CC BY
15
Морфофункциональная характеристика фетоплацентарного барьера
при герпес-вирусной инфекции
Луценко М. Т., Андриевская И.А.
Morphofunctional characteristic of fetoplacentar barrier at the pregnancy complicated herpes-virus infection
Lutsenko M.T., Andriyevskaya I.A.
Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН, г. Благовещенск
© Луценко М.Т., Андриевская И.А.
При обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности на фетоплацентарный барьер повреждающее влияние оказывают интерлейкин, фактор некроза опухоли а, нитросоединения, приводящее к подавлению активности белка Bcl-
2 и увеличению активности каспазы-3.
Ключевые слова: герпес, синцитиотрофобласт, фактор некроза опухолей а, Bcl-2, каспаза-3.
Herpes-virus infection decrease of activity of villus Bcl-2 was increased in process of increase of a credit of antibodies to virus herpes. The increase of activity kaspasa-3 created action on DNK nucleus sincythiotrophoblast.
Key words: herpes, sincythiotrophoblast, tumor necrosis factor a, Bcl-2, kaspasa-3.
УДК 618.36:57.016.6:578.825.13
Введение
В настоящее время внимание специалистов привлекает частое обострение герпес-вирусной инфекции во время беременности [1, 9], приводящее к нарушению обмена основных веществ и ферментативных процессов в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты [3, 5, 10].
Причины, обусловливающие повреждение фетоплацентарного барьера при герпес-вирусной инфекции, могут быть разнообразными. Наименее изученными являются процессы, вызываемые сильнодействующими повреждающими факторами, такими как нитросоединения [6, 8], которые могут привести к активизации в синцитиотрофобласте каспазного цикла и снижению защитной функции белка Bd-2. Это провоцирует нарушение апоптоза в ядрах синцитиотро-фобласта ворсинок плаценты.
Материал и методы
Материалом для исследования послужила периферическая кровь и плаценты, полученные в результате своевременных родов на сроке 38—40 нед геста-ции. Обследовано 60 женщин с различной степенью
агрессивности герпесной инфекции первого типа: с титрами антител иммуноглобулина G (IgG) 1 : 1 600 (I группа), 1 : 6 400 (II группа) и 1: 12 800 (III группа). В каждую группу вошли по 20 беременных. Контрольную группу составили 20 женщин с неосложненным течением беременности.
Исследования проводились на базе стационара акушерского отделения клиники Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН (г. Благовещенск). Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и Правил клинической практики в Российской Федерации, утвержденных приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 № 226.
Плаценту получали в течение 10—15 мин после родов. Поверхность плаценты со стороны базальной пластинки отмывали большим количеством физиологического раствора (ФР). Плодовая часть плаценты (ворсинчатый хорион) срезалась скальпелем небольшими пластинками площадью до 2—3 см2, толщина срезаемого слоя не превышала 1 мм. Кусочки ткани помещали в
химические стаканы, содержащие 200 мл ФР, отмывали от клеток крови, перемешивая на магнитной мешалке в течение 15 мин. Для получения экстрактов отмытые кусочки плаценты слегка подсушивали на фильтровальной бумаге и взвешивали. Затем ткань растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной кремообразной массы. К полученному гомоге-нату добавляли ФР в объеме, равном изначальному весу ткани (на 1 г — 1 мл ФР). Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при температуре -20 °С в течение суток. Затем гомогенат размораживали и ультрацентрифугировали при 4 000 об/мин при температуре 4 °С. Надоса-дочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при температуре -20 °С до проведения имму-ноферментного анализа (ИФА).
В гомогенате плаценты белок Bcl-2, каспазу-3 и NO2- определяли, используя наборы компании Bender MedSystems (Австрия). По динамике титров антител IgG в периферической крови с помощью стандартных тест-систем фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) проводилась верификация вируса простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) и оценивалась степень агрессивности инфекции Анализ проводили на микропланшетном ридере Stat-Fax2100 (США). Электронно-микроскопические исследования выполняли по стандартным методикам с конечной заливкой в аралдит. Ультратонкие срезы изготавливали на ультрамикротоме LKB (Швеция), контрастировали уранилацетатом. Для просмотра и цифрового фотографирования использовали микроскоп Tesla (Чехия).
