CC BY
50
селекции на повышение генетического потенциала экономически значимых признаков // Научно-методические рекомендации. - С.-Пб - Пушкин. - 2006. - 37 с.
3. Гальперн И.Л. Методы ускоренного повышения генетического потенциала продуктивных признаков промышленных кроссов кур // Достижения науки и техники АПК. - 2009. - №7. - С. 50-54.
BREEDING STRATEGY FOR LINES RAISING AND CREATION OF INDUSTRIAL CROSSES OF EGG AND MEAT CHICKENS (TODAY AND FOR THE FUTURE DEVELOPMENT OF INDUSTRIAL POULTRY)
I.L. Gal’pern, T.I. Pakhomova, V.V. Slepukhin
Summary. The methods of developing new genetic lines and cross for broiler and egg breeders on 1995-2010 are described. The progressive strategies and methods for broiler and egg breeders on 2011-2025 are suggested.
Key words: Breeding, genetic potential of selection sign, genetic variability, heterosis, egg production, meat quality, feed cost.
УДК 576.312.32:575.113
МОНОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОЛИМОРФНЫЕ МАРКЕРЫ ^№), СВЯЗАННЫЕ С ПРИЗНАКОМ ТОЛЩИНА СКОРЛУПЫ ЯЙЦА ДОМАШНЕЙ КУРИЦЫ
О.Ю. БАРКОВА, аспирант
А.Л. САЗАНОВА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
И.Ю. БЛАГОВЕЩЕНСКИЙ, аспирант К.А. ФОМИЧЕВ, научный сотрудник А.А. САЗАНОВ, доктор биологических наук, заведующий лабораторией
ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных
E-mail: alexei [email protected]
Резюме. Приведены результаты экспериментов по ПЦР-амплификации шести фрагментов регуляторной и кодирующей областей экспрессирующейся последовательности ChEST985k21 (идентификационный номер СЯ523443). Секвенирование этих фрагментов у шести особей с различным проявлением признака позволило выявить 6 сайтов мононуклео-тидного полиморфизма (SNP) в пределах последовательности ChEST985k21, из них 5 - в регуляторной области и 1 — в кодирующей. На основе полученных данных создана система маркеров для селекции несушек по аллелям генов, оказывающих влияние на толщину скорлупы яйца.
Ключевые слова: полиморфные маркеры, секве-нирование, толщина скорлупы яйца, домашняя курица
Идентификация генов, оказывающих влияние на проявление хозяйственно важных признаков - одна из основных задач геномики сельскохозяйственных видов. Большинство таких признаков характеризуется широкой вариабельностью экспрессии генов, находящихся в определенных локусах, называемых QTL (quantitative trait loci - локусы количественных признаков) [1].
В 2002 г Туискула-Хаависто и соавторы выявили 14 достоверных QTL, оказывающих значительное влияние на яичную продуктивность и качество яйца, и 6 предположительных QTL, локализованных на хромосомах 2, 3, 4, 5, 8, и Z. Наиболее убедительные результаты получены для GGA4, где выявлены QTL массы тела, массы яйца и эффективности усвоения корма [2]. Близкое по методологии исследова-
ние было проведено и другими авторами [3]. Ранее мы поставили ряд экспериментов по позиционному клонированию района хромосомы 4 домашней курицы, содержащему QTL толщины скорлупы на 53 неделе жизни (ST53) несушки [4]. Методом гибридологического анализа косегрегации микросател-литных ДНК-маркеров и количественных признаков были определены маркеры интервала генетической карты (районов хромосом), контролирующего QTL ST53, а также координаты 20 клонов, имеющих гомологию последовательностей ДНК вставки с мик-росателлитными локусами MCW0170, LEI0081, MCW0114 и ADL0241. Методом флуоресцентной гибридизации ДНК-ДНК in situ (FISH) установлена их локализация на хромосоме 4 [5]. С использованием результатов полного сиквенса мы установили интервал величиной 1,2 млн п.н. - критический для признака ST53. Идентифицировано 20 генов - позиционных кандидатов для признака ST53 [5]. В группе кур породы польская зеленоногая были выявлены достоверные на уровне значимости 0,01 двукратные различия между группами с тонкой и толстой скорлупой по уровню экспрессии последовательности CR523443. Коэффициент корреляции уровня экспрессии этого гена и толщины скорлупы составлял 0,85 [4]. Последовательность CR523443 длиной 2102 пар оснований, представляющая собой клон полностью секвенированной комплементарной ДНК ChEST985k21 домашней курицы, впервые найдена в матричной РНК, экстрагированной из мышц взрослых птиц, и затем обнаружена в мозге, хрящевой ткани и в женских гениталиях (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ UniGene).
