Морфо-функціональний стан печінки та зміни біохімічних показників крові щурів, які зазнали дії наночасток сульфіду свинцю у віддалені терміни дослідження Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

УДК 543.272.82:616.36:576.31:616.15:577.1-092.9-071

С.Т. Омельчук, В.Д. Алексійчук

МОРФО-ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ПЕЧІНКИ ТА ЗМІНИ БІОХІМІЧНИХ ПОКАЗНИКІВ КРОВІ ЩУРІВ, ЯКІ ЗАЗНАЛИ ДІЇ НАНОЧАСТОК СУЛЬФІДУ СВИНЦЮ У ВІДДАЛЕНІ ТЕРМІНИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Національний медичний університет ім. О. О. Богомольця

кафедра гігієни харчування

(зав. - д. мед. н., проф. С.Т. Омельчук)

пр. Перемоги, 34, Київ, 03057, Україна

Bogomolets National medical university

Department of nutrition hygiene

Peremogi av., 34, Kyiv, 03057, Ukraine

e-mail: aleksiychuk2010@ukr.net

Ключові слова: наночастки сульфіду свинцю, аланінамінотрансфераза, аспартатамінотрансфераза, печінка Key words: nanoparticles of lead sulphide, liver, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase

Реферат. Морфо-функциональное состояние печени и изменение биохимических показателей крови крыс, которые подверглись действию наночастиц сульфида свинца в отдаленные сроки исследования. Омельчук С.Т., Алексийчук В.Д. В последнее время в рамках технического прогресса возникло огромное количество наночастиц, с которыми человек неосознанно вступает в контакт в результате промышленной деятельности и в повседневной жизни. Особого внимания заслуживает ситуация, которая касается наночастиц свинца, поскольку возможность их образования в производственном процессе является достаточно большой, а характер воздействия на организм до сих пор мало изучен. Целью работы было определение характера морфологических изменений печени и динамики соответствующих биохимических изменений крови под действием наночастиц сульфида свинца различных размеров и нитрата свинца при долговременном введении веществ сразу и в отдаленные сроки. Исследовали активность ферментов АЛТ и ACT в сыворотке крови колориметрическим методом с набором реактивов Филисит-Диагностика. Материалами морфологических исследований послужили гистологические срезы фиксированных препаратов печени, полученных в результате плановой экспериментальной тематики. Исследования показали, что при длительном действии наночастиц сульфида свинца (1 и 2 группы) и ионной формы нитрата свинца (3 группа) происходит рост активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы с одинаковой интенсивностью. В постэкспозиционный период происходит снижение показателей активности ферментов АсАТ и АлАТ. В ходе морфологического исследования внутренних органов экспериментальных животных выявлено наличие дистрофических изменений в паренхиме печени, реактивных изменений стромы и сосудистых реакций, интенсивность которых более выражена при 60-кратном введении исследуемых веществ (12 недель) и менее выражена при 60-кратном введении этих же веществ с учетом постэкспозиционного периода (18 недель). Полученные результаты будут учтены в последующих этапах исследования.

Abstract. Morpho-functional state of the liver and changes of blood biochemical parameters in rats exposed to lead sulfide nanoparticles in the remote terms of research. Omelchuk S.T., Aleksiychuk V.D. Recently, in the framework of technical progress a huge amount of nanoparticles arose, and unknowingly people come into contact with them as a result of industrial activities and in everyday life. Particularly noteworthy is the situation that concerns lead nanoparticles, because the possibility of its formation in the manufacturing process is sufficiently large, and the impact on the body is still poorly understood. The aim of our work was to determine the nature of morphological changes in the liver and dynamics of corresponding blood biochemical changes under exposure to lead sulfide nanoparticles of different sizes and lead nitrate in long-term administration of substances immediately and in long-term periods. Alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) activity in blood serum was studied by a colorimetric method with a set of «Phyllis Diagnostics» reagents. Histological sections of fixed liver preparations derived from routine experimental subjects served as materials for morphological studies. Studies have found that in long-term exposure to lead sulphide nanoparticles (groups 1 and 2) and ionic form of lead nitrate (group 3) activity of ALT and AST increases with the same levels of intensity. Decrease of activity of ALT and AST enzymes takes place in the postexposure period. Morphological examinations of internal organs of experimental animals revealed presence of dystrophic changes in the liver parenchyma, reactive changes in hepatic stroma and vascular reactions, the intensity of which was more clearly marked in 60-fold administration of the test substances (12 weeks) and is expressed less in 60fold administration of the same substances, taking into account the post-exposure period (18 weeks). The results will be taken into consideration at the subsequent stages of the study.

