CC BY
137
УДК 611.43.018:599.323.4 ББК Е60*737.15:Е60*725.381.81
Е.М. ЛУЗИКОВА, И.Л. АРТЕМЬЕВА, В.Е. СЕРГЕЕВА
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РЕАКЦИЯ АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИХ КЛЕТОК ТИМУСА НА ВВЕДЕНИЕ МЕЛАТОНИНА И ПРЕПАРАТА «ЭНДОРФАИН»
Ключевые слова: тимус, мелатонин, препарат «Эндорфаин», антигенпрезенти-рующие клетки, MHC-II, Iba-1.
Изучена реакция Iba-1 и MHC-II-позитивных клеток тимуса на введение мелатони-на и препарата «(Эндорфаин». Установлено, что введение мелатонина и препарата «Эндорфаин» приводит к увеличению количества антигенпрезентирующих клеток в корковом и мозговом веществах долек тимуса.
E. LUZIKOVA, I. ARTEMYEVA, V. SERGEEVA ANTIGEN-PRESENTING CELLS OF THE THYMUS WHEN ADMINISTERED MELATONIN AND PREPARATION «ENDORFAIN»
Key words: thymus, melatonin, «tEndorphain», antigen-presenting cells, MHC-II, Iba-1.
The reaction of Iba-I and MHC-II-positive structures of thymus by the administration of mela-tonin and the drug «Endorfain» has been studied. Found that the administration of melatonin and the drug «Endorfain» leads to the increase of antigen presenting cells quantity in medulla and cortex of thymus.
Известно, что пинеальный и экстрапинеальный мелатонин принимает участие в регуляции функций иммунной системы организма. Об этом свидетельствует наличие рецепторов к мелатонину на мембранах иммуннокомпе-тентных клеток тимуса. Экстрапинеальный мелатонин играет ключевую роль в координации клеточных функций и межклеточных связей в норме и патологии. При пинеалэктомии и введении препаратов, блокирующих синтез мелатонина, наблюдается угнетение продукции антител лимфоцитами [1]. Введение мелатонина повышает плотность тимоцитов в корковом веществе дольки вилочковой железы, снижает выраженность или предупреждает инволюцию тимуса в условиях стресса [5].
О влиянии фенилаланина на систему антигенпрезентирующих клеток (АПК) известно меньше. Иммуномодулирующее действие препарата «Эндорфаин» основано на том, что фенилаланин (основной компонент препарата), являясь главным материалом метаболических реакций, способствует выработке эндорфина, катехоламинов. Эндорфины (энкефалины) участвуют в регуляции работы гипоталамо-гипофизарной системы и, следовательно, опосредованно воздействуют на иммунные органы. Известно, что эндогенные энкефалины ингибируют хемокин-индуцированный хемотаксис нейтрофилов и моноцитов человека. Кроме того, эндогенные опиоиды уменьшают чувствительность хемокиновых рецепторов моноцитов [10].
К MHC-II-позитивным клеткам тимуса относят антигенпредставляющие дендритные клетки, макрофаги, а также В-лимфоциты. MHC-II-позитивными клетками, принимающими участие в селекции лимфоцитов, также являются эпителиальные клетки. Снижение экспрессии MHC-II на мембранах тимусных эпителиальных клеток приводит к гибели тимоцитов, так как нарушается их положительный отбор [12]. Белки главного комплекса гистосовместимости второго класса -major histocompatibility complex class II (MHC-II) - необходимы для развития Т-кле-точного иммунного ответа, а также для обеспечения взаимодействия между Т-лимфоцитами и макрофагами в процессе иммунного ответа [4] и, следовательно, являются специфичными маркерами активированных макрофагов [3]. Динамичность экспрессии молекул MHC-II (АПК) зависит от функционального
состояния клетки и изменения под влиянием различных стимулов. Это один из механизмов, контролирующих индукцию и реализацию иммунного ответа [6].
Ионизирующая кальций связывающая адапторная молекула (ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1) идентифицирована как кальций-связываю-щий белок, экспрессирующийся клетками моноцитарно-макрофагального происхождения, включающего свободные моноциты, тканевые макрофаги и клетки микроглии. Iba-1 является кальций-связывающим белком массой 17 кД, состоящим из 147 аминокислот и содержащим два кальций-связывающих участка [2]. Iba-1 принимает участие в реорганизации актинового скелета и образовании мембранных складок макрофагов при индуцированном фагоцитозе [13].
