где ПМ - плотность мощности излучения, мВт/см2; W - средняя мощность излучения, мВт; п = 3,142; г - радиус пятна, см. Плотность энергии (ПЭ), выраженную в мДж/см2, рассчитывали по формуле ПЭ = ^ / (пг2)) • ^ где t - время облучения, с. Суммарная доза облучения (Д, мДж/см2), полученная животными, определялась путем умножения дозы за одну процедуру на количество процедур (п), т.е. Д = ПМ • t • п.
Животные были разделены на 4 группы: 1-ю группу (интактную) составляли животные, не подвергавшиеся никаким экспери-
ментальным воздействиям, 2-ю группу (контрольную) - животные, которым имитировалось облучение ожоговой раны при выключенном источнике красного света (имитационный контроль), 3-ю - животные, у которых область раны подвергалась облучению красным светом, 4-ю - животные с ожоговыми повреждениями, у которых чрезкожному воздействию изучаемого излучения подвергалась область проекции тимуса.
Воздействие светом осуществлялось ежедневно с 800 до 1000 в течение 28 дней. Время облучения СДИКД области ожогового повреждения (для животных 2-й и 3-й экспериментальных групп) определялось опытным путем и составило 2 мин [8, 15]. Поскольку при прохождении через неповрежденную кожу в условиях эксперимента теряется до 75 % мощности излучения [6], то для 4-й и 5-й экспериментальных групп животных нами было решено увеличить время экспозиции света на область проекции тимуса до 4 мин. Весь период эксперимента животные содержались в идентичных условиях вивария и имели одинаковый рацион питания.
ПМ светодиодного излучения для животных экспериментальных групп была одинаковой и составляла 1,41 мВт/см2, ПЭ для животных 3-й группы составляла 169,8 мДж/см2, для 4-й и 5-й групп - 338, 4 мДж/см2.
Выведение животных из эксперимента для проведения гистологических исследований производили на исходе 3, 5, 9, 11, 15, 21, 28-х сут. В качестве объекта исследования были взяты участки кожи с нанесенной травмой. Для выявления тучных клеток в соединительной ткани регенерата кожи использовали модифицированный способ окраски азуровым красителем [8]. Для каждого препарата тканевые базофилы подсчитывались в 20 полях зрения с последующим пересчетом на площадь одного поля зрения, которое было принято за единицу. Подсчитывались все тучные клетки, и отмечалось количество каждого типа мастоцитов (I, II, III, VI). Для характеристики степени активности в целом тучноклеточной популяции определяли средний индекс дегрануляции (КД): КД = Мп, где п - общее количество тканевых базофилов, N - число дегранулированных форм [8]. Все
эксперименты проводились в соответствии с «Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755, а также положениями Хельсинкской декларации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.
Оценку статистической значимости полученных данных проводили по ^критерию Стьюдента, достоверность различий определяли по критерию Фишера-Стьюдента (Statistica 6).
Результаты и обсуждение. Тучные клетки характеризуются выраженным полиморфизмом, который проявляется в значительной вариабельности их размеров, формы, химического состава содержимого гранул в за-
висимости от функционального состояния клеток. В соответствии с классификацией В.В. Серова и А.Б. Шехтера [3] выделяют следующие типы тучных клеток (рис. 1):
I - относительно мелкие клетки с ортохроматической зернистостью при окраске то-луидиновым синим;
II - более крупные клетки с обильной ме-тахроматической зернистостью;
III - клетки с выраженной дегрануляцией и большим количеством гранул в межклеточном веществе, не имеющие четких контуров, с отчетливо просматриваемым ядром;
IV - опустошенные в результате секреции тучные клетки, которые почти или совсем не содержат гранул, имеют слабую гомогенную окраску и хорошо заметное ядро.
Рис. 1. Дегрануляция тучных клеток в глубоких слоях предсуществующего дефекта (окраска азур-П-эозином; микрофото, *1000): А - клетки II типа; Б - клетки III типа; В - клетки-тени IV типа
Все перечисленные типы клеток были обнаружены нами в коже интактных животных. Соотношение между клетками различных типов составляло соответственно 8, 30, 37 и 23 %. Тучные клетки располагались преимущественно небольшими группами или цепочками вдоль кровеносных сосудов, а в межсосудистых участках - обособленно или группами по 3-5 клеток. Количество клеток на исследуемой площади составляло 94,310±1,727. Коэффициент дегрануляции (отношение количества дегранулированых форм к общему количеству клеток) составлял 0,62±0,01 усл. ед. (табл. 1, рис. 1, 4).
