CC BY
57
УДК: 616.831
МОРФО-ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕЙРОНОВ БАЗАЛЬНОГО ЯДРА МЕЙНЕРТА НА МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА В УСЛОВИЯХ ПРОТЕКЦИИ ГАЛАРМИНОМ
А.В. ВАРДАНЯН1, К.В. КАРАПЕТЯН1, М.Б. АЛИЕВА2
'Институт Физиологии имени Л. А. Орбели, Ереван, Армения 2Западно-Казахстанский государственный медицинский университет имени Марата Оспанова,
Актобе, Казахстан
Варданян А.В. - врач-нейроэндокринолог, к.б.н.,
моб.тел.: +374 94 92 43 66, e-mail: anahit5551786@mail.ru: Карапетян К.В. - млад. науч. сотрудник,
моб. тел.: +374 91 60 70 59, e-mail: Karapetyanchristine@gmail.com;
Алиева М.Б. - резидент 1 года обучения по специальности «Невропатология, в том числе детская», моб. тел.: +7 747 611 3214, e-mail: malyakosha@mail.ru.
Аннотация. В структуре нейродегенеративных заболеваний в мире лидирующие позиции занимают болезнь Альцгеймера, инсульты, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, характеризующиеся высокими показателями смертности и инвалидизации.
В данной статье представлены результаты эксперимента, освещающие вопросы механизма возникновения болезни Альцгеймера. Изучение нейронов базального ядра Мейнерта (БЯМ) проводилось морфогистохимическим способом с систематическим применением препарата «Галармина» на модели болезни Альцгеймера (БА). Изучение нейронов БЯМ осуществлялось путем выявления активности кислой фосфатазы, с целью определения патологических сдвигов и эффекта протекции в отдельных экспериментах.
Представлены данные о токсичности и разрушительном воздействии растворимых олигомеров Aß на межклеточные нейротрансмиттерные сигналы и протекторные возможности препарата Галармина.
Ключевые слова: Болезнь Альцгеймера, базальное ядро Мейнерта, Галармин.
Актуальность. Болезнь Альцгеймера самая частая причина деменций у пожилых людей, поражающая более 26 миллионов человек в мире. Клиническая характеристика болезни - прогрессирующая потеря памяти и спад когнитивных способностей. Когортные исследования свидетельствуют о заболеваемости порядка 10-15 новых случаев на тысячу человеко-лет для всех типов деменции и 5-8 случаев для болезни Альцгеймера [1; 2], что составляет приблизительно половину от общего числа ежегодных диагнозов. Существуют и половые различия, например, женщины чаще заболевают болезнью Альцгеймера, особенно после 85 лет. Представлены доказательства токсичности и разрушительного воздействия растворимых олигомеров Ар на межклеточные нейротрансмиттерные сигналы, ведущие к редукции синаптической интеграции [6]. Однако неизвестно: инициируют ли отмеченные олигомеры Ар механизмы торможения синаптической пластичности, потери синапсов и гибели нервных клеток при БА [10]. Нейрональные ацетилхолиновые рецепторы широко представлены в нейронах ядра Мейнерта (ЯМ), гиппокампа и играют важную роль в
нейроглиальных взаимодействиях. Ацетилхолиновые рецепторы - члены суперсемейства пентамерных лигандуправляемых ионных каналов, включающих ГАМК рецепторы.
«Холинергическая гипотеза» БА подразумевает снижение, нарушение или изменение холинергических механизмов. Основным нейропатологическим признаком пациентов с БА является потеря холинергических нейронов в базальных ганглиях [9]. Интенсивно исследуется также роль никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) в механизмах синаптической пластичности и молекулярных взаимодействий с Ар, а также Ар-индуцированной дисрегуляции функций nAChR, лежащей в основе синаптической недостаточности при БА. Нейрональные ацетилхолиновые рецепторы широко представлены в нейронах ЯМ, гиппокампе и играют важную роль в нейроглиальных взаимодействиях.
Согласно гипотезе «амилоидного каскада» в головном мозге (в особенности в гиппокампе и коре мозга), неравномерное распределение продуцирования и/или очистки Ар, ассоциированное со старением, приводит к постепенной аккумуляции и агрега-
ции пептида, инициирующего нейродегенеративный каскад, который включает отложение амилоида, воспаление, оксидантный стресс, повреждение и гибель нейронов [5]. В поддержку гипотезы «амилоидного каскада» изучения на животных показали, что олигомерные и фибриллярные формы Ар вызывают нарушение длительной потенциации, синаптическую дисфункцию и ускоряют формирование нейро-фибрилярных нитей, что в конечном итоге вызывает синаптическую недостаточность и нейрональную гибель.