В представленной работе мы провели дизайн праймеров и секвенирование кодирующей и регуляторной частей последовательности CR523443 с целью поиска мононуклеотидных полиморфных сайтов, которые влияют на ее экспрессию и на толщину скорлупы яйца.
Условия, материалы и методы. В исследованиях использованы биологические образцы кур породы зеленоногая куропатчая, на которых ранее проводили анализ экспрессии генов-кандидатов признака толщина скорлупы яйца [4]. Дизайн олигонуклеотидов-праймеров для секвенирования __ Достижения науки и техники АПК, №04-2010
осуществляли на основании информации баз данных сети Интернет (www.nlm.ncbi.nih.gov и www.ensembl.org) при помощи компьютерной программы PRIMER_3 (www.genome.wi.mit.edu).
Использованы последовательности 6 пар праймеров для амплификации последовательностей, удовлетворяющих условиям секвенирования:
ST53Seq_1_FW: AGCAAAGGCAAGCTCGTAAG;
ST53Seq_1_RV: TTTTCTGCTTTAGAAGTCCTGCTT;
ST53Seq_2_FW: AGTTGCTGAGTACCTCAAACTACA;
ST53Seq_2_RV: TTCCAAGGTAAAGACAGAAGTCG;
ST53Seq_3_FW: TGTGAAATGTAAGGGGGTTG;
ST53Seq_3_RV: AGCAGAACCTCCAAACTCCA;
ST53Seq_4_FW: CTCAGGATGGTGGAGTTTGG;
ST53Seq_4_RV: TGCGACAGGAATCCAATACA;
ST53Seq_5_FW: TGGATTCCTGTCGCATTAGTC;
ST53Seq_5_RV: GCAAACACCTCGATTGCTCT;
ST53Seq_6_FW: GTGCTGAGTATGGGGTGCTT;
ST53Seq_6_RV: TCAAGGCTTCAACGTCACTC.
Накопительную амплификацию ДНК при помощи ПЦР проводили на амплификаторе IQ5.
Полимеразную реакцию для секвенирования выполняли в соответствии с рекомендациями производителя (Applied Biosistems).
Электрофоретическое разделение полученных фрагментов и анализ их нуклеотидной последовательности осуществляли автоматически при помощи секвенатора 3130 (Applied Biosistems).
В ходе экспериментов по ПЦР-амплификации 6-и фрагментов регуляторной и кодирующей областей гена CR523443 проведено по 6 реакций ПЦР на 6-и биологических образцах в трех технических повторностях. Реакции секвенирования поставлены для 36 образцов амплифицированных фрагментов регуляторной и кодирующей областей гена CR523443.
Результаты и обсуждение. Мы выявили 6 сайтов однонуклеотидного полиморфизма (SNP) в гене CR523443, из них 5 - в регуляторной области и 1 — в кодирующей (см. табл.). На основе полученных данных создана система маркеров для селекции несушек по аллелям генов, которые влияют на толщину скорлупы яйца. Она представляет собой набор олигонуклеотидных праймеров для ПЦР (температура отжига 60°С, полиморфные сайты выделены жирным шрифтом):
Таблица. Сайты мононуклеотидного полиморфизма регуляторной и кодирующих областях экспрессирующейся последовательности
ChEST985k21.
SNP П оследо ватель-ность Расстояние от стартового кодона ChEST985k21 (п.н.)
S2 1 GAT CAGYAGTAAA* -958
S3 1 CATTTTRCT CT CA -190
S3 2 GTTCAGYGTGGTC -288
S3 З TGT AAAYGCAGCA -267
S3 4 CAGAATYGCACAG -236
S6 1 AGTTTT YGGGTGC +1920
*жирным шрифтом выделены полиморфные нуклеотиды.
