CC BY
1Столыпинский вестник №9/2024
Столыпинский вестник
Научная статья Original article УДК 579.62
МОНИТОРИНГ ТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ СТАФИЛОКОККОВ И ИХ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В КОСТАНАЙСКОЙ ОБЛАСТИ
MONITORING OF TOXIGENIC STAPHYLOCOCCUS STRAINS AND THEIR ANTIBIOTIC RESISTANCE IN ANIMAL-DERIVED PRODUCTS IN THE
KOSTANAY REGION
Чужебаева Гульжан Джамбуловна, кандидат ветеринарных наук, ассоциированный профессор, заведующая испытательным центром НИИПБ НАО «Костанайский региональный университет имени Ахмет Байт^рсыщлы» г. Костанай.E-mail: [email protected]
Киселев Артем Петрович, обучающийся магистратуры по ОП 7М09102 -Ветеринарная санитария, НАО «Костанайский региональный университет имени Ахмет Байт^рсын^лы» г. Костанай, E-mail: artj om-udovenko2011 @mail. ru Байменов Бахит Муратович, магистр ветеринарных наук, научный сотрудник НИИПБ НАО «Костанайский региональный университет имени Ахмет Байт^рсын^лы» г. Костанай, E-mail: bahytbaj menov@gmail. com
Ошакбаева Назым Мырзагалиевна, доктор PhD, старший преподаватель кафедры ветеринарной санитарии, «Костанайский региональный университет имени Ахмет Байт^рсын^лы» г. Костанай, E-mail: nazym_07@inbox. ru
Киселев Иван Петрович, магистр ветеринарных наук, заведующий сектором ветеринарии, животноводства и переработки сельскохозяйственной
продукции КГУ «Отдел сельского хозяйства и ветеринарии акимата района им. Габита Мусрепова Северо-Казахстанской области» с. Новоишимское, E-mail: [email protected]
Chuzhebaeva Gulzhan Dzhambulovna, Candidate of Veterinary Sciences, Associate Professor, Head of the Testing Center at the Research Institute for Biological Safety of the Non-Profit Joint Stock Company "Kostanay Regional University named after Akhmet Baitursynuly," Kostanay.
Kiselev Artyom Petrovich, a graduate student in OP 7M09102 - Veterinary sanitation, NAO «Kostanay Regional University named after Akhmet Baitursynuly», Kostanay.
Baymenov Bakhit Muratovich, Master of Veterinary Sciences, Researcher at the Research Institute for Biological Safety of the Non-Profit Joint Stock Company "Kostanay Regional University named after Akhmet Baitursynuly," Kostanay.
Oshakbayeva Nazym Myrzagalievna, PhD, Senior Lecturer at the Department of Veterinary Sanitation, Kostanay Regional University named after Akhmet Baitursynuly, Kostanay.
Kiselev Ivan Petrovich, Master of Veterinary Sciences, Head of the Veterinary, Animal Husbandry, and Agricultural Product Processing Sector at the State Communal Enterprise "Department of Agriculture and Veterinary Medicine of the Akimat of Gabit Musrepov District, North Kazakhstan Region," Novoishimskoe village.
Аннотация
Целью работы является мониторинг токсигенных штаммов S. aureus в продуктах животного происхождения в Костанайской области, идентификация энтеротоксинов методом ИФА, изучение резистентности к АБП выявленных штаммов.
В результате исследований пищевых продуктов животного происхождения было установлено наличие штаммов S. aureus, способных продуцировать
энтеротоксины, различных типов (группа А, В, С, D, E). Наибольшее количество выявленных токсинов относится к типам А (63,6%) и Д (40,9%). Меньше всего S. aureus продуцировали токсин типа В (18,1%) также выявлен один штамм, продуцирующий пять видов энтеротоксинов.
Изучение резистентности в АБП показало, что наибольшее количество изолятов S. aureus проявили высокую чувствительность к в - лактамным антибиотикам - до 78,1%, сульфаниламидам до 68,0%, макролидам до 52,0%.
Annotation
The aim of the work is to monitor toxigenic strains of S. aureus in animal products in the Kostanay region, identify enterotoxins using ELISA, and study the resistance of the identified strains to ABP.
As a result of studies of animal products, the presence of S. aureus strains capable of producing enterotoxins of various types (group A, B, C, D, E) was established. The largest number of toxins identified belong to types A (63.6%) and D (40.9%). The least amount of S. aureus produced type B toxin (18.1%); one strain producing five types of enterotoxins was also identified. The study of resistance in ABP showed that the greatest number of S. aureus isolates showed high sensitivity to в-lactam antibiotics - up to 78.1%, sulfonamides up to 68.0%, macrolides up to 52.0%. Ключевые слова: Мясные продукты, токсигенные штаммы, продукты животного происхождения.
Key words: Meat products, toxigenic strains, animal products. Введение
Токсины, продуцируемые стафилококками, занимают одно из ведущих мест в этиологии пищевых отравлений. Известно, что стафилококки продуцируют 25 иммунологически различных типов энтеротоксинов (SE) от А до Х. Наибольшее значение в практике имеют SE типов SEA, SEB, SEC, SED, SEE, а также токсин токсического шока (TSST-1), которые являются причиной 95% пищевых отравлений стафилококковой этиологии.
Изучая распространение энтеротоксигенных стафилококков в молоке коров, ученые установили, что в 55% случаев они выделяются от больных клиническим маститом животных, в 33,3% случаев - при субклиническом мастите и в 12% случаев - от здоровых животных. [4].
Мясные продукты и полуфабрикаты из мяса также хорошо накапливают стафилококковые токсины, например, в сыром мясном фарше накапливаются за 14-16 часов, в различных паштетах - за 10 - 12 часов, в готовых мясных блюдах за 3 часа. [5].
Классические стафилококковые энтеротоксины являются критическими факторами вирулентности при многих тяжелых состояниях организма [6], что усиливается ещё проблемой резистентности штаммов S. aureus к антибактериальным препаратам.
Примерами микроорганизмов, которые во всем мире представляют особую проблему с точки зрения роста резистентности к АБП, являются представители группы ESKAPE, в число которых входит S. aureus [7]. В Республике Казахстан проблема антимикробной резистентности также стоит достаточно остро. Несмотря на некоторое снижение потребления антибактериальных препаратов в последние годы, в Казахстане по-прежнему сохраняется