CC BY
34
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 616.132.2-089.844
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОЦЕНКА АРТЕРИЙ МЫШЕЧНО-ЭЛАСТИЧЕСКОГО ТИПА ПОСЛЕ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ
Мария Борисовна ВАСИЛЬЕВА, Давид Сергеевич СЕРГЕЕВИЧЕВ,
Наталья Анатольевна ПОДХВАТИЛИНА, Александр Михайлович КАРАСЬКОВ
ФГБУ Новосибирский НИИ патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина Минздрава России
630055 г. Новосибирск, ул. Речкуновская, 15
Цель: изучить влияние детергентного и ферментного способов децеллюляризации на структуру и биомеханические свойства сосудистого экстрацеллюлярного матрикса брахиоцефальных артерий. Материал и методы: фрагменты артерий децеллюляризировали детергентами или трипсином, после чего отмывали и исследовали гистологическими и физическим методами. Результат и обсуждение. Детергентный метод является более эффективным для удаления клеточного содержимого сосудистой стенки, при котором сохраняется исходная механическая прочность и пространственная структура соединительнотканного каркаса сосуда.
Ключевые слова: ткане-инженерный сосудистый аллографт, детергентная децеллюляризация, тканевая инженерия, регенеративная медицина.
Облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей и коронарных артерий при ишемической болезни сердца нередко требуют проведения реконструктивно-восстановитель-ного хирургического лечения. Большинство процедур, используемых для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, связаны с имплантацией сосудистого трансплантата. Среди них шунтирование коронарных артерий для ревас-куляризации миокарда, периферическое шунтирование для реваскуляризации конечности и создание артериовенозных фистул при диализе. Наилучшим образом для этого подходят аутосо-суды пациента. Однако в значительном проценте случаев собственного реконструктивного материала пациента недостаточно, что приводит к использованию синтетических протезов различных модификаций [6]. Случается, что в определенных ситуациях их использование сопряжено с опасностью возникновения тромбоза сосудистого протеза, инфекционных осложнений [16]. Отдельной задачей на сегодняшний день стоит создание сосудистого протеза, способного подвергаться ремоделированию, это особенно важно для детской кардиохирургии. Использование таких протезов позволит сократить число повторных операций у пациентов детского возрас-
та, поскольку такие аллографты будут способны расти по мере взросления пациента [13].
Ткане-инженерные сосудистые протезы, изготовленные на основе аллогенного донорского материала, на наш взгляд, могут стать хорошей альтернативой для протезов из искусственных материалов. Данные современных исследований показали, что использование в качестве биологических протезов соединительнотканных каркасов, полученных путем децеллюля-ризации, имеют очевидное преимущество перед протезированием «живыми» тканями и органами [5]. В процессе создания идеального ткане-инженерного сосуда важным этапом становится необходимость максимально полно удалить клетки из исходного донорского материала, при этом нарушение структурной и пространственной целостности соединительнотканного каркаса должно быть минимальным. Удаление жизнеспособных клеток донора, а также частей разрушенных клеточных стенок приводит к значительному снижению иммуногенности им-плантата и, следовательно, к снижению риска постимплантационного воспаления, некробиоза и других дегенеративных процессов, запускаемых иммунокомпетентными клетками пациента
[19].
Васильева М.Б. - к.м.н., научный сотрудник лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии Сергеевичев Д.С. - к.б.н., зав. лабораторией экспериментальной хирургии и морфологии Подхватилина Н.А. - научный сотрудник лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии Караськов А.М. - академик РАМН, директор института
Соединительнотканные каркасы представляют собой сложную пространственно-ориентированную систему структурных и функциональных белков экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ), составляющих механическую основу ткани. Компоненты ЭЦМ, а это в основном коллаген и эластин, не имеют видоспецифичности и идентичны у большинства видов млекопитающих [7]. В настоящее время используются различные способы децеллюляризации биологического материала, каждый из которых имеет свои сильные и слабые стороны [8]. Так, по описанию в литературе, для децеллюляризации сосудистых и клапансодержащих аллографтов (легочный ствол, аорта) чаще других используют ферментные и детергентные способы [10, 14,17].