Связь между Iba-1 и MHC-II молекулами проявляется в процессах анти-генпрезентации. Антигены захватываются макрофагальными цитоплазмати-ческими отростками, в образовании которых участвует Iba-1 [14], и после фрагментации связываются с молекулами MHC-II. Неактивность либо снижение экспрессии Iba-1 или MHC-II приводит к ослаблению имунного ответа. Следовательно, изменение качественных и количественных характеристик Iba-1- и MHC-II-позитивных клеток является показателем силы иммунного ответа. Впервые проведено сравнительное исследование реакции Iba-1- и MHC-II-позитивных клеток тимуса на иммуностимуляторы различной природы и сделана попытка определить силу иммунного ответа по соотношению количественных характеристик Iba-1- и MHC-II-позитивных клеток.
Целью исследования является выявление морфофункциональной реакции Iba-1- и MHC-II-позитивных клеток тимуса на воздействие мелатонином и препаратом «Эндорфаин».
Материалы и методы исследования. Объектом исследования служил тимус 65 двухмесячных интактных мышей-самцов одной массы (50-60 г), содержавшихся при сбалансированном рационе питания и естественном освещении. Эксперимент выполнялся в соответствии с принципами гуманного обращения с животными, изложенными в директивах Европейского сообщества (National Competent Authorities for the implementation of Directive 2010/63/EU).
Криостатные срезы тимуса толщиной 15 мкм обрабатывались непрямым иммунофлуоресцентным методом. Блок неспецифического связывания проводился преинкубацией срезов с 10% козьей сывороткой и 0,05% тритоном Х-100. В качестве первичных антител были использованы анти-MHC класс II (1:4; rat anti rat RT1Bu, Class II polymorphic; Serotec) и анти-IbaH (1:400; rabbit polyclonal anti-Iba-1,Wako Chemicals GmbH, Neuss, Germany). Для визуализации MHC-II и Iba-1 использованы меченные флуорохромом вторичные антитела Alexa Fluor 488 (1:250; goat anti rat IgG; Invitrogen) [9].
Микроскопию препаратов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus, снабженного дигитальной камерой и набором светофильтров. Анализ изображений был сделан с помощью программы Adobe Photoshop CS2. Количественное распределение исследуемых клеток оценивали по подсчету их в 12 полях зрения микроскопа. Среднеарифметические значения каждого случая были статистически обработаны с помощью непараметрического критерия Вил-коксона - Манна - Уитни.
Животные были разделены на 3 группы: 1 - интактные животные находились в условиях обычного питьевого режима; 2 - экспериментальные животные, получавшие препарат «Мелаксен» (мелатонин) с водой перорально в течение 4 недель в дозе 0,03 мг на 1 животное в сутки; 3 - экспериментальные животные, получавшие препарат «Эндорфаин» с водой перорально в течение 4 недель в дозе 5 мг на 1 животное в сутки.
Предварительно проводилось измерение количества выпиваемой животным воды за сутки. Затем в этом объеме растворялось необходимое количество препарата. Контроль за уровнем воды в поилках осуществлялся два раза в сутки. На 4-е сутки эксперимента было замечено, что животным второй экспериментальной группы прежнего объема воды недостаточно. Было произведено повторное измерение количества выпиваемой воды за сутки и приготовлен раствор с необходимым количеством препарата.
Результаты исследования и их обсуждение. В тимусе интактных животных МНС-11-позитивные клетки встречаются в субкапсулярной области, где они имеют уплощенную форму, видимое ядро и хорошо различимые гранулы белка МНС-11. В корковом веществе долек и в кортико-медуллярных зонах встречаются клетки полигональной формы, крупнее предыдущих. мНс-11-позитивные клетки кортико-медуллярной зоны (в среднем 13,93±1,23 клетки в поле зрения) располагаются по всей ее протяженности плотно в один-два ряда. Размер клеток в среднем равен 7,75±0,29 мкм (площадь 85,30±9,43 мкм2). Многие клетки имеют неправильно-полигональную отростчатую форму, но среди них встречаются единичные клетки округлой формы. В центре антигенпредставляющих клеток (АПК) хорошо видны контуры округлого ядра. В мозговом веществе долек выявляются более мелкие клетки с мелкими гранулами МНС-11.
В корковых (в среднем 5,43±0,58 клетки в поле зрения) и мозговых зонах (в среднем 1,85±0,24 клетки в поле зрения) долек тимуса АПК располагаются диффузно, преобладая в корковом веществе (р < 0,01). Это объясняется тем, что стромальные эпителиальные клетки мозгового вещества долек являются МНС-11-негативными [11]. Следовательно в мозговом веществе тимусных долек МНС-11-позитивными являются преимущественно макрофаги, а также небольшое число В-лимфоцитов. Эндотелиоциты, адипоциты, тучные клетки, являющиеся МНС-11-позитивными в тимусе, мы не учитывали.
