CC BY
44
Ездакова ИЮ.1, Гончарова И.С.2
'Доктор биологических наук; 2младший научный сотрудник, Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАСТВОРИМЫХ И МЕМБРАННЫХ ФОРМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Аннотация
Полученные гибридомы являются стабильным продуцентом моноклональных антител к иммуноглобулинам крупного рогатого скота, которые могут быть получены в неограниченных количествах и с минимальными затратами. На основе полученных МкА к IgM и IgA рогатого скота приготовлены реагенты для количественного определения концентрации иммуноглобулинов классов Ми А в РИД, ИФА и иммуноцитохимическом анализе. Данные реагенты можно использовать для анализа гуморального звена иммунитета крупного рогатого скота и овец.
Ключевые слова: моноклональные антитела, иммуноглобулины, крупный рогатый скот, иммунологические методы.
Ezdakova LYu.1, Goncharova I.S.2
1 Dr.Sci.; Junior Researcher; All-Russian Ya.R.Kovalenko Research Institute of Experimental Veterinary Medicine MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CERTAIN SOLUBLE AND MEMBRANE FORM OF IMMUNOGLOBULINS CATTLE
Abstract
The resulting hybridomas are stable producer of monoclonal antibodies to bovine immunoglobulin, which can be obtained in unlimited quantities and with minimal costs. On the basis of Mab for IgM and IgA cattle prepared reagents for the quantitative determination of immunoglobulins M and A in the single radial immunodiffusion, ELISA and immunocytochemistry . These reagents can be used for analysis of humoral immunity in cattle and sheep.
Keywords: monoclonal antibodies, immunoglobulins, cattle, immunological methods.
Моноклональные антитела (МкА) обладают уникальными свойствами - моноспецифичностью и идентичностью, поэтому являются идеальным диагностическим препаратом. Моноклональные антитела используют в качестве иммунодиагностических реагентов, используемых для обнаружения антигена в тканях или в биологических жидкостях организма, в области молекулярного анализа антигенных эпитопов к моноклональным антиидиотопам антител, для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней (гуманизированные МкА).
Гибридомная технология открыла большие возможности для интенсивной разработки ряда актуальных направлений в ветеринарной медицине. Моноклональные иммуноглобулины используются для изучения проблем эндокринологии и биохимии, клеточной биологии и физиологии, вирусологии и микробиологии. Преимущества МкА заключаются, прежде всего, в их гомогенности и возможности стандартизации препаратов.
Wands J.R. et al. (1981) описали несколько критериев для отбора моноклональных антител для диагностики:
-антитела должны быть достаточно аффинны к антигену, чтобы допускать эффективную комбинацию с низкими концентрациями антигена;
- антитела должны быть направлены против повторяющихся эпитопов, которые легко доступны;
-различные изотипы иммуноглобулинов могут увеличивать чувствительность теста. Например, IgM может быть более эффективен, чем IgG. Также в дополнение к перечисленным критериям, антитела должны быть стабильными, должны допускать процедуры с конъюгированием без потери антигенсвязывающей способности.
Использование моноклональных антител сделало возможным изучение механизмов формирования иммунного ответа, в том числе функциональной активности иммуноглобулинов различных видов животных. С помощью МкА к CD-антигенам клеточной поверхности изучают фенотип и оценивают количество различных популяций иммунокомпетентных клеток у животных.
Индикация уровня иммуноглобулинов (Ig) в сыворотке крови и секреторных жидкостях организма животных является одним из основных тестов для диагностики острых инфекций, первичных и вторичных иммунодефицитов, оценки эффективности применения вакцин и иммуномодуляторов, воздействия различных факторов среды и оценки иммунного статуса. Для этого необходимы специфичные к Ig антисыворотки. Поликлональные антисыворотки к Ig имеют такие недостатки, как гетерогенность и низкая активность, зависимая от животных-продуцентов антител. Поэтому использование в иммунохимических тест-системах моноклональных антител строго определенной специфичности значительно повышает диагностическую ценность методов.
В результате проведенной работы по гибридизации клеток лимфоцитов иммунных мышей BALB/c с клетками миеломы Sp 2/0 получены гибридомы-продуценты МкА к иммуноглобулинам классов M [1] и A [2] крупного рогатого скота. В процессе экспериментов получено и протестировано более 10000 первичных гибридных клеточных клонов. Получен набор асцитных препаратов, с помощью иммуноблоттинга и различных серологических тестов определена иммунохимическая характеристика МкА. Проведены исследования и показана возможность использования полученных МкА для количественного определения иммуноглобулинов (Ig) и В-клеток в биологических жидкостях организма животных методами радиальной иммунодиффузии (РИД) и иммуноцитохимии.