Целью нашей работы являлось изучение влияния детергентного и ферментного способов децеллюляризации на структуру и биомеханические свойства сосудистого ЭЦМ на основе фрагментов брахиоцефальных артерий.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материалом исследования послужили 30 фрагментов брахиоцефальных артерий (БЦА), полученных из секционного материала с использованием «чистого», но не стерильного способа забора. Время теплой ишемии составляло 13 ± 2 ч, общий период отсутствия кровообращения достигал 18 ч. Критерии забора тканей, противопоказания и параметры выбраковки были определены согласно рекомендациям Европейской ассоциации банков тканей [11].
После процедуры микродиссекции полученные сосудистые аллографты помещали в раствор «лечения» на основе питательной среды RPMI-1640 (Биолот, Санкт-Петербург) с добавлением комплекса антимикробных препаратов широкого спектра действия в цитотоксических дозировках [11]. Через 48 ч аллографты ополаскивали в фосфатном буфере с pH 7,4 и переносили в растворы для децеллюляризации.
Первая группа графтов БЦА (n = 10) была обработана детергентным способом согласно [14], вторая группа (n = 10) - ферментным способом согласно [17] с некоторыми нашими модификациями [1]. В качестве контроля (группа 3, n = 10) использовали размороженные крио-сохраненные фрагменты брахиоцефальных артерий.
Морфологическое исследование материала проводили по завершении процедуры децеллю-ляризации. Для этого с помощью ротационного микротома Microm HM340E (Carl Zeiss, Герма-
ния) получали серийные срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином. Для мечения ядерного материала использовали DAPI. Аппаратное обеспечение: микроскопы Axiovert 200M с видеокамерой Axiocam HRc и Axioskop 40FL с видеокамерой Axiocam MRc, комплект программного обеспечения Axiovision 4.7 (Carl Zeiss, Германия).
Тензометрические испытания проводили согласно рекомендациям М.Б. Васильевой с соавт. [1].
РЕЗУЛЬТАТЫ
При микроскопическом анализе образцов стенки БЦА в группе 1, окрашенных гематоксилином-эозином, ядра или какие-либо другие клеточные элементы не определялись (см. рисунок), при этом базальная мембрана была практически полностью сохранена и четко визуализирована. В группе 2 в образцах остаточный ядерный материал не визуализировался, базальная мембрана была значительно фрагментирована, а местами вообще отсутствовала. Кроме того, отмечалось разволокнение и набухание тканевых элементов.
Указанная тенденция была подтверждена также окраской ядерного материала препаратов с помощью DAPI. В группе 2 ядерный материал отсутствовал, волокна соединительнотканного каркаса были значительно изменены по своей конфигурации и взаимоориентации. В группе 1 при обработке детергентным способом компоненты экстрацеллюлярного матрикса практически не изменены. Сохранены упорядоченная структура и сетчатое расположение волокон, идентичное контролю.
Полученные данные проведенного физико-механического исследования показали, что средние значения максимальной разрушающей нагрузки в группах контроля и детергентной обработки значимо не различались, в то время как в группе с обработкой трипсином показатели прочностных характеристик были значительно ниже контрольных.
ОБСУЖДЕНИЕ
Замена поврежденного участка сосудистого русла - широко используемый метод в сердечно-сосудистой хирургии. На сегодняшний день перспективной альтернативой для синтетических протезов являются ткане-инженерные сосудистые протезы на основе биодеградируемой матрицы [13]. На наш взгляд, использование уже существующей натуральной соединительнотканной матрицы не менее перспективно для
Рис. Поперечный срез брахиоцефальной артерии. Окрашено гематоксилин-эозином (объектив х 10). а — контроль; б — децеллюляризация детергентами; в — ферментная децеллюляризация
работ по их дальнейшему заселению клетками и формированию ткане-инженерного сосудистого аллографта.