14/ Том XIX/ 2

139

ПРОФІЛАКТИЧНА МЕДИЦИНА

Останнім часом у рамках технічного прогресу виникла величезна кількість наночасток, з якими людина неусвідомлено вступає в контакт у результаті промислової діяльності та в повсякденному житті. Все більше уваги заслуговують наночастки, що утворюються промисловим шляхом. Ця проблема потрапила в поле зору токсикології, гігієни та організації захисту прав споживачів і безпеки праці [6, 7].

Унікальність наночасток базується на тому, що при зменшенні розмірів фізичні моделі часток також починають видозмінюватися. Фі-зико-хімічна структура наночасток впливає на їх поведінку в організмі [2].

Особливої уваги заслуговує ситуація, яка стосується наночасток свинцю, оскільки можливість їх утворення у виробничому процесі є досить великою, а характер дії на організм досі досконало не вивчений.

Відомо, що саме печінка зазнає максимального навантаження при дії хімічних пато-генів. Саме це й зумовлює актуальність поглибленої оцінки морфо-функціонального стану тканин печінки та біохімічних змін ферментів крові лабораторних тварин.

Метою роботи було визначення характеру морфологічних змін печінки та динаміки відповідних біохімічних змін крові під дією наночасток сульфіду свинцю різних розмірів та нітрату свинцю за умови довготривалого введення речовин одразу та у віддалені терміни.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводили на щурах-самцях лінії Вістар вагою 160-180 гр. Утримували тварин в умовах віварію на стандартизованому харчовому раціоні з вільним доступом до питної води. Тварини були розподілені на чотири групи по 30 тварин у кожній групі. Досліджувані препарати вводилися внутрішньоочеревинно 5 разів на тиждень (моделювання робочого тижня) у концентраціях з розрахунку 1/100 ЛД50 за свинцем для іонних форм, ЛД50 нітрату свинцю становить 150 мг/кг. 1/100 ЛД50 нітрату свинцю = 1,5 мг/кг, що становить 0,94 мг Pb/кг. Першій групі тварин вводився колоїдний розчин наночасток сульфіду свинцю розміром 10 нм у дозі 1,08 мг/кг (у перерахунку на свинець - 0,94 мг/кг свинцю). Другій групі - колоїдний розчин наночасток сульфіду свинцю розміром 30 нм у дозі 1,08 мг/кг (у перерахунку на свинець - 0,94 мг/кг свинцю). Третій групі - розчин нітрату свинцю в іонній формі розміром 400 нм у дозі 1,5 мг/кг (у перерахунку на свинець - 0,94 мг/кг свинцю). Четвертій групі (контрольній) вводився 1 мл фізіологічного розчину. Було проведено дві серії експе-

риментів. У першій серії досліджувані речовини вводилися 60 разів протягом 12 тижнів, у другій серії оцінювались віддалені ефекти через 6 тижнів після 60 введень досліджуваних речовин (сумарно 18 тижнів) [5].

Експеримент проводили відповідно до конвенції Ради Європи щодо захисту хребетних тварин, яких використовують у наукових цілях. По закінченню періоду експозиції тварин зне-живлювали під легким ефірним наркозом шляхом декапітації. Забирали кров та внутрішні органи для подальшого дослідження. Досліджували активність ферментів АЛТ та ACT у сироватці крові колориметричним методом з набором реактивів Філісіт-Діагностика [3].

Статистичну обробку результатів вимірів проводили з використанням пакета статистичних програм Statistica 4.0 (Statistica Inc. США), Biostat і MS Excell. Відмінності між групами встановлювали, використовуючи параметричний критерій t-Стьюдента при нормальному розподілі та непараметричний критерій Манна-Уїтні-Віл-коксона при відсутності доказів нормальності розподілу. Достовірними вважали відмінності з рівнем значущості більше 95% (p<0,05) [1].