Холинергические базальные ядра переднего мозга (ChBF) являются большими нервными путями, над которыми холинергические нейроны проникают в гиппокамп и мозговую кору, а эти ядра являются ключевыми для памяти, концентрации и других когнитивных функций [8]. В большинстве экспериментов на животных, удаление холинергических нейронов или обработка холинергическими антагонистами, такими как скополамин или гиосцин, показаны данные, вызывающие недостаточность памяти и других когнитивных функций [8]. Гипофункция холинергических нейронов в ChBF и в мозговой коре ухудшает у пациентов с БА когнитивные функции. Холинестеразные ингибиторы (CEI) ривастигмин, донепезил и галантамин - подавляют ацетилхолинестеразную активность, уменьшающую холинергическое повреждение и ведущее к некоторым улучшениям в поведении, концентрации, социальном вовлечении, а также когнитивных функций. Но они имеют недостаток - это побочные эффекты и лекарственная устойчивость [4] при длительном применении. Однако, глутаматергический NMDA рецепторный антагонист мемантин, может также предотвратить гибель холинергического нейрона вызванную амилоидом, и предполагает добиться хороших результатов, если применить в комбинации с CEI [8]. Синаптическая дисфункция и нейрональная гибель при БА затрагивает в первую очередь базальные ганглии, холинергическую систему, Амигдалу, гиппокамп и некоторые корковые области. Однако, усиление холинергической функции, опосредованное ингибированием AChE, обеспечивает временное и частичное облегчение симптомов [7].
Цель исследования. Морфо-гистохимическое изучение нейронов БЯМ на модели болезни Альцгеймера в условиях протекции «Гилармином» с помощью метода выявления активности кислой фосфатазы.
Материалы и методы. Исследование проводилось на 33 половозрелых крысах-самцах породы Альбино, массой 200-250 гр., в 3 сериях
экспериментов:
1. на интактных;
2. на амилоидной модели БА, индуцированной билатеральным интрацеребровентрикулярного введения АЬ 25-35;
3. и с протекцией «Галармином» (обогащенного пролином пептида- PRP-1), из расчета 10у/100 г (со следующего дня 7 инъекций Галармина через день).
Препарат «Галармин», получаемый из гипоталамуса крупного рогатого скота, был открыт лет 20 назад академиком НАН РА, иностранным членом Российской академии наук Арменом Анушевановичем Галояном. Накоплен большой опыт исследования данного препарата. Уникальность «Галармина» состоит в том, что, будучи мощнейшим иммуномодулятором, он регулирует иммунную систему организма и воздействует на заболевания, связанные со снижением иммунитета. Препарат не вызывает побочных эффектов. Коллективу Института физиологии имени Л.А. Орбели (г. Ереван) удалось не только выделить это соединение, но и установить его молекулярную массу и структуру, освоить процесс его синтеза. Институт физиологии имени Л.А. Орбели является единственным институтом в Закавказье, который может заниматься синтезом этого препарата.