Многие авторы в своих работах используют ферментный способ децеллюляризации биологической ткани с ее дальнейшим процессингом как основной [3, 4, 17, 18]. Однако согласно результатам наших исследований, децеллюляри-зация ферментным способом имеет существенные недостатки. Так, в погоне за полной элиминацией остатков ядерного материала клеток дальнейшее увеличение концентрации трипсина и сроков экспозиции в растворе приводило к значительным повреждениям соединительной ткани, которые могли быть выявлены не только гистологическими методами и тензометричес-кими испытаниями, но и при обычном визуальном контроле. Наши данные согласуются с работами других авторов [9].
Важно отметить, что использование детергентов требует тщательной процедуры отмывки, так как они являются известными клеточными токсинами [12].
Данные по тензометрическим исследованиям фрагментов брахиоцефальных артерий аналогичны выводам наших предыдущих испытаний клапансодержащих фрагментов легочных стволов и аорт [1, 2]. Сохранение механической прочности матриксов сосудистых аллографтов, обработанных детергентным способом, способно обеспечить более адекватное сопротивление гемодинамической нагрузке в условиях физиологической циркуляции и будет способствовать увеличению срока службы сосудистого протеза нового поколения.
Немаловажным остается решение вопроса о предотвращении тромбоза мелких сосудов, ведь именно эта проблема выходит на первый план при работе как с искусственными тканями, так и с ксенопротезами [15]. Заселение внутрисо-судистой поверхности децеллюляризированной матрицы эндотелиальными клетками позволит решить эту проблему.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, децеллюляризация фрагментов брахиоцефальных артерий детергентным способом (сочетание натрия дезоксихолата и натрия додецилсульфата) является более эффективным методом удаления клеток из ткани в сравнении с ферментным способом. Полученные таким способом соединительнотканные матрицы по своим морфологическим и физико-механическим характеристикам пригодны для проведения дальнейших культуральных работ по заселению новыми клетками.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Васильева М.Б., Сергеевичев Д.С., Юно-шев А.С. и др. Морфофункциональная оценка ферментативного и детергентного способов децел-люляризации сердечных аллографтов // Патология кровообращения и кардиохирургия. 2012. (2). 77-81.
2. Сергеевичев Д.С., Васильева М.Б., Суббо-товская А.И. и др. Влияние детергентной и ферментной децеллюляризации на биомеханические свойства аортального аллографта // Вестн. НГУ. 2012. 10. (4). 29-35.
3. Субботин Д.В., Ларионов П.М., Сергеевичев Д.С. и др. Морфологическая и биофизическая
оценка (лазерно-индуцированная флюоресценция) структуры аорты на этапах биотехнологии аортального графта // Патология кровообращения и кардиохирургия. 2008. (4). 81-84.
4. Субботин Д.В., Ларионов П.М., Сергееви-чев Д.С. и др. Морфологическая оценка цитоархи-тектоники аортального графта на этапах биотехнологии с анализом изменений спектров лазерно-ин-дуцированной флюоресценции // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2009. (4). 191-197.
5. Badylak S.F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction // Transplant. Immunol. 2004. 12. 367-377.
6. Enomoto S., Sumi M., Kajimoto K. et al. Long-term patency of small-diameter vascular graft made from fibroin, a silk-based biodegradable material // J. Vasc. Surg. 2010. 51. (1). 155-164.
7. Exposito J.Y., D'Alessio M., Solursh M., Ramirez F. Sea urchin collagen evolutionary homologous to vertebrate pro-a2(I) collagen // J. Biol. Chem. 1992. 267. 15559-15562.