Матеріалами досліджень послужили гістологічні зрізи фіксованих препаратів печінки, одержаних у результаті планової експериментальної тематики: "Органи нервової, імунної та сечостатевої систем в умовах експериментального пошкодження"; 2012-2014 рр., №.0112U001113. Препарати фіксували в розчині 12%-го формаліну на фосфатному буфері (рН=7,0-7,2). Зневоднення проводили за традиційною схемою використання батареї спиртів зростаючої концентрації від 30° до абсолютного. Парафіново-целоїдинові блоки різали за допомогою мікротома. Забарвлювали зрізи залежно від потреб дослідження (гематоксиліном і еозином, азур II-еозином). Аналіз структурно-функціональних порушень проводили за допомогою аналізатора зображень: мікроскопа Olympus BX51 з цифровою камерою C-4040zoom та персонального комп'ютера [4].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Проведені дослідження показали, що в печінці щурів після експозиції наночастками сульфіду свинцю і нітрату свинцю спостерігаються біохімічні зміни крові порівняно з відповідними показниками контрольної групи тварин (рис.).

Визначення активності ензимів у крові лабораторних тварин за 60 введень досліджуваних речовин показало, що активність АлАТ достовірно зростає в 2,5 рази (з 0,29±0,04 мкмоль/год*мл

140

МЕДИЧНІ ПЕРСПЕКТИВИ

до 0,76±0,05 мкмоль/годхмл, р<0,05) у крові щурів, які зазнали впливу наночасток сульфіду свинцю розміром 10 нм (1 група), та в 3,5 рази (з 0,29 ± 0,04 мкмоль/годхмл до 1,06±

± 0,02 мкмоль/годхмл, р<0,05) при дії наночасток

сульфіду свинцю розміром 30 нм (2 група), а також у 3 рази при дії нітрату свинцю розміром часток 400 нм (з 0,29±0,04 мкмоль/годхмл до 0,94±0,05 мкмоль/годхмл, р<0,05) (табл.1).

lIPbSnanol

■ PbSnano2

■ Р b{ IN 03)

■ контроль

Біохімічні зміни крові (аланінамінотрансфераза, аспартатамінотрансфераза (мкмоль/год*мл) та їх співвідношення (у.о.)) у щурів, що зазнали токсичної дії наночасток сульфіду свинцю розміром 10 нм (PbSnano1), сульфіду свинцю розміром 30 нм (PbSnano2) та іонних форм нітрату свинцю розміром 400 нм

(Pb(NO3))

Визначення активності ензимів у крові лабораторних тварин у постекспозиційний період показало, що активність АлАТ у крові щурів достовірно збільшується до 0,56±0,02 мкмоль/годхмл (р<0,05) при дії наночасток сульфіду свинцю розміром 10 нм (1 група) та до 0,52±0,02 мкмоль/годхмл

(р<0,05) при дії наночасток сульфіду свинцю розміром 30 нм (2 група), також помітне достовірне збільшення активності АлАТ до 0,40±0,03 мкмоль/год хмл (Р<0,05) при дії часток нітрату свинцю розміром 400 нм (3 група), порівняно з інтактними тваринами (4 група) (табл. 1).

Таблиця 1

Зміни активності амінотрансфераз у крові (АЛТ) експериментальних тварин, які зазнали впливу наночасток свинцю (мкмоль/годхмл)

Серія експерименту Групи тварин, M±m

pbSnano1 PbSnano2 Pb(NO3) контроль

(1 група) (2 група) (3 група) (4 група)

60 введень 0,76±0,05* 1,06±0,02* 0,94±0,05* 0,29±0,04

60 введень+ПЕП 0,56±0,02* 0,52±0,02* 0,40±0,03* 0,34±0,03

Примітка . р < 0,05 порівняно з контролем.