У животных контрольной группы на 3-и сут после нанесения ожоговой травмы наблюдалась массовая дегрануляция и гибель тучных клеток. Количество последних в этот период было минимальным и составляло 34,110±2,214, КД составлял 0,850±0,027. Следует отметить, что клетки IV типа принимали к этому времени вид «теней»: они утрачивали зернистость, имели бледно-голубую цитоплазму и бледно окрашенное ядро. В течение последующих 6-и дней происходило постепенное восстановление общего числа тучных клеток, и на 9-е сут эксперимента было отмечено превышение нормы на 30 % (табл. 1, рис. 4).
Таблица 1
Коэффициент дегрануляции тучных клеток, усл. ед.
Сроки наблюдения, сут Группы животных
1-я (интактная) 2-я (контрольная) 3-я (облучение раны СДИКД) 4-я (облучение тимуса с нанесением раны)
3-и 0,62±0,01 0,850±0,027* 0,800±0,012*° 0,760±0,025*0+
5-е 0,840±0,025* 0,860±0,028*° 0,870±0,009
9-е 0,770±0,012* 0,900±0,009*° 0,870±0,004+
11-е 0,730±0,014* 0,790±0,015*0 0,820±0,016*0+
15-е 0,700±0,015* 0,830±0,013*0 0,740±0,0100+
21-е 0,670±0,021* 0,750±0,019*0 0,710±0,011*0+
28-е 0,640±0,032* 0,620±0,016*0 0,650±0,011*+
Примечание. * - достоверные отличия от показателей интактных животных (р<0,05); 0 - достоверные отличия от показателей животных контрольной группы (р<0,05); + - достоверные отличия от показателей животных, на рану которых воздействовали светодиодным излучением красного спектра света (р<0,05).
На 11-е сут наблюдалось максимальное для данной группы увеличение этих показателей, среднее количество тканевых базофи-лов составляло 156,20±4,862. При этом удельное количество активно дегранулирую-щих форм оставалось выше среднего количества клеток у животных интактной группы. Коэффициент дегрануляции на 9-е и 11-е сут составлял соответственно 0,770±0,012 и 0,730±0,014. В этот период отмечалось увели-
чение числа клеток I и II групп (рис. 1, 3, 4).
Клетки-тени выявлялись у животных контрольной группы до 15-х сут эксперимента, при этом количество их постепенно уменьшалось с 87 до 7 %. Примечательно, что в этот период, как и во все предшествующие сроки наблюдения, тучные клетки отсутствовали в замещающей раневой дефект грануляционной ткани, располагаясь в прилегающих к ней участках.
Рис. 2. Коэффициент дегрануляции тучных клеток в различные периоды раневого процесса, усл. ед.
Спустя 15 сут после нанесения травмы количество тучных клеток вокруг зоны раны уменьшилось, в среднем на единице площади их количество составляло 99,210±2,905, еди-
ничные клетки выявлялись в глубоких слоях реорганизующейся соединительной ткани.
В течение последней недели эксперимента количество тучных клеток на исследуемой
площади оставалось на уровне показателей животных интактной группы, а доля активно дегранулирующих форм в популяции лишь незначительно превышала их.
Снижение общего числа тканевых базо-
филов в области раневого дефекта и их массовая дегрануляция отмечались также у животных 3-й и 4-й экспериментальных групп, однако характер изменений имел некоторые особенности (табл. 1, рис. 2-4).
Рис. 3. Тучные клетки с различной степенью дегрануляции в зоне формирующихся сосудов (окраска азур-П-эозином; микрофото, *1000)
Уже на 3-и сут после начала терапевтических мероприятий у мышей обеих групп количество тучных клеток превышало показатели животных контрольной группы в 2 раза. Своего максимума численность лаброцитов у животных 4-й группы достигала на 5-е сут, 3-й группы - на 9-е сут эксперимента (146,20±2,71 и 144,40±7,26 клетки соответственно), после чего наблюдалось постепенное снижение этих показателей до 96,6-110,1 клетки на исследуемой площади (рис. 4). На протяжении всего периода светового воздействия в регенератах животных
обеих групп доля дегранулирующих типов клеток оставалась преобладающей, при этом на 3-и сут заживления коэффициенты дегрануляции были достоверно ниже, а в последующие периоды - значительно выше аналогичных показателей контрольной группы (рис. 4). Клетки-тени встречались лишь в течение первых трех суток эксперимента и локализовались преимущественно в тканях, непосредственно граничащих с зоной раны. На 11-е сут отдельные тучные клетки выявлялись в молодой вновь образованной соединительной ткани.