При введении мелатонина количество МНС-11-позитивных клеток в корковом веществе долек не претерпевает значительных изменений, а в мозговом веществе долек возрастает по сравнению с контрольными значениями в 8,9 раза (р < 0,01). Вероятно, это связано с увеличением миграции МНС-11-позитивных макрофагов и В-лимфоцитов из кровотока. В кортико-медуллярной зоне МНС-11-позитивные дендритные клетки и макрофаги не образуют «рамки», характерной для долек тимуса интактных животных, так как их количество снижается до единичных клеток. «Эндорфаин» увеличивает количество МНС-11-позитивных клеток как в мозговом, так и в корковом веществе долек тимуса в 4,8 (р < 0,01) и 2,8 (р < 0,01) раза, соответственно (рисунок, а). Это увеличение связано и с эмиграцией макрофагов, и с пролиферацией эпителиальных МНС-11-позитив-ных клеток. Фигуры митозов стромальных эпителиальных МНС-11-позитивных клеток были зафиксированы в корковом веществе тимуса животных, получавших «Эндорфаин».
В тимусе 1Ьа-1-позитивными являются отростчатые клетки, содержащие интенсивно окрашенные участки с зернистым содержимым. Встречаются единично безотростчатые клетки полигональной формы. Эндотелий сосудов, тучные клетки, лимфоциты не проявляют 1Ьа-1-позитивость. 1Ьа-1-позитивные клетки встречаются как в корковом, так и в мозговом веществе дольки тимуса, но в норме преобладают в корковом веществе. Эти данные согласуются с функцией коркового и мозгового вещества долек: в корковом веществе активнее идут процессы фагоцитоза. Здесь фагоцитируются и презентируются антигены, фагоцитируются клетки и клеточные элементы. Мелатонин и препарат «Эндорфаин» увеличивают общее количество 1Ьа-1-позитивных клеток, но мелатонин увеличивает ко-
личество Iba-1-позитивных клеток в мозговом веществе в 2,6 раза (р < 0,01), а препарат «Эндорфаин» увеличивает количество Iba-1-позитивных клеток и в корковом, и в мозговом веществах долек (в 2,0 раза и в 2,3 раза, соответственно (р < 0,01)). Следовательно, мелатонин увеличивает количество рециркулирую-щих макрофагов, а «Эндорфаин» - и рециркулирующих, и специфических.
20 16 12
5,4 5,7
Г
15,2 Г-1-!
рЬ
1,9
КВ
мв
• контроль □ мелатонин □эндорфаин
а
б
Влияние мелатонина и препарата «Эндорфаин» на MHC II (а) и Iba-1-позитивные клетки (б) тимуса
Iba-1-позитивных клеток в норме больше, чем MHC-II-позитивных (рисунок, б), так как не все фагоцитирующие клетки являются антигенпрезентирующими. В тимусе присутствуют банальные макрофаги (Iba-1-позитивные, MHC-Il-нега-тивные), фагоцитирующие клетки и клеточные элементы в процессах негативной селекции и щетинга лимфоцитов. Активированными макрофагами можно считать клетки, имеющие lba-1 и MHC-II рецепторы, а о стимуляции иммунного ответа свидетельствует увеличение количества этих клеток. Отношение MHC-II- и Iba-1-позитивных клеток (MHC-II/Iba-1) показывает долю активированных макрофагов. Когда MHC-II/Iba-1 равно или немногим более 1 при одновременном увеличении Iba-1 и MHC-II-позитивных клеток, мы можем говорить об иммуностимуляции. У интактных животных MHC-II/Iba-1 в корковом веществе равно 0,7, а в мозговом - 0,5. При введении мелатонина в корковом и мозговом веществах долек Iba-1-позитивных клеток становится меньше, чем MHC-II-позитивных, при увеличении количества клеток каждой группы. MHC-II/Iba-1 равно 1,3 и 1,6, соответственно. Введение препарата «Эндорфаин» приводит к уравниванию количества MHC-II- и Iba-1-позитивных клеток в центральном органе иммунитета. Iba-1/MHC-II в мозговом веществе равно 1,01, а в корковом веществе равно 1,03.
Выводы. 1. В норме Iba-1-позитивных клеток тимуса больше, чем MHC-II-позитивных.
2. Под действием мелатонина увеличивается миграция MHC-II-позитив-ных макрофагов и В-лимфоцитов из кровотока.
3. Под действием мелатонина в корковом и в мозговом веществе долек Iba-1-позитивных клеток становится меньше, чем MHC-II-позитивных.
4. Введение препарата «Эндорфаин» приводит к увеличению эмиграции макрофагов и пролиферации эпителиальных MHC-II-позитивных клеток.