1. Б2_1_ир_Т: СТОСТСДОТОТСТТДОТСТОДТСДОТ Б2_1_ир_С: СТОСТСДОТОТСТТДОТСТОДТСДОО Б2_1_йп: ДСДОТСДТОДТОДООДДДСДОО
2. Б3_1_11р_0: ОСОДСТСДСТСДСТСДТТТТО Б3_1_ир_Д: ООСОДСТ СДСТ СДСТ СДТТТТ А Б3_1_йп: ДОСДОДДССТССДДДСТССД
3. Б3_2_ир_Т: ТТОСТСТСДТТДДТТДДТОДОТТСДОТ Б3_2_ир_С: ТТОСТСТСДТТДДТТДДТОДОТТСДОО Б3_2_йп: ДОДДООДДОДОДООТДТСДДССДОТ
4. Б3_3_ир_Т: ТООТСДСДООТОССТОТДДДТ Б3_3_ир_С: ТООТСДСДООТОССТОТДДДО Б3_3_йп: СДТССТОДООСДСТОСДТДТТ
5. Б3_4_ир_Т: ДТДОСССДДТССТОСДОДДТТ Б3_4_ир_С: ДТДОСССДДТССТОСДОДДТО Б3_4_йп: ДОСДОДДССТССДДДСТССД
6. Б6_1_ир_Т: ТОДОСТТДТОДДТСТТОСДОТТТТТ Б6_1_ир_С: ТОДОСТТДТОДДТСТТОСДОТТТТО Б6_1_йп: Т СДДСДТТ ОТООДДДОТДОДТДСДОД
Выводы. Определение нуклеотидной последовательности регуляторной и кодирующей частей гена СЯ523443, позволило идентифицировать ОТЫ (однонуклеотидные полиморфизмы, влияющие на количественные признаки), которые мы использовали при создании системы молекулярных маркеров для селекции несушек по аллелям генов, оказывающих воздействие на этот признак. Оптимизация толщины скорлупы яйца имеет большое экономическое значение, поскольку от нее во многом зависят потери птицеводческой продукции при транспортировке.
Литература.
1. Cheng H.H., Levin I., Vallejo R.L., Khatib H., Dodgson J.B., Crittenden L.B., Hillel J. Development of a genetic map of the chicken with markers of high utility. Poult Sci. 1995. V. 74. P. 1855-1874.
2. Tuiskula-Haavisto M., Honkatukia M., Vikki J., De Konig D., Schulman N., Maki-Tanila A. Mapping of quantitative trait loci affecting quality and production traits in eggs layers. Poultry Sci. 2002. V. 81. P. 919 - 927.
3. Wardecka B., Olszewski R., Jaszczak K., Zieba C., Pierzchala M., Wicinska K. Relationship between microsatellite marker alleles on chromosome 1-5 originating from the Rhode Island Red and green-legged Partrigenous breeds and egg production and quality traits in F2 mapping population. J. Appl. Genet. 2002. V. 43. P. 319 - 329.
4. Ю.А. Химанина, А.Л. Сазанова, В.А. Стекольникова, Т. Малевски, К. Ящак, А.А. Сазанов. Анализ экспрессии генов-кандидатов признака толщина скорлупы яйца домашней курицы. Сельскохозяйственная биология. 2008. № 6. С. 40-43.
5. Sazanov A.A., Romanov M.N., Ward^ka B., Sazanova A.L., Korczak M., Stekol’nikova V.A., Kozyreva A.A, Smirnov A.F., Jaszczak K., Dodgson J.B. Chromosomal localization of fifteen large insert BAC clones containing three microsatellites on chicken chromosome 4 (GGA4) which refine its centromere position, Animal Genetics, 2005, V. 36. P. 161-163.
SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHIC (SNP) MARKERS AFFECTING THE EGGSHELL THICKNESS IN CHICKENS
O.Yu. Barkova, A.L.Sazanova, I.Yu. Blagoveschensky, K.A. Fomichev, A.A. Sazanov
Summary. Six primer-pairs satisfying the requirements of sequencing were obtained. PCR-amplification allowed to get per 6 fragments from 6 biological samples in 3 technical repeats. Thirty six DNA-sample were sequenced. Six SNPs were revealed (5 ones - in regulatory region and one - within ORF). Based on these data the system for MAS of layers on shell thickness was developed.
Key words: polymorphic markers, sequencing, eggshell thickness, chicken
Достижения науки и техники АПК, №04-2010
б5
