CC BY
24
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 591.8+611.013.12+611.08+591.391.1 © Д.А. Боков, А.А. Слободсков, С.В. Нотова, 2016
Д.А. Боков1, А.А. Слободсков2, С.В. Нотова2 МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗВИТИЯ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ БИОТЕСТИРОВАНИИ НАНОЧАСТИЦ МЕДИ
'ГБОУ ВПО «Оренбургский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Оренбург 2ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный университет», г. Оренбург
Разработка новых биомедицинских технологий для использования наноматериалов требует исключения их токсико-генного потенциала прежде всего для сохранения репродуктивного потенциала организма. Одним из веществ, используемых для доставки лекарств и при диагностике, является наноструктурированная медь. Влияние наночастиц меди на физиологическое течение беременности и развитие плаценты не установлено. Нами в эксперименте с использованием гистологических методов дана оценка токсикогенному потенциалу наночастиц меди и их влиянию на морфогенез плаценты при введении в организм в течение всего гестационного периода с момента наступления беременности. Установлено, что нано-структурированный порошок меди обусловливает незрелость плаценты и способствует прогрессивному нарастанию деструктивно-дегенеративных процессов хориональных структур: атрофии балок, снижению относительного объёма лабиринта, некрозу и расплавлению его элементов. Показаны усугубление и необратимость процессов повреждения тканей плаценты при увеличении дозы вводимого вещества. Дано обоснование нецелесообразности использования данного вещества во время беременности для каких-либо биомедицинских манипуляций.
Ключевые слова: плацента, наночастицы, медь, биотестирование, токсичность.
D.A. Bokov, A.A. Slobodskov, S.V. Notova MORPHOFUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF PLACENTAL DEVELOPMENT AT BIOTESTING OF COPPER NANOPARTICLES
Development of new applications of nanomaterials in biomedical technology demands exclusion of their toxigenic potential, particularly for protection of reproductive potential of an organism. Nanostructured copper is one of the substances used for drug delivery and diagnostics. Significance of copper nanoparticles for physiological course of pregnancy and placental development is undefined. Toxigenic potential of copper nanoparticles, when administered to living organisms, and its influence on placenta morphogenesis during the whole gestation period were assessed experimentally using histological methods. It was established that nanostructured copper powder promotes immaturity of placenta and progressive intensification of destructive and degenerative processes in chorial structures villous atrophy, decreased bulk density of fetal portion of placenta, necrosis of its elements. Furthermore, there was shown aggravation and irreversibility of destructive processes in placental tissues during dose escalation of injected substance. The study provided the rationale for inexpediency of using this substance during pregnancy for any biomedical applications and manipulations such as diagnostics or drug delivery.
Key words: placenta, nanoparticles, copper, biotesting, toxicity.
Наноструктурированные вещества являются новым материалом в современных биомедицинских исследованиях. Его биотестирование является технологическим условием совершенствования возможностей диагностики и доставки лекарств и требует исключения токсикогенного потенциала. Пато-гномичность наночастиц обусловлена повреждением тканевых элементов и преодолением гистогематических барьеров. Достижение эффективных параметров при их использовании требует изучения критериальных значений тканевой динамики с учётом реактивно-зависимого изменения всего комплекса гисто-генетических процессов.
К веществам, наночастицы которых активно исследуются в настоящее время, относятся золото, серебро, цинк, титан, медь и др. [7]. Большинство из них принадлежит к эс-сенциальным элементам с конкретной биологической ролью в организме и необходимым уровнем их содержания. Изменения уровня
поступления в организм данных веществ всегда обусловливают их кумуляцию и избыточную активность [12].
Дисбаланс меди при её избыточном поступлении в организм повышает токсикоген-ный риск, так как медь является компонентом координационных соединений. Медь - это активный комплексообразователь соединений, лигандами в которых являются аминокислоты. Кроме того, медь проявляет сродство к ряду элементов в составе органических молекул (например к сере), что может приводить к нарушению их пространственной организации и изменению биохимических свойств [12].