При проведении экспериментов строго следовали правилам ухода за лабораторными животными. Интрацеребровентрикулярное введение токсического олигомера АЬ 25-35 осуществляли в условиях нембуталового наркоза (40 мг/кг, в/б) по координатам стереотаксического атласа (АР-1, L±1.5, DV+3.5 мм) [Paxinos, Watson]. Вводили по 3 мкл 10-9 М фрагменты бета-амилоидного пептида АЬ 25-35 (1 мг/мл при t 37°С, агрегированного в течение 4 дней). Морфогистохимические исследования проводили методом выявления активности Са2+-зависимой кислой фосфатазы (КФ) на основе метода Гамори. Данный методический подход основан на выявлении внутриклеточных фосфорсодержащих соединений, занимающих ключевые позиции в обменных энергетических процессах, направленных на сохранение и самовоспроизведение витальных систем. Метод воспроизводим, адекватен, избирательно выявляет КФ, который является важнейшим Са2+-зависимым маркером деятельности нейрона. Это является важным критерием надежности его использования и в сравнительном аспекте он высоко воспроизводим как на интактном, так и на патологическом материале. Помимо гистохимического значения, метод представляет определенный морфологический интерес. Полученная картина обладает большой информативностью и позволяет судить об определенных звеньях метаболизма
исследуемых структур и о морфогистохимических изменениях в мозгу. На светлоокрашенном фоне препарата нервные структуры выявляются четко, постоянно воспроизводимы, что является важным критерием надежности метода. Кусочки мозга фиксировались в 5% нейтральном формалине, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере рН 7.4. Для лучшей стабилизации фосфора и в целях предотвращения аутолиза фиксация производилась при 4°С в течение 48 часов. Из кусочков мозга готовились замороженные срезы толщиной 60 мкм, промывались в дистиллированной воде и переносились в инкубационную смесь для избирательного выявления нервных клеток: 20 мл 0,38% раствора уксуснокислого свинца, 5 мл 1М ацетатного буфера рН 5.6, 5 мл 2% раствора Ь-глицерофосфата натрия. Инкубацию проводили в термостате при 37°С от 1 до 2-х часов. Затем следовали промывка срезов в дистиллированной воде, проявка в растворе сульфата натрия и, после повторной промывки, заключение в бальзам с последующим описанием препаратов.
Результаты исследования. У крыс, получавших Галармин в течение 14 дней после введения Ар 2535, наблюдается восстановление формы, размеров клеток, с реагирующими отростками. У всех нейронов БЯМ выявляются не только апикальные дендриты, но и боковые ветвления (рис.1 А-Г). В цитоплазме нейронов появляются зернышки осадка фосфата свинца, однако эти зерна длиннее и тоньше. Внутри
цитоплазмы они образуют спиралевидные или глыбчатые образования, что характерно для первично раздраженных нейронов, находящихся на пути к восстановлению (рис.1 Г). Вокруг перикарионов и отростков появляются овальные, веретенообразные зернышковые грануляции (рис.1 Б, В). Нейроны БЯМ выглядят несколько затемненными, в сравнении с таковыми интактными крысами (Рис.1 А-В). Ядра занимают центральное положение как и у интактных крыс. Однако, в отличие от интактных животных, под воздействием Галармина ядра нейронов БЯМ увеличиваются в размере и интенсивно окрашиваются (рис.1 Б, В). Ядерная локализация кальция фосфатазы дает основание предположить, что ядро подвергается динамической реорганизации. Более того, межнейронный контакт настолько выражен, что создается впечатление слившихся клеток (рис.1 В, Г). При введении «Галармина» на всех срезах БЯМ реагируют ядра сателлитной глии и кровенаполненные сосуды, на наружной стенке которых видны темные перициты с отростками (Рис.1 А-Г). Таким образом, выявлена реакция кровеносных сосудов (ангиогенез).
Обсуждение полученных данных. В настоящих морфо-гистохимических исследованиях при Ар-индуцированной нейродегенерации характерным морфологическим признаком явились "пробелы", характеризующиеся исчезновением реакции нейронов в БЯМ. В БЯМ морфологическая картина напоминает сморщивание нервных клеток, которое относится к
Рис. 1. Микрофотографии нейронов Базального ядра Мейнерта крыс через 3 месяца после двухсторонней ИЦВ инъекции Ар 25-35, сочетанного с 7-и кратным введением Галармина (восстановление нормальной морфологии нейрона; увеличение плотности расположения нейронов; реакция отростков; восстановление формы, размеров и ферментной активности нейронов; черная стрелка - кровеносные сосуды с перицитами; головка стрелки - центральное расположение ядер нейронов; белая стрелка - глиоз). Выявление активности Са2+-зависимой КФ. Оптич. ув.: 160 (А); 400 (Б); 1000 {В, Г).