Активність АсАТ у крові щурів, яким вводили у всіх групах лабораторних тварин: до 0,89±0,03 60-кратно токсичні речовини, достовірно зростає мкмоль/годхмл (р<0,05) при дії наночасток

14/ Том XIX/ 2

141

ПРОФІЛАКТИЧНА МЕДИЦИНА

сульфіду свинцю розміром 10 нм (1 група), до 1,08±0,03 мкмоль/годхмл (р<0,05) при дії нанао-часток сульфіду свинцю розміром 30 нм (2 група) та до 0,80±0,05 мкмоль/год*мл (р<0,05) при дії часток нітрату свинцю розміром 400 нм (3 група), порівняно з інтактними тваринами (4 група) (табл. 2).

При цьому активність АсАТ у крові щурів у постекспозиційний період достовірно зростає

при дії наночасток сульфіду свинцю розміром 10 нм (1 група) та наночасток сульфіду свинцю розміром 30 нм (2 група) до 0,74±0,04 мкмоль/год*мл (р<0,05) та до 0,73±0,03 мкмоль/год^мл (р<0,05) відповідно, а при дії часток нітрату свинцю розміром 400 нм (3група) до 0,58±0,05 мкмоль/год^мл (р<0,05), порівняно з інтактними тваринами (4 група) (табл. 2).

Таблиця 2

Зміни активності амінотрансфераз у крові (ACT) експериментальних тварин, які зазнали впливу наночасток свинцю (мкмоль/годхмл)

Групи тварин, M±m

Серія експерименту PbSnanoi PbSnano2 Pb(NO3) контроль

(1 група) (2 група) (3 група) (4 група)

60 введень 0,89±0,03* 1,08±0,03* 0,80±0,05* 0,26±0,03

60 введень+ПЕП 0,74±0,04* 0,73±0,03* 0,58±0,05* 0,33±0,02

Примітка . р < 0,05 порівняно з контролем.

Для оцінки тяжкості ураження печінки використовували коефіцієнт де Рітіса, який визначається співвідношенням активності ACT до АЛТ. При запальних процесах у печінці спостерігається підвищення активності АЛТ (коефіцієнт де Рітіса < 1), а при некрозі гепатоцитів значно зростає активність ACT (коефіцієнт де Рітіса > 1).

Співвідношення активності ACT до АЛТ у крові щурів, яким 60-кратно вводили токсичні речовини, не має суттєвих відмінностей від контрольних показників (0,94±0,08 у.о.): 1 група -0,97±0,05 у.о. (р>0,05), 2 група - 1,02±0,03 у.о., (р>0,05), 3 група - 1,08±0,06 у.о., (р>0,05) (табл. 3).

Коефіцієнт де Рітіса у лабораторних щурів, яким 60-кратно вводили токсичні речовини з урахуванням постекспозиційного періоду, достовірно збільшується з 1,04±0,10 до 1,34±0,08 (р<0,05) при дії наночасток сульфіду свинцю розміром 10 нм (1 група) та з 1,04±0,10 до 1,42±0,07 (р<0,05) при дії наночасток сульфіду свинцю розміром 30 нм (2 група). Також відзначали достовірне збільшення коефіцієнта де Рітіса з 1,04±0,10 до 1,53±0,17 (р<0,05) при дії часток нітрату свинцю розміром 400 нм (3 група) (табл. 3).

Таблиця 3

Значення коефіцієнта де Рітіса (АСТ/АЛТ) у крові експериментальних тварин (у.о.), які

зазнали впливу наночасток свинцю

Групи тварин, M±m

Серія експерименту PbSnano1 PbSnano2 Pb(NO3) контроль

(1 група) (2 група) (3 група) (4 група)

60 введень 0,97±0,05 1,02±0,03 1,08±0,06 0,94±0,08

60 введень+ПЕП 1,34±0,08* 1,42±0,07* 1,53±0,17* 1,04±0,10

Примітка . р < 0,05 порівняно з контролем.

142

МЕДИЧНІ ПЕРСПЕКТИВИ

Для оцінки дії токсичних агентів потрібне встановлення структурно-функціональних змін, які можуть відбутися в органах-мішенях лабораторних щурів. Здійснити таку оцінку можливо за допомогою гістологічних методів дослідження. У ході цих досліджень встановлено, що при 60-кратному введенні наночасток сульфіду свинцю розміром 10 та 30 нм (1 та 2 групи відповідно) та часток нітрату свинцю розміром 400 нм (3 група) спостерігається десквамація ендотелію капілярів, інтенсивна внутрішньо- і міжчасточкова інфільтрація лімфоцитами та гістіоцитами, деформація печінкових балок, дистрофічні зміни гепатоцитів, сплощення та поліморфізм ядер, значне зменшення кількості гранул, більш виражена вакуолізація.