В связи с вышеизложенным значительный интерес представляет трансформация эмбриональных тканей при воздействии наноча-стиц меди. В пренатальном онтогенезе процесс полной дифференцировки претерпевают ткани провизорных органов, обеспечивающие средо-вые условия для развивающегося организма, а также участвующие в формировании и услож-
нении взаимоотношений организмов матери и эмбриона (плода) [9, 13]. Работ, посвящённых изучению влияния наночастиц на ткани провизорных органов, в том числе плаценты, практически нет. При этом становление и реализация всего перечня функций плаценты связаны с дифференцировкой хориона на основе гетерогенных трофобласта и внезародышевой мезодермы [10]. Например, у крысы в образовании стромы хориона участвует мезодерма, часть элементов которой формируется из первичной полоски, а часть - из желточного мешка. Кроме того, по современным данным цито-и симпластотрофобласт дифференцируются на основе различных генетических паттерингов и не происходят друг из друга. Таким образом, сложный тканевый состав хориона с конкретным диапазоном детерминаций тканевых элементов обусловливает возможность использования его для изучения приспособительных и компенсаторных свойств плаценты при действии наночастиц, которые всё больше используются в медицине [6,10,13-14].
Цель исследования - установить параметры прогрессивной дифференцировки тро-фобласта и хориона в необходимом диапазоне реактивной и приспособительной динамики тканевых элементов в процессе плацентации при введении в организм наноструктуриро-ванного порошка меди. Обосновать возможность использования данного вещества в лечебных и диагностических целях у беременных животных в эксперименте.
Материал и методы
Для эксперимента сформировали две опытные и одну контрольную группы шестимесячных самок крыс линии Вистар массой 250-300 г (К1=Кп=Кш=30). При работе с животными соблюдались нормы Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, 1985). Ссаживание с самцами осуществлено по формуле 1х5. После наступления беременности (контроль осуществлялся по факту образования вагинальной пробки) в опытных группах каждые 3 дня (начиная с третьего; всего 6 инъекций) в бедренную группу мышц вводили взвесь наноструктурированной меди в физиологическом растворе, в контрольной группе - только физиологический раствор.
Порошок наночастиц меди получен в Институте энергетических проблем химической физики РАН (г. Москва). Наночастицы меди типа Си10* имеют форму сферы диаметром 103,0±2,0 нм и покрыты оксидной плёнкой толщиной 6,0 нм. Методом рентгенофазового
анализа определён состав частиц: 96% - кристаллическая медь и 4% - оксид меди.
Взвесь порошка готовили в ультразвуковой ванне. Доза введения определена максимальным уровнем концентрации, переносимым животными, - 2 мг/кг. Так, первой опытной группе инъецировали взвесь концентрацией 0,5 мг/кг; второй - концентрацией 1 мг/кг. Физиологический раствор в группе контроля вводился в количестве 0,2 мл.
На 18-е сутки беременности под эфирным рауш-наркозом забирались плаценты для анализа их морфофункционального состояния.
Подготовку материала для гистологических исследований осуществляли с использованием стандартных подходов. Серийные срезы провизорного органа окрашивали гематоксилином Майера и эозином. Морфомет-рию плацентарных структур выполнили с помощью окулярной сетки Автандилова с количеством точек плотности, равным 225, а также с помощью винтового окуляра-микрометра. Для перевода условных единиц измерений линейных величин в микрометры использовали объект-микрометр с ценой деления 10 мкм.
Объём выборки гистологических структур (па) формировали, используя формулу:
_ VÍV AjX&j "а ~ ¿jí=l n ,
где i - номер конкретного животного из данной группы, А - количество полей зрения, в которых учитывался параметр, а - количество гистологических элементов, учтённых в конкретном поле или количество точек плотности метрической сетки в конкретном поле [11].
Полученные количественные данные обработали методами параметрической статистики. Разность между сравниваемыми параметрами считали значимой при вероятности совпадения значений в выборках, не превышающей 5%.
Результаты и их обсуждение
Развитие плаценты и достижение необходимых параметров эффективных условий фетоплацентарного обмена в сравниваемых опытных группах характеризовались выраженной спецификой уровня структурной и функциональной динамики хориональных структур как компенсаторно-приспособительных реакций, так и деструктивно-дегенеративных процессов.