8. Gilbert T.W., Sellaro T.L., Badylak S.F. De-cellularization of tissues and organs // Biomaterials. 2006. 27. 3675-3683.
9. Grauss R.W., Hazekamp M.G., van Vliet S. De-cellularization of rat aortic valve allografts reduces leaflet destraction and extracellular matrix remodeling // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2003. 126. (6). 2003-2010.
10. Honge J.L., Funder J., Hansen E. et al. Re-cellularization of aortic valves in pigs // Eur. J. Car-diothorac. Surg. 2011. 39. 829-834.
11. Jashari R., Goffin Y., Vanderkelen A. et al. European homograft bank: twenty years of cardiovascular tissue banking and collaboration with transplant coordination in Europe // Transplant. Proc. 2010. 42. 183-189.
12. Kasimir M.T., Rieder E., Seebacher G. et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves // Int. J. Artif. Organs. 2003. 26. 421-427.
13. Kurobe H., Maxfield M.W., Breuer C.K., Shi-noka T. Concise review: Tissue-engineered vascular grafts for cardiac surgery: past, present, and future // Stem Cells Trans. Med. 2012. 1. (7). 566-571.
14. Lichtenberg A., Tudor ache I., Cebotari S. et al. In vitro re-endothelialization of detergent decel-lularized heart valves under simulated physiological dynamic conditions // Biomaterials. 2006. 27. 42214229.
15. Nieponice A., Soletti L., Guan J. et al. Development of a tissue engineered vascular graft combining a biodegradable scaffold, muscle-derived stem cells and a rotational vacuum seeding technique // Biomaterials. 2008. 29. (7). 825-833.
16. Pawlowski K.J., Rittgers S.E., Schmidt S.P., Bowlin G.L. Endothelial cell seeding of polymeric vascular grafts // Front. Biosci. 2004. (9). 1412-1421.
17. Teebken O.E., Bader A., Steinhoff G., Hav-erich A. Tissue engineering of vascular grafts: human cell seeding of decellularised porcine matrix // Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 2000. 19. 381-386.
18. Wilczek P. Heart valve bioprothesis; effect of different acellularizations methods on the biome-chanical and morphological properties of porcine aortic and pulmonary valve // Bull. Pol. Ac.: Tech. 2010. 58. (2). 337-342.
19. Zehr K.J., Yagubyan M., Connolly H.M. et al. Aortic root replacement with a novel decellularized cryopreserved aortic homograft: Postoperative im-munoreactivity and early results // J. Thorac. Cardio-vasc. Surg. 2005. 130. 1010-1015.
MORPHO-FUNCTIONAL EVALUATION OF MUSCULO-ELASTIC ARTERIES FRAGMENTS AFTER DECELLULARIZATION
Mariya Borisovna VASIL'EVA, David Sergeevich SERGEEVICHEV, Natal'ya Anatol'evna PODKHVATILINA, Alexandr Mikhaylovich KARAS'KOV
FSBI Novosibirsk Research Institute of Circulation Pathology named after Academician E.N. Meshalkin 630055, Novosibirsk Rechkunovskaya str., 15
Aim: To study the effect of detergent and enzyme decellularization methods on the morphology and biomechanical properties of the vascular extracellular matrix of the brachiocephalic arteries. Material and Methods: Fragments of arteries were decellularized by detergents or trypsin, and then washed and examined with histological and physical methods. Results. Detergent method is more effective for purification of the vessel walls from the cells, maintaining its original mechanical strength and the spatial structure of the framework.
Key words: tissue-engineered vascular allograft, detergent decellularization, tissue engineering, regenerative medicine.
Vasil'eva M.B. — candidate of medical sciences, researcher of the laboratory of experimental surgery and morphology Sergeevichev D.S. - candidate of biological sciences, head of the laboratory of experimental surgery and morphology Podkhvatilina N.A. - researcher of the laboratory of experimental surgery and morphology Karas'kov A.M. - academician of RAMS, director