Проведен корреляционный анализ результатов количественного определения иммуноглобулинов класса А, полученных методами РИД (поликлональная антисыворотка) и «сэндвич»-ИФА (моноклональные антитела). Обнаруженное нами несоответствие в результатах, полученных двумя методами, мы полагаем, связано с тем, что, полученные нами моноклональные антитела к эпитопам на секреторной молекуле IgA, частично не соответствуют эпитопам на IgA-мономерах.
Также проведены исследования по определению перекрестной видоспецифичности полученных МкА с целью создания универсальных диагностических тест-систем для идентификации иммуноглобулинов различных видов животных.
По результатам иммуноблоттинга, МкА клонов С2, С4 и G9 реагируют только с нативной молекулой IgM, что свидетельствует о конформационном характере антигенных детерминант на молекуле IgM, распознаваемыми полученными антителами. Моноклональные антитела клонов Сп и В3 взаимодействуют не только с нативной молекулой, но и с ц- цепью IgM, что свидетельствует о линейном характере эпитопов, которые распознают МкА [3]. В результате проведенных исследований были отобраны клоны С2 и G9, продуцирующие антитела, которые взаимодействуют с нативной молекулой IgM и сохраняют титр в реакции диффузионной преципитации (1:32) после лиофилизации.
Использование моноклональных антител в РИД предполагает наличие преципитирующих свойств Ig. МкА к IgM клонов С2 и G9 обладали такими свойствами, а вот МкА к IgA только при сочетании нескольких клонов. Проведена серия экспериментов и созданы олигоклональные реагенты (смесь двух и более моноклональных антител) для выявления подклассов ^А в различных биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец в РИД и ИФА. В результате проведенных экспериментов было установлено, что наиболее эффективно использовать полученные МкА к IgA в иммуноферментном анализе. Иммуноглобулины класса А у крупного рогатого скота и овец присутствуют в сыворотке крови и молоке в низких концентрациях, по сравнению с IgG и IgM. Для определения небольших количеств Ig метод преципитации в геле (РИД) недостаточно чувствителен, так как наименьшая концентрация Ig, которая может быть достоверно определена в РИД составляет 0,2-0,1 мг/мл.
Для определения минимальных концентраций IgA в биологических жидкостях крупного рогатого скота оптимизированы условия постановки "сэндвич"-ИФА с использованием МкА. Испытаны сочетания пар МкА, где одни из них использовали в качестве иммобилизирующих антител, а другие, меченные пероксидазой, для детекции связанного антигена. Установлено, что
99
чувствительность и специфичность "сэндвич"- ИФА по отношению к антигенам различного происхождения зависит от сочетания пар МкА. В результате проведенных экспериментов подобран вариант, позволяющий идентифицировать и количественно определять уровень как мономерного сывороточного IgA, так и sIgA в различных секретах (слезы, слюна, молозиво, молоко, носовые секреты крупного рогатого скота).
На основе полученных МкА к IgM и IgA рогатого скота приготовлены реагенты для количественного определения уровня иммуноглобулинов классов М и А в РИД и ИФА. Данные реагенты можно использовать для анализа гуморального звена иммунитета крупного рогатого скота и овец [4].
Практически первыми из открытых на мембране лимфоцита молекул были иммуноглобулины. Поверхностные иммуноглобулины (S-Ig) ориентированы своей Fab-областью по направлению к внешней среде, тогда как Fc-фрагмент погружен в липидный бислой мембраны клетки. S-Ig на В-клетках являются рецептором для антигена и идентичны его секретируемой форме - антителу. Модуляция их количества или блокировка антителами приводит к изменению иммунных реакций организма. Помимо мембраносвязанной формы иммуноглобулинов В-клеток существует также и цитоплазматическая, которая является показателем уровня дифференцировки лимфоцитов. Экспрессия цитоплазматического ^М на поверхность клетки играет важную роль в В-клеточном онтогенезе, поскольку s-^М вместе с другими молекулами (цепи Iga и IgP) образуют рецепторный комплекс зрелой В-клетки. Поверхностный репертуар иммуноглобулинов меняется в процессе созревания, дифференцировки и иммуногенеза за счет транспорта этих молекул из клетки и обратно.
Одним из способов исследования функционального состояния В-лимфоцитов является метод определения поверхностных иммуноглобулинов. Их уровень оценивают с помощью различных методов световой и электронной микроскопии, в которых используются антитела против иммуноглобулинов, меченные флуорохромомами, радиоактивными изотопами и ферментами.