В группе интактных животных к 18-му дню беременности в плаценте наблюдалась радиальная архитектоника лабиринта с интенсивным анастомозированием балок при их высокой объёмной плотности (рис. 1, см. таблицу). Кроме того, диаметр балок и взаимоотношение барьерообразующих структур де-
монстрировали наиболее благоприятные условия для реализации трофической функции плаценты. В частности, на поперечных срезах балок (рис. 2, см. таблицу) определялись невыраженность стромы, полнообъём-ность наполнения фетальных гемокапилляров,
а также формирование единого структурно -функционального (синцитиокапиллярного) комплекса фетоплацентарного барьера при слиянии эндотелия и симпластотрофобласта (который предельно истончался), разделённых общей базальной мембраной.
а б
Рис. 1. Лабиринтная зона плаценты крыс контрольной группы: а - радиально-балочная структура лабиринта. Увел.: х60; б - поперечные срезы балок. Увел.: х150. Окр. гематоксилином Майера и эозином
Таблица
Параметры функциональной морфологии хориональных структур плаценты_
Наименование параметра Группы животных
Контроль Первая опытная (0,5 мг/кг) Вторая опытная (1 мг/кг)
Масса плаценты, мг 608,1±16,5 п„=27 511,0±9,1 1=1,76 < 1,98 р>0,05 п„=48 534,9±10,9 * 1=3,79 > 3,46 р<0,001 п„=35
Относительный объём лабиринта, % 55,2±0,6 п„=6750 41,3±0,6 * 1=16,33 > 3,29 р<0,001 п„=6750 33,7±0,6 * 1=25,75 > 3,29 р<0,001 п„=6750
Диаметр балок, мкм 19,4±0,8 п„=50 12,6±0,7 * 1=6,80 > 3,37 р<0,001 п„=54 9,9±0,4 * 1=22,09 > 3,46 р<0,001 п„=50
Относительный объём незрелого трофобласта, % 4,9±0,3 п„=4500 4,9±0,3 1=0 п„=5850 10,4±0,4 * 1=6,00 > 3,29 р<0,001 п„=6750
* Различия достоверны.
В многочисленных сосудах эндометрия наблюдалась облитерация внутрисосудистым трофобластом, что является признаком сохранения его инвазивного потенциала, способствующего усилению плацентарного кровотока и повышению доступности питательных веществ для развивающегося плода.
Следует отметить появление ранних признаков физиологической инволюции плаценты в пределах её спонгиозной зоны, в которой периферический трофобласт характеризуется дистрофическими изменениями и вакуолизацией цитоплазмы.
В целом в контрольной группе животных морфогенез плаценты характеризовался адекватной дифференцировкой тканевых элементов в соответствии с закономерной активностью механизмов, контролирующих физиологическое протекание и завершение бере-
менности при ограничении нарастания несоответствия между объёмом становления плацентарных структур и увеличением массы развивающегося плода.
В экспериментальной группе животных, которым инъецировали взвесь наночастиц в концентрации 0,5 мг/кг (рис. 2, табл.), развитие плаценты соответствовало уровню дифферен-цировки и объёму гистогенетических процессов, как и у интактных животных. Параметры формирования незрелых элементов хориона и масса плаценты не демонстрировали достоверного снижения достигнутых величин.
Несмотря на то, что действие порошка наночастиц не отразилось на плацентации и реализации всего комплекса морфогенетиче-ских процессов становления структур хориона, следует отметить нарастание патогномич-ности условий протекания беременности на
фоне выраженной токсикогенности вводимого вещества.
К концу гестационного периода в плаценте животных первой опытной группы наблюдалась распространённая атрофия балок лабиринтной зоны (рис. 2а). При этом резко возрастал объём лакун с материнской кровью с явлениями стаза и сладжирования эритроцитов, что, очевидно, обусловило снижение интенсивности гематоперфузии плаценты.
Дегенерация хориональных структур подтверждается и количественными парамет-
рами (табл.). В частности, и диаметр балок, и объём лабиринта достоверно снижаются.