одному из видов клеточной патологии, наблюдаемой при разнообразных, особенно хронических заболеваниях. Однако важным критерием оценки степени поражения клетки является степень поражения ядра. Настоящие данные указывают, что, в основном, ядро нейронов стремилось сохранить жизнедеятельность путем перемещения к периферии клетки, где, по-видимому, отмечаются более благоприятные условия. Дегенеративные процессы затрагивают в основном эктодермические элементы ЦНС. Старческие пластинки являются специальной формой перерождения эктодермальной ткани. Еще в начале прошлого века Айкеленбумом и соавт. [3] было установлено, что ключевым шагом в формировании пластины является экстраклеточное отложение инородного вещества, которое провоцирует воспалительную реакцию, сопровождаемую регенеративным ответом окружающих нервных волокон. Современные находки ведут к мнению, что амилоидная пластина является очагом неиммунно опосредованного хронического воспалительного ответа, локально вызванного отложением
фибриллярного Ар. Результаты настоящих исследований по систематическому применению Галар-мина на модели БА позволяют предположить, что при этом наблюдаются положительные изменения структурных свойств нейронов изученных областей мозга, тенденция к нормализации их структуры, увеличение плотности расположения нейронов в полях в БЯМ, повышение метаболизма, усиление Са2+-зависимых процессов фосфорилирования в сравнении с повреждением, что определяет клеточное выживание. В БЯМ выявлен также феномен тесного межнейронного контакта, по-видимому, в качестве выражения компенсаторно-адаптивных свойств нейрона. Настоящие исследования по применению Галармина на модели БА в широком спектре с вовлечением структур долговременной (БЯМ) памяти позволяют считать, что при своевременном и энергичном лечении значительная часть клеточных морфо-функциональных изменений может быть обратимой. Морфо-гистохимические изменения нейронов БЯМ на модели БА характеризуются общей тенденцией структурно-метаболической дисфункции: нарушением формы, центральным хроматолизом, наличием светлого эктопированного ядра с увеличенным ядрышком, изменением реакции нейрофибрилл, отстутствием реакции отростков, накоплением гиперфосфорилированных образований, наличием пространств с отсутствием клеточной реакции и нарушением СА2+-зависимого фосфорили-рования.
Вывод. В условиях протекции «Галармином» на модели БА, подтвержденные по данным
электрофизиологии, получены положительные изменения с повышением метаболизма, что характеризует клеточное выживание, с нормализацией структуры, усиление СА2+-зависимого фосфорилирования, феномен межнейронного сближения, повышение метаболизма и предотвращение нейродегенерации, приводящей к гибели нейронов.
Список литературы:
1. Bermejo-Pareja F., Benito-León J., Vega S., Medrano M.J., Román G.C. «Incidence and subtypes of dementia in three elderly populations of central Spain» // J. Neurol. Sci. - 2008. - V. 264, № 1-2. - P. 63-72;
2. Di Carlo A, Baldereschi M, Amaducci L, et al. «Incidence of dementia, Alzheimer>s disease, and vascular dementia in Italy. The ILSA Study» // J. Am. Geriatr.Soc.-2002.-V.50, № 1.-P. 41-48.
3. Eikelenboom P., Veerhuis R., Scheper W., Rozemuller A.J.M., van Gool W.A., Hoozemans J.J.M. «The significance of neuroinflammation in un-derstanding Alzheimer's disease» // J. Neural Transmission. -2006. - V. 113. - P. 1685-1695.
4. Hake A.M. «Use of cholinesterase inhibitors for treatment of Alzheimer disease» // Cleve Clin. J. Med.-2001.-V. 68.-P. 608-616.
5. Hardy J., Selkoe D.J. «The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics» // Science. - 2002. - V. 297. - P. 353-356.
6. Lacor P.N., Buniel M.C., Furlow P.W. et al. «A-beta oligomer-induced aberrations in synapse composition, shape, and density provide a molecular basis for loss of connectivity in Alzheimer's disease». Journal of Neuroscience 2007, V. 27, P. 796-807.
7. Lindvall O., Kokaia Z. «Stem cells for the treatment of neurological disorders» // Nature. - 2006. - V. 441.-P. 1094-1096.
8. Nyakas C., Granic I., Halmy L.G., Banerjee P., Luiten P.G. «The Basal Forebrain Cholinergic System in Ageing and Dementia. Rescuing cholinergic neurons from Neurotoxic Amyloid-beta42 with Memantine» // Behav. Brain Res. - 2011. - V. 221. - P. 594-603.
9. Schliebs R., Arendt T. «The significance of the cholinergic system in the brain during aging and in Alzheimer's disease» // Journal of Neural Transmission. - 2006. - V. 113. - P. 1625-1644.
10. Shankar G.M., Li S., Mehta T.H. et al. «Amyloid-beta protein dimers isolated directlyfrom Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory» // Nature Medicine. - 2008. - V 14. - P. 837-842.