У щурів, з урахуванням постекспозиційного періоду, після 60- кратного введення наночасток сульфіду свинцю розміром 10 та 30 нм (1 та 2 група відповідно) та часток нітрату свинцю розміром 400 нм (3 група) визначали незначну деформацію печінкових балок, менш інтенсивно виражену внутрішньо- і міжчасточкову інфільтрацію лімфоцитами та гістіоцитами. Дистрофічні зміни гепатоцитів зберігаються: вакуолізація, невелика кількість гранул глікогену, в ядрах поряд з гетерохоматином міститься еухроматин.

Таким чином встановлено, що в постекспо-зиційний період зменшуються деструктивні морфологічні зміни печінки, відбувається також зниження показників активності ферментів АсАТ

та АлАТ у крові, що може свідчити про зменшення токсичного впливу наночасток сульфіду свинцю та іонних розчинів нітрату свинцю на гепатоцити печінки.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що при довготривалій дії наночасток сульфіду свинцю (1 та 2 групи) та іонної форми нітрату свинцю (3 група) відбувається зростання активності аланінаміно-трансферази й аспартатамінотрансферази з однаковою інтенсивністю.

2. У постекспозиційний період відбувається зниження показників активності ферментів АсАТ та АлАТ.

3. У ході морфологічного дослідження внутрішніх органів експериментальних тварин виявлено наявність дистрофічних змін у паренхімі печінки, реактивних змін строми та судинних реакцій, інтенсивність яких більш виражена при 60-кратному введенні досліджуваних речовин (12 тижнів) і менш виражена при 60-кратному введенні цих же речовин з урахуванням постекспозиційного періоду (18 тижнів).

4. Отже, вивчення біохімічних механізмів взаємодії наночастинок сульфіду свинцю з біологічними об’єктами у подальшому не тільки дозволяє з'ясувати їх можливий негативний вплив на біоструктури організму лабораторних тварин, а й сприятиме пошуку ефективних засобів профілактики токсичного ураження свинцем у наноформі.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Антомонов М.Ю. Математическая обработка и анализ медико-биологических данных / М.Ю. Антомонов. - К.: «Фірма Малий Друк», 2006. - С. 381-391.

2. Лазаренко І.А. Порівняння біохімічних показ-

ників крові щурів за отруєння їх свинцем в макро-дисперсній та наноформі // І.А. Лазаренко,

Н.М. Мельникова / Укр. біохім. журнал. - 2012. - Т. 84, № 1. - С. 85-89.

3. Методы клинической лабораторной диагностики / под ред. В.С.Камышникова. - 3-є изд. - М.: МЕД пресс-информ, 2009. - 752 с.

4. Сокуренко Л.М. Морфологические исследования действия лекарственных веществ в токсикологии / Л.М. Сокуренко //Ліки України - 2012. - №5(161). -С. 62-68.

5. Change of the content of fatty acids in brain tissues of animals after influence of nanoparticles of lead sulfide of different size / E.L. Apykhtina, L.M. Soku-renko, Yu.B. Chaikovsky, L.B. Shobat, T.S. Bryuzgina // Science and Education: materials of the II international research and practice conference. - Munich. Germany: Publishing office Vela Verlag Waldkraiburg, 2012. - P. 438-442.

6. Lanone S. Biomedical applications and potential health risks of nanomaterials: molecular mechanisms / S. Lanone, J. Boczkowski // Curr. Mol. Med. - 2006. - Vol. 6, N 6. - P. 651-663.

7. Lewinski N. Cytotoxicity of nanoparticles / N. Lewinski, V. Colvin, R. Drezek // Small. - 2008. - Vol. 4, N 1. - P. 26-49.