Неблагоприятное изменение параметров структурно-функциональной динамики плаценты в группе животных, которым вводили взвесь наночастиц в концентрации 0,5 мг/кг, индуцировало ряд компенсаторных процессов. Так, в хориональном эпителии обнаруживались многочисленные симпластические почки, а также формировались новые балки, отрастающие от промежуточных дифференцированных ворсин (рис. 2 б).
а б
Рис. 2. Лабиринтная зона плаценты крыс из группы с введением 0,5 мг/кг наночастиц меди: а - атрофия структур хориона. Увел.: х 100; б - промежуточная ворсина с формирующейся балкой и пролиферацией хорионального эпителия. Увел.: х400. Окр. гематоксилином Майера и эозином
В рассматриваемой группе животных не обнаружено резорбирующихся плодов, а также не установлены факты достоверного снижения массы тела плодов. Таким образом, потенциал приспособительных процессов в связи с пластической активностью хориона и новообразованием балок позволил эффективно контролировать развитие токсического повреждения плацентарных структур и оптимизировать физиологическое завершение беременности.
Во второй экспериментальной группе с наибольшей концентрацией вводимого вещества произошло значимое ограничение возможностей активных приспособительных факторов восстановления функциональных параметров плаценты.
Верифицированы усугубление деструктивно-дегенеративных процессов и становление плацентарной недостаточности. Причинами последней, как видно из таблицы, являются выразительные, исключительно низкие, величины функционально-морфологической динамики трофически значимых структур плаценты. Резко снижены и диаметр балок, и объём активного лабиринта.
Важнейшим фактором патологического ограничения функциональных возможностей плаценты в третьей опытной группе является
незрелость провизорного органа. В пределах лабиринтной зоны обнаруживаются многочисленные островки недифференцированного трофобласта без элементов стромы и сосудистого аппарата (рис. 3а). Объём незрелого трофобласта характеризует несостоятельность плацентации, что выражается манифестирующими величинами объёмных параметров незрелости (табл.).
Задержка дифференцировки трофобласта и сохранение значительных объёмов незрелого трофобласта в позднефетальные периоды гестации нередко сопровождаются канализацией незрелого трофобласта. В образовавшихся каналах начинает циркулировать материнская кровь. Очевидна трофическая неэффективность названного процесса.
Нарушение тканевой детерминации трофобласта целесообразно считать причиной невозможности адекватной компенсации нарастающего повреждения хориона.
Кроме описанных выше процессов, обусловливающих плацентарную недостаточность в группе животных, которым инъецировали взвесь нанопорошка в концентрации 1 мг/кг, следует отметить наличие множественных очагов некроза и расплавления балок лабиринтной зоны (рис. 3б). Очевидно, что данное условие альтерации, фатально для разви-
тия плода, так как становится возможным утрату репродуктивного потенциала самок в
смешение материнской и фетальной крови. связи с невозможностью установления взаи-
В целом в третьей экспериментальной моотношений с эмбрионом и плодом. группе можно констатировать фактическую
а б
Рис. 3. Лабиринтная зона плаценты крыс из группы с введением 1,0 мг/кг наночастиц меди: а - островок незрелого трофобласта. Увел.: х100; б - зона некроза лабиринта. Увел.: х100. Окр. гематоксилином Майера и эозином
Заключение
Полученные результаты убедительно доказали токсичность наноструктурированно-го порошка меди. При поступлении данного вещества в организм с момента начала беременности происходит нарушение всего комплекса условий плацентации как структурного процесса становления взаимоотношений плода и материнского организма. В данном случае исключается возможность реализации механизмов дифференцировки тканевых элементов плаценты, что обусловливает известную степень незрелости органа и его функциональную недостаточность.
Проблема незрелости плаценты и синдром задержки развития плода - важнейшие направления формулировки целеполагания современных исследований в акушерстве, нео-натологии, репродуктологии [1-4]. Обоснова-
ние критериев незрелости, конкретных причин её наступления, патогенетических механизмов, всего диапазона реактивных процессов в модулировании закономерной гистогенетической динамики, регуляторных факторов - это совокупность задач, которые далеки от разрешения [5, 8,15]. Нет всей полноты обобщения данной проблемы относительно значения биомедицинских манипуляций в реализации соответствующих технологий.