5. Введение мелатонина и препарата «Эндорфаин» в течение 4 недель приводит к увеличению количества MHC II-позитивных клеток как в корковом, так и в мозговом веществе долек тимуса, следовательно, наблюдается стимуляция клеточного имунного ответа.
6. Введение мелатонина в течение 4 недель приводит к увеличению количества рециркулирующих Iba-1-позитивных макрофагов в мозговом веществе дольки тимуса, а препарата «Эндорфаин» - к увеличению и Iba-1-пози-тивных рециркулирующих, и Iba-1-позитивных специфических тимусных макрофагов.
Литература
1. Арушанян Э.Б., Бейнр Э.В. Гормон мозговой железы эпифиза мелатонин - универсальный естественный адаптоген // Успехи физиологических наук. 2012. Т. 43, № 3. С. 82-100.
2. Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Коржевский Д.Э. Кальций-связывающий белок Iba-1/AIF1 в клетках головного мозга крысы // Морфология. 2010. Т. 136, № 2. С. 5-7.
3. Лузикова Е.М., Дъячкова И.М., Сергеева В.Е., Смородченко A.T. Исследование нейрон-специфической энолазы, белков MHC II класса и кальций-связывающих молекул макрофагов тимуса // Морфология. 2009. Т. 136, № 4. С. 90-91.
4. Маянский Н.А., Маянский А.Н. Номенклатура и функции главного комплекса гистосовме-стимости человека // Иммунология. 2006. Т. 27, № 1. С. 43-46.
5. Перцов С.С. Влияние мелатонина на состояние тимуса, надпочечников и селезенки у крыс при острой стрессорной нагрузке // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т. 141, № 3. С. 263-266.
6. Сарилова И.Л., Сергеева В.Е, Смородченко А.Т. Эффект тестэктомии на структуры вилочковой железы, экспрессирующие главный комплекс гистосовместимости II класса // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. Т. 146, № 1. С. 103-106.
7. Сухорукова Е.Г., Кирик О.В., Коржевский Д.Е. Применение иммуногистохимического метода для выявления микроглии головного мозга в парафиновых срезах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т. 149, № 6. С. 709-712.
8. Эффекты действия мелатонина на старение клеток тимуса и периферические Т-лимфо-циты in vitro / В.О. Полякова, И.В. Князькин, С.С. Коновалов и др. // Успехи геронтологии. 2005. Т. 17, № 2. С. 10-14.
9. CNS-irrelevant T-cells enter the brain, cause blood-brain barrier disruption but no glial pathology / A. Smorodchenko, I. Wuerfel, E. Pohl et аl. // Eur. J. Neuroscience. 2007. Vol. 26. P. 1387-1398.
10. Esther M. Sternberg Neural regulation of innate immunity: a coordinated nonspecific host response to pathogens Published in final edited form as // Nat. Rev. Immunol. 2006. Vol. 6, № 4. P. 318-328. doi: 10.1038/nri1810.
11. Gwanghee L, Ki Y. K, Cheong-Hee C, Moon G. K. Thymic Epithelial Requirement for y5 T Cell Development Revealed in the Cell Ablation Transgenic System with TSCOT Promoter // Mol. Cells. 2012, V34, № 5, Р. 481-493.
12. Lee G., Kim K.Y., Chang C.-H, Gyo M. Thymic Epithelial Requirement for y^ T Cell Development Revealed in the Cell Ablation Transgenic System with TSCOT Promoter // Mol. Cells. 2012. Vol. 34., № 5. P. 481-493.
13. Ohsawa K., Imai Y., Sasaki Y., Kohsaka S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-binding activity // J. Neurochem. 2004. Vol. 88. P. 844-856.
14. Szakal A. K., Kosco M.H., Tew J.G. Microanatomy of lymphoid tissue during humoral immune responses: structure function relationships // Ann. Rev. Immunol. 1989. Vol. 7. P. 91-109.
ЛУЗИКОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА - кандидат биологических наук, доцент кафедры цитологии, эмбриологии, гистологии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (nema76@mail.ru).
LUZIKOVA ELENA - candidate of biological sciences, assistant professor of Cytology, Histology and Embryology Chair, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
АРТЕМЬЕВА ИРИНА ЛЕОНИДОВНА - кандидат медицинских наук, доцент кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (a-irina-l@mail.ru).
ARTEMYEVA IRINA - candidate of medical sciences, assistant professor of Medical Biology Chair with the Microbiology and Virology Course, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
СЕРГЕЕВА ВАЛЕНТИНА ЕФРЕМОВНА. См. с. 269.