Морфологическая детекция апоптоза проводилась на парафиновых срезах плаценты по метке концов фрагментов ДНК по методу in situ end-labeling (ISEL) [4]. Содержание фактора некроза опухоли а (ФНО-а) определяли с помощью твердофазного ИФА с использованием наборов ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург).
Для световой микроскопии материал фиксировали в 0,5%-м растворе параформальдегида на 80%-м этаноле и заливали в парафин. На срезах иммуногисто-химически выявляли белок Вс1-2 с помощью моно-клональных антител (клон 124, Dako Cytomation, Дания).
Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты представлены в виде X ± m, где X — выборочное среднее
значение, т — стандартное отклонение. Статистически значимыми считали отклонения при уровне р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Проведенные исследования показали, что при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией, основными экзогенными индукторами влияния на фе-топлацентарный барьер ворсинок плаценты были в той или иной степени выраженности антигенная перегрузка и выработка иммунокомпетентными клетками ФНО-а. Количество ФНО-а в гомогенате плаценты в I группе составило (21,10 ± 0,08) пг/мл; во II группе — (84,3 ± ± 0,3) пг/мл и в III группе — (89,98 ± 0,34) пг/мл (в контроле — (11,6 ± 0,09) пг/мл).
В гомогенате плаценты на этом фоне резко нарастало содержание каспазы-3: в I группе (26,70 ± 0,08) нг/мл; во II группе — (79,50 ± 0,40) нг/мл и в III группе — (103,70 ± 0,80) нг/мл.
Одновременно оценивалась динамика содержания в этих же гомогенатах белка Вс1-2, являющегося анти-апоптозным фактором в клетках. В I группе содержание белка Вс1-2 нарастало и составило (9,24 ± 0,09) пг/мл (контроль — (3,80 ± 0,02)). Максимума содержание Вс1-2 достигало во II группе — (42,5 ± 0,6) пг/мл, но затем, по мере нарастания титра антител к вирусу герпеса до 1: 12 800, его содержание начинало резко снижаться — до (28,14 ± 0,70) пг/мл (таблица, рис. 1).
Динамика изменений содержания каспазы-3, белка Вс1-2 и N02^ в гомогенате плацент от женщин, перенесших в третьем триместре обострение герпес-вирусной инфекции
Показатель Контроль Группа I Группа II Группа III
Каспаза-3, нг/мл Белок Bcl-2, пг/мл no2-, мкмоль/л 19,00 ± 0,09 26,70 ± 0,05* 79,50 ± 0,40* 103,70 ± 0,80* 1з,80 ± 0,02 9,24 ± 0,09* 42,50 ± 0,30*1 28,14 ± 0,79* 20,31 ± 0,09 38,80 ± 1,50* 92,10 ± 1,20* 105,70 ± 1,50*
* Различия по сравнению с контролем p < 0,001.
Каспаза-3
Контроль Группа I Группа И Группа III Рис. 1. Взаимоотношения каспазы-3, Вс1-2 и М02- в гомогенате плаценты рожениц после перенесенной герпес-вирусной инфекции
Луценко М. Т., Андриевская И.А.
Морфофункциональнаяхарактеристика фетоплацентарного барьера..
По мере нарастания агрессивности герпес-вирусной инфекции в гомогенате плаценты увеличивалось содержание N0^. Антиапоптозная функция симпласта начинала снижаться, что и проявлялось в увеличении числа ядер в фетоплацентарном барьере в состоянии апоптоза до (4,00 ± 0,02)% (в контроле — 1,00 ± 0,01).
Рис. 2. Белок Вс1-2 в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты роженицы, не имевшей вирусных заболеваний во время беременности.