Наноструктурированный порошок меди по результатам настоящего исследования является токсическим фактором тяжёлой патологии беременности. Использование наночастиц меди для диагностики или доставки лекарств во время беременности нецелесообразно.
Работа поддержана грантом Российского научного фонда (№ 14-36-00023).
Сведения об авторах статьи:
Боков Дмитрий Александрович - научный сотрудник лаборатории «Морфогенез и регенерация клеток и тканей» ГБОУ ВПО ОрГМУ Минздрава России. Адрес: 460050, г. Оренбург, ул. Советская, 6. Тел./факс: 8 (3532) 77-22-75. E-mail: cells-tissue.bokov2012@yandex.ru.
Слободсков Андрей Александрович - аспирант кафедры биохимии и микробиологии ФГБОУ ВО ОГУ. Адрес: 460018, г. Оренбург, Проспект Победы, 13.
Нотова Светлана Викторовна - д.м.н., профессор кафедры биохимии и микробиологии ФГБОУ ВО ОГУ. Адрес: 460018, г. Оренбург, Проспект Победы, 13.
ЛИТЕРАТУРА
Айламазян, Э.К. Иммуногистохимические критерии оценки функциональной зрелости плаценты / Э.К. Айламазян, Е.А. Лапина, И.М. Кветной // Журнал акушерства и женских болезней. - 2005. - Т. LIV. - Вып. 2. - С. 3-8.
Плацентарная недостаточность и полиморфизм генов глютатион-8-трансфераз М1, Т1, и Р1 / О.Н. Беспалова [и др.] // Журнал акушерства и женских болезней. - 2006. - Т. LV. - Вып. 2. - С. 25-31.
Экспериментальное моделирование токсикогенной патологии эмбриогенеза: экологические аспекты / Д.А. Боков [и др.] // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2015. - № 10. - С. 203-207.
Эмбриотоксическое значение низких доз формальдегида: структурные факторы, закономерности гестации, исходы беременности / Д.А. Боков [и др.] // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2014. - Т. 16, N° 5(2). - С. 665-667. Структурно-функциональные изменения плаценты под влиянием атмосферных загрязнений / Т.И Бонашевская [и др.] // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1985. - Т. LXXXVIII, № 2. - С. 72-76.
Изменение микроциркуляторного русла матки и её регионарных лимфатических узлов во время беременности / Ю.И. Бородин [и др.] // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1987. - Т. XCIII, № 12. - С. 40-43.
Влияние ультрамалых наночастиц золота на хроматин нативных спермиев мышей / С.Т. Захидов [и др.] // Известия РАН. Серия биологическая. - 2015. - № 6. - С.565-572.
2
3
4.
5
6
7
8. Золотухина, И.А. Функциональная морфология эпителия ворсин плаценты человека в разные сроки неосложнённой беременности: автореф. дис.... канд. биол. наук. - М., 2014. - 26 с.
9. Ижедерова, И.Р. Содержание биогенных аминов в структурах плаценты в норме и при антифосфолипидном синдроме / И.Р. Ижедерова, Н.Н. Голубцова, Т.Н. Охотина // Морфология. - 2007. - Т. 132, № 6. - С. 57-60.
10. Локализация антиапоптозного белка bcl-2 в плаценте человека / Д.Э. Коржевский [и др.] // Морфология. - 2007. - Т. 132, N° 6. -С. 75-76.
11. Милованов, А.П. Стандартизация методов морфофметрии плаценты человека / А.П. Милованов, А.И. Брусиловский // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1986. - Т. XCI, № 8. - С. 72-78.
12. Морфофункциональная характеристика щитовидной железы при введении наночастиц меди / В.С. Полякова [и др.] // Морфология. - 2015. - Т. 148, № 6. - С. 54-58.
13. Сетко, Н.П. Особенности биологического действия сернистых соединений на женский организм / Н.П. Сетко, А.А. Стадников, Т.А. Фатеева - М.: Медицина, 2004. - 192 с.