ТУЙ1Н
ГАЛАРМИННЩ ЦОРГАНЫСЫ ШЕЦБЕР1НДЕ АЙЛЬЦГЕЙМЕР АУРУЫНЬЩ МОДЕЛ1НДЕ МЕЙНЕРТ БАЗАЛЬДЫ ЯДРОСЫНЬЩ НЕЙРОНДАРЫН МОРФО-ГИСТОХИМИЯЛЬЩ ЗЕРТТЕУ
А.В. ВАРДАНЯН1, К.В. КАРАПЕТЯН1, М.Б. АЛИЕВА2
'Л.А. Орбели атындагы Физиология институты, Ереван, Армения 2Марат Оспанов атындагы Батыс К^азакстан мемлекетпк медицина университетi, Актебе, К^азакстан
Варданян А.В. - дэрпер-нейроэндокринолог, б.г.к.,
^ялы тел.: +374 94 92 43 66, e-mail: anahit5551786@mail.ru;
Карапетян К.В. - Krni гылыми кызметкер,
моб. тел.: +374 91 60 70 59, e-mail: Karapetyanchristine@gmail.com Алиева М.Б. - «Невропатология, соньщ шщде балалар невропатологиясы» мамандыгы бойынша 1-шi оку жылгы резидент, ^ялы тел.: +7 747 611 3214, e-mail: malyakosha@mail.ru.
Элемдш жетекш орында нейродегенеративтi аурулардын к¥рылымында Альцгеймер ауруы, инсульт, бYЙiр амиотрофиялык склероз, Хантингтон ауруы, Паркинсон ауруы елiм-жiтiм мен мугедектжгщ жогары каркынымен сипатталады. Б^л макалада Альцгеймер сыркаты жайындагы с^рактарды жангыртатын тэжiрибе нэтижелерi келтiрiлген. Базальды Мейнерт тушндюшщ нейрондарынын зерттелуi Альцгеймер сыркатынын кершанде Галармин препаратын жYЙелi тYPде морфогистохимиялык тэсiлмен жYргiзiлдi. Мейнерт базальды торабында нейрондарды зерттеу жекелеген эксперименттер патологиялык езгерiстер мен протекциялык эсерiн аныктау Yшiн кышкыл фосфатаза кызметiн аныктау аркылы жYзеге асырылды. Галармин препаратынын корганыс мумкшджгерше жэне жасушааралык нейротрансмитпк белгiлерiне ерiтiндi АВ олигамерлерiнiн кYЙретпелi ыкпалы мен уытгандыратындыгы туралы дэлелдi мэлiметтер келтiрiлген.
Нег1зг1 свздер: Альцгеймер ауруы, Мейнерт базальды ядросы, Галармин.
SUMMARY
MORPHO-HISTOCHIMIC STUDY OF NEUTRONS OF BASIN MAINERT NUCLEUS ON MODEL OF ALZHEIMER'S DISEASE IN CONDITIONS OF PROTECTION WITH GALARMIN
IN COMPARISON WITH NORM (review)
'A.V. Vardanyan, 'K.V. Karapetyan, 2M.B. Alieva
NAS of the Republic of Armenia (Yerevan), LA Orbeli Institute of Physiology West Kazakhstan Marat Ospanov State Medical University, Aktobe, Kazakhstan
A.V. Vardanyan - neuroendocrinologist, PhD of Biological Sciences
phone number: +374 94 92 43 66, e-mail: anahit5551786@mail.ru;
Q.V. Karapetyan - junior research associate,
phone number: +374 91 60 70 59, e-mail: karapetyanchristine@gmail.com M.B. Alieva - 1 year residency student of the specialty "Neuropathology, including children", phone number: +7 747 611 3214, e-mail: malyakosha@mail.ru.
In the structure of neurodegenerative diseases in the world, Alzheimer's disease, strokes, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, Parkinson's disease, leading to high rates of mortality and disability, occupy the leading positions.
This article presents the results of an experiment on the mechanism of Alzheimer's disease. The study of the neurons of the basal nucleus of Meinert (BNM) was carried out in a morpho-histochemical manner with the systematic use of the preparation "Galarmine" on the model of Alzheimer's disease. The neurons were studied by detection of the activity of
acid phosphatase, in order to determine pathological shifts and the effect of protection in individual experiments.
Data on the toxicity and destructive effect of soluble Ap oligomers on the intercellular neurotransmitter signals and the protective potential of the Galarmine preparation are presented..
Key words: Alzheimer's disease, basale nucleus of the Meynert, Galarmine.