REFERENCES

1. Antomonov M. [Mathematical processing and analysis of biomedical data] K.: «Firma Maliy Druk», 2006;381-91. Russian.

2. Lazarenko IA, Mel'nikova NM. [Comparison of blood biochemical parameters in rats in lead intoxication

in macro-disperse and nanoform]. Ukrai'ns'kiy

biokhimichniy zhurnal. 2012;84(1):85-89. Ukrainian.

3. Kamyshnikova VS. [Methods of Clinical Laboratory Diagnostics] 3-e izd., M.: MED press-inform, 2009;752. Russian.

14/ Том XIX/ 2

143

ПРОФІЛАКТИЧНА МЕДИЦИНА

4. Sokurenko LM. [Morphological study of the

effect of drugs in toxicology] Liki Ukrai'ni.

2012;5(161):62-68. Russian.

5. Apykhtina EL, Sokurenko LM, Chaikovsky YuB, Shobat LB, Bryuzgina TS. Change of the content of fatty acids in brain tissues of animals after influence of nanoparticles of lead sulfide of different size. Science and Education: materials of the II international research and

practice conference, Vol. II, Munich, December 18th -19th, 2012 publishing office Vela Verlag Waldkraiburg, Munich, Germany. 2012;438-42.

6. Lanone S, Boczkowski J. Biomedical applications and potential health risks of nanomaterials: molecular mechanisms. Curr. Mol. Med. 2006;6(6):651-63.

7. Lewinski N, Colvin V, Drezek R. Cytotoxicity of nanoparticles. Small. 2008;4(1):26-49.

Стаття надійшла до редакції

10.04.2014

♦

УДК 613:502:633/.636:632.952

О.П. Вавріневич,

С.Т. Омельчук,

B. Г. Бардов,

C. В. Білоус

Інститут гігієни та екології Національного медичного університету імені О. О. Богомольця пр. Перемоги, 34, Київ, 03057, Україна

Institute of hygiene and ecology of Bogomolets National medical university Peremogi av., 34, Kyiv, 03057, Ukraine e-mail: elena-vavrinevich@yandex.ru

Ключові слова: фунгіциди, анілінопіримідини, ґрунт, допустиме добове надходження, овочі, фрукти Key words: fungicides, anilinopyrimidines, soil, acceptable daily intake, vegetables, fruits

Реферат. Гигиеническая оценка безопасности объектов окружающей среды и урожая сельскохозяйственных культур при применении фунгицидов класса анилинопиримидинов. Вавриневич Е.П., Омельчук С.Т., Бардов В.Г., Білоус С.В. В Украине наблюдается тенденция увеличения применения смесевых фунгицидов, содержащих в препаративной форме соединения известных классов и действующие вещества новых классов, к которым относятся соединения анилинопиримидинов. Целью нашей работы была гигиеническая оценка динамики остаточных количеств пестицидов класса анилинопиримидинов в почве, косточковых, семечковых, овощных культурах, винограде и оценка их опасности для населения. Содержание исследуемых веществ в пробах определяли с помощью методов газожидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Натурные исследования показали, что в почвенно-климатических условиях Украины динамика остаточных количеств соединений класса анилинопиримидинов подчиняется экспоненциальной зависимости. Усредненные значения т50 фунгицидов класса анилинопиримидинов в почве составили 10,7±0,8 суток, плодах - 7,9±0,2 суток, зеленой массе растений - 5,7±0,6 суток. За показателем стабильность в почве (ДСанШН 8.8.1.002-98) пириметанил и ципродинил отнесены к III классу опасности, валифенал - IV классу; в сельскохозяйственных растениях исследуемые вещества отнесены к III классу. Сравнительный анализ скорости разложения исследуемых соединений в различных матрицах показал, что в зеленой массе растений процессы разложения происходят достоверно быстрее чем в плодах (р<0,05; t=3,75);

ГІГІЄНІЧНА ОЦІНКА БЕЗПЕЧНОСТІ ОБ’ЄКТІВ ДОВКІЛЛЯ ТА УРОЖАЮ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКИХ КУЛЬТУР ПРИ ЗАСТОСУВАННІ ФУНГІЦИДІВ КЛАСУ АНІЛІНОПІРИМІДИНІВ

144

МЕДИЧНІ ПЕРСПЕКТИВИ