В наших исследованиях количество В-клеток в крови телят в возрасте 1 месяца определяли по наличию на мембране клетки иммуноглобулинов класса М методом иммунопероксидазного окрашивания клеток с использованием в качестве первых антител -моноклональных антител к IgM крупного рогатого скота, а вторых - антител к Ig мыши, конъюгированных с пероксидазой. Определяли s-IgM по появлению специфического окрашивания лимфоцитов под микроскопом (х900). Клетки, окрашенные по периферии, считали IgM^-лимфоцитами или В-клетками. При микроскопическом исследовании препаратов установлено, что клетки крови телят, экспрессирующие мембрасвязанный IgM (sIgM^-клетки), составляют - 19,2%±0,8. Также в крови были обнаружены клетки с цитоплазматическим IgM (dgM). Эти клетки не окрашиваются по периметру клетки, т.е. поверхностные иммуноглобулины отсутствуют. dgM-клетки могут быть пре-В-клетками с цитоплазматическими p-цепями или плазматическими клетками.
Таким образом, с помощью моноклональных антител определены показатели концентрации иммуноглобулинов класса М и А в биологических жидкостях организма и количество В-клеток в крови крупного рогатого скота, что имеет важное прогностическое значение при вакцинации, так как у животных с низкими данными параметрами возможна недостаточная эффективность специфической профилактики.
Литература
1. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к ^М рогатого скота / Федоров Ю.Н., Сологуб В.К., Феоктистова Т.А. и др. // Авторское свидетельство №1560549 от 3.01.1990 г.
2. Моноклональные антитела к иммуноглобулинам класса А рогатого скота: получение, характеристика, применение / Т.А.Феоктистова, Ю.Н.Федоров, И.Ю.Ездакова, В.К.Сологуб// Труды ВИЭВ.-2003.- Т. 73.- С. 197-200.
3. Ездакова И.Ю. Получение и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулину класса М рогатого скота: Дис.... канд.биол.наук/ И.Ю.Ездакова; ВИЭВ.- Москва, 1994.-134с.
4. Ездакова И.Ю., Чеботарева Т.А. Методические наставления по использованию моноклональных антител для оценки уровня иммуноглобулинов классов М и А в биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец //Совр. средства и методы обеспечения ветеринарного благополучия по инфекционной и протозойной патологии животных.-М:ООО»Агенство творческих технологий» .-20П.-СЛ01-107.
5. Ройт А, Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.Мир, 2000, 592с.
Кузьминова Е.В.,1 Семененко М.П.2
'Доктор ветеринарных наук, Краснодарский научно-исследовательский ветеринарный институт, 2 доктор ветеринарных наук, Краснодарский научно-исследовательский ветеринарный институт ПРИМЕНЕНИЕ ЛИКОПИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АКУШЕРСКО-ГИНЕКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У
КОРОВ
Аннотация
Разработан препарат на основе каротиноида ликопина, дана краткая характеристика его изучения на коровах в предотельный период. Экспериментально доказано, что фармакологическая активность ликоцинола проявляется улучшением обменных процессов организма животных, а также он является эффективным средством профилактики акушерскогинекологических заболеваний у крупного рогатого скота.
Ключевые слова: ликопин, коровы, акушерская патология
Kuzminova E.V.1, .Semenenko M.P.2
'D.Sc. (veterinary), Krasnodar research veterinary institute of the Russian academy of agricultural scienes ;2 D.Sc. (veterinary), Krasnodar research veterinary institute of the Russian academy of agricultural scienes APPLICATION OF LYKOPIN FOR PREVENTING OBSTETRICAL AND GYNECOLOGICAL DISEASES OF COWS
Abstract
Preparation was developed on the basis of the carotenoid lycopin, brief characteristics of its study was presented on cows before birth. Experimentally was proved that the pharmacological activity of likotsinol improved metabolic processes of animals, and it is an effective means ofpreventing obstetric and gynecological diseases of cattle.
Keywords: lycopin, cows, obstetrical pathology
В обеспечении устойчивого роста продукции животноводства, важное значение придается вопросам профилактики бесплодия и улучшения воспроизводства крупного рогатого скота, что обуславливает необходимость внедрения новых средств предупреждения и лечения акушерско-гинеколо-гических заболеваний у животных, в том числе, с применением препаратов, обладающих разносторонней биологической активностью и безвредностью для организма [2].
Перспективным в этом плане является растительный пигмент каротиноидного ряда - ликопин. Каротиноиды представляют собой многочисленную группу пигментов, входящих в состав клеток микроорганизмов, высших растений, животных и человека, кроме этого, существуют каротиноиды антропогенного происхождения - искусственно синтезированные человеком [1].
Ликопин относится классу терпеноидов, структура которого представлена длинными ветвящимися углеводородными цепями, содержащими 11 сопряженных двойных связей. То есть, фактически ликопин является алифатическим изомером каротина с эмпирической формулой С40Н56, но содержит вместо бета-ионовых два псевдоионовых кольца.
100