14. Степанов, П.Ф. Развитие микроциркуляторного русла матки в постнатальном периоде онтогенеза / П.Ф. Степанов, А.Г. Сапожников // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1987. - Т. XCIII, № 7. - С. 22-33.
15. Морфологические изменения в фетальной части аллантоисной плаценты крыс после действия острой гипоксии / Л.И Хожай [и др.] // Морфология. - 2007. - Т. 132, № 6. - С. 61-64.
УДК 616.345-007.271-089.84-092.6 © В.К. Есипов, И.И. Каган, А.Р. Курмашев, 2016
В.К. Есипов1, И.И. Каган1, А.Р. Курмашев2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ МИКРОХИРУРГИЧЕСКОГО КИШЕЧНОГО ШВА В УСЛОВИЯХ ОСТРОЙ ТОЛСТОКИШЕЧНОЙ НЕПРОХОДИМОСТИ
'ГБОУ ВПО «Оренбургский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Оренбург 2ГАУЗ «Оренбургская областная клиническая больница №2», г. Оренбург
Несостоятельность кишечных швов остается одной из актуальных проблем современной хирургической гастроэнтерологии, так как является основной причиной перитонита и высокой летальности. В эксперименте на 45 беспородных собаках через 24 и 48 часов после создания модели непроходимости выполняли релапаратомию, резекцию ободочной кишки с наложением микрохирургических анастомозов по типу «конец в конец». Анастомоз двухрядным швом Альберта - Шмиде-на сформирован 15 животным на фоне односуточной непроходимости. Приведены данные морфологического анализа заживления анастомозов ободочной кишки в зависимости от сроков развития непроходимости и вида шва. Определено значение особенностей микроанатомии стенки толстой кишки при непроходимости. Использование микрохирургической техники наложения анастомозов минимизирует операционную травму тканей, обеспечивает точную адаптацию гистологически однородных слоев стенки сшиваемых органов, способствует заживлению анастомозов по типу первичного с эпители-зацией слизистой оболочки в течение семи суток, снижает риск развития инфекционно-воспалительных осложнений в зоне операции.
Ключевые слова: ободочная кишка, микрохирургический шов, непроходимость.
V.K. Esipov, I.I. Kagan, A.R. Kurmashev EXPERIMENTAL AND MORPHOLOGICAL VALIDATION OF MICROSURGICAL INTESTINAL SUTURE IN CASE OF ACUTE LARGE BOWEL OBSTRUCTION
Incompetence of intestinal suture, being a main cause of peritonitis and high lethality, remains one of the up-to-date problems of modern gastrointestinal surgery. Under the terms of the experiment, 45 mongrel dogs were exposed to colonic obstruction simulation. 24 and 48 hours after simulation, they had relaparotomy and colon resection applying end-to-end microsurgical anastomoses. In 15 dogs anastomosis was formed using the double-row Albert suture and Schmieden suture after one-day colonic obstruction. In the study, the data of morphological analysis of colon anastomoses adhesion can be found, depending on the period of obstruction development and type of suture. The authors give the peculiarities of microanatomy of large intestine wall in case of obstruction. The use of microsurgical anastomotic technique reduces operational trauma of tissues, provides the adaptation of histologically homogeneous layers of the organs walls, contributes to anastomoses adhesion and epithelization of the mucous membrane during 7 days, reduces the risk of inflammatory complications development in surgery place.
Key words: middle intestine, microsurgical suture, obstruction.
Проблема оптимизации анастомозов при операциях на кишечнике остается одной из самых главных в хирургической гастроэнтерологии. Значимость этой проблемы возрастает при экстренной и неотложной резекциях кишки на фоне острой толстокишечной непроходимости (ОТКН). Частота несостоятельности швов при указанной патологии достигает 45,5% [14,15]. Для профилактики данного осложнения используют различные методы и
средства, такие как укрепление кишечных швов фибринколлагеновой субстанцией Та-хоКомб [11,12], укрепление зоны анастомоза демукозированным сегментом подвздошной кишки [10], введение препарата энтеросана [2], интубационная декомпрессия, санация и энте-росорбция с полифепаном [1] и др.
Успех оперативного вмешательства во многом зависит от технических деталей формирования анастомоза и прежде всего от тех-