Иммуногистохимическая реакция. Ув. 400
Рис. 3. Белок Вс1-2 в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты роженицы, перенесшей вспышку герпес-вирусной инфекции в третьем триместре (титр антител к вирусу герпеса 1 : 12 800). Имму-ногисто-
химическая реакция. Ув. 400
Таким образом, проявление антиапоптозной функции клеток (в данном случае симпласта) зависит от концентрации антигена, возникающего в крови беременной при вспышке герпес-вирусной инфекции. Если на начальном этапе развития инфекции защитные свойства синцитиотрофобласта могут противостоять вступлению ядер в апоптоз, содержание белка
Сведения об авторах
Bcl-2 увеличивается почти в 11 раз по сравнению с контролем, то при тяжелой форме герпес-вирусной инфекции (титр антител 1 : 12 800) синтез Bcl-2 подавляется и создается благоприятная почва для преждевременного формирования апоптоза ядер в синцитиотрофобласте фетоплацентарного барьера (рис. 2, 3).
Заключение
Герпес-вирусная инфекция подавляет активность белка Bcl-2 в плаценте беременной и способствует наращиванию активности каспазы-3 и NO2-, увеличивая вхождение в апоптоз ядер симпласта ворсинок.
Литература
1. Андриевская И.А. Гормональные и микробицидные изменения у беременных с герпес-вирусной инфекцией // Бюл. физиологии и патологии дыхания. 2004. Вып. 17. С. 65—68.
2. Кобозева Н.В., Гуркин Ю.А. Перинатальная эндокринология. Л.: Медицина, 1986. 310 с.
3. Марусов А.П. Доклиническая форма позднего токсикоза беременных: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 1991. 32 с.
4. Погорелов В.М., Козинец Г.И. Гематология и трансфу-зиология. 1995. Т. 43, № 5. С. 21—24.
5. Протопопова Н.В., Колесникова Л.И., Ильин В.П. Метаболизм и гемодинамика у беременных с артериальной гипертензией. Новосибирск: Наука, 2000. 146 с.
6. Реутов В.П. Изучение механизмов восстановления ионов NO2- в крови и митохондриях клеток тканей млекопитающих: дис. ... канд. биол. наук. М., 1988. 245 с.
7. Реутов В.П., Орлов С.Н. Физиологическое значение гуа-нилатциклазы и роль окиси азота и нитросоединений в регуляции активности этого фермента // Физиология человека. 1993. № 19 (1). С. 124—135.
8. РеутовВ.П., КаюшинЛ.П., СорокинаЕ.Г. Физиологическая роль цикла окиси азота в организме человека и животных // Физиология человека. 1994. № 20 (3). С. 165—174.
9. Соловьёва А.С., Луценко М.Т. Характеристика местного иммунитета на поверхности небных миндалин у беременных с герпес-вирусной инфекцией // Дальневост. мед. журн. 2007. № 3. С. 22—24.
10. Cambein J., Jacgueson V. At the level of serum triglycerides a significant predictor of coronary death in normocholes-terolemic subjects // Amer. J. Epidimiol. 1986. V. 124. № 4. P. 624—632.
11. Demura R., Odagiri E., Yoshimura M. Placental secretion of prolactin. ACTH and immunoreactive P-endorphin during pregnancy // Acta endocrinol (Kbh). 1982. V. 100. № l. P. 114—119.
Поступила в редакцию 13.08.2009 г. Утверждена к печати 17.03.2010 г.
М. Т. Луценко — академик РАМН, советник при дирекции Дальневосточного НЦ физиологии и патологии дыхания СО РАМН (г. Благовещенск). И.А. Андриевская — канд. биол. наук, научный сотрудник Дальневосточного НЦ физиологии и патологии дыхания СО РАМН (г. Благовещенск). Для корреспонденции
Луценко Михаил Тимофеевич, e-mail: Lucenko@mail.ru, tatiana1383@list.ru