^ 180
3 5 9 11 15 21 28
Время наблюдений, сутки
—«►—■ Ишпакптш я контроль
—й— р&иы СДМКД -г-— Обпучвтв тямусв СДМЩ
Рис 4. Количество лаброцитов в различные периоды заживления раны, на единицу площади
Заключение. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что воздействие светодиодного излучения красного диапазона на раневую поверхность и область проекции тимуса увеличивает функциональную активность тучных клеток в регенерирующей соединительной ткани, которая выражается в интенсивной миграции клеток к зоне воспаления в первые дни после нанесения ожоговых повреждений и повышении количества дегранулирующих форм в более поздние сроки репаративных процессов.
1. Бабаева А. Г. Прошлое, настоящее и будущее проблемы лимфоидной регуляции пролиферации нелимфоидных клеток / А. Г. Бабаева // Бюл экспериментальной биологии и медицины. -1995. - Т. 120, № 9. - С. 230-234.
2. Гейниц А. В. О подготовке кадров по лазерной медицине / А. В. Гейниц // Материалы Международной конференции «Лазерные и информационные технологии в медицине XXI века». -СПб., 2001. - С. 9-11.
3. Герасимова Л. И. Лазеры в хирургии и терапии термических ожогов : руководство для врачей / Л. И. Герасимова. - М. : Медицина, 2000. -224 с.
4. Долгушин И. И. Нейтрофилы и гомеостаз / И. И. Долгушин, О. В. Бухарин. - Екатеринбург : УрО РАН, 1989. - 221 с.
5. Использование квантового излучения красного диапазона в клинической медицине / Т. В. Соколова [и др.] // Материалы Международной конференции «Лазерные и информационные технологии в медицине XXI века». - СПб., 2001. -С. 389-390.
6. Карандашов В. И. Фототерапия (светолечение) : руководство для врачей / В. И. Карандашов, Е. Б. Петухов, В. С. Зродников. - М. : Медицина, 2001. - 392 с.
7. Кару Т. Й. Фотобиология регуляций мета-
болизма клетки низкоинтенсивным лазерным светом / Т. Й. Кару. - Троицк, 1995. - 57 с.
8. Лаврушина Е. Е. Применение светодиодного излучения для коррекции процессов регенерации кожи / Е. Е. Лаврушина, О. В. Столбовская, Г. М. Топурия. - Ульяновск : УГСХА, 2008. - 128 с.
9. Миронова В. В. Использование светодиодного излучения красного диапазона в лечении пародонта / В. В. Миронова, С. В. Булярский, Т. Я. Тарарак // Итоги и перспективы развития современной медицины в контексте 21 века. - Бишкек, 1998. - С. 579-580.
10. Неулыбин В. И. Функциональная морфология процессов заживления ожоговой раны : ав-тореф. дис .... канд. мед. наук / В. И. Неулыбин. -Киев, 1990. - 16 с.
11. Пагава К. И. Морфо-функциональные сдвиги при воздействии на организм монохроматическим светом / К. И. Пагава. - Тбилиси : МЕЦНИЕРЕБА, 1988. - 105 с.
12. Парамонов Б. А. Методы моделирования термических ожогов кожи при разработке препаратов для местного лечения / Б. А. Парамонов,
B. Ю. Чеботарев // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Т. 134, № 11. -
C. 593-597.
13. Серов В. В. Воспаление : руководство для врачей / В. В. Серов, В. С. Пауков. - М. : Медицина, 1995. - 640 с.
14. Серов В. В. Соединительная ткань (функциональная морфология и общая патология) / В. В. Серов, А. Б. Шехтер. - М. : Медицина, 1981. - 312 с.
15. Столбовская О. В. Состояние регенераторных процессов в ожоговой ране в условиях локального воздействия некогерентным красным светом / О. В. Столбовская, Е. Е. Лаврушина // Материалы Всероссийской научно-практической конф. «Наука в современных условиях: от идеи до внедрения». - Димитровград, 2008. -С. 174-176.
16. Barolet D. Light - Emitting Diodes (LEDs) in Dermatology / D. Barolet // Semin Cutan Med Surg. - 2008. - № 27. - P. 227-238.
MORPHOFUNCTIONAL STATE OF THE FAT CELLS OF THE SKIN OF THE MICE IN THE COURSE OF THE HEALING THERMAL BURN
O.V. Stolbovskaya1, E.E. Lavrushina2, E.S. Panusheva1, R.M. Khairullin1
1 Ulyanovsk State University, 2Dimitrovgrad Technical College
This study presents results of a study of morphofunctional status of mast cells in the course of reparative regeneration of burn wounds in mice under the influence led radiation in the red spectrum light.
Keywords: mast cells, regeneration of burn wounds of the skin of mice, led red radiation light spectrum.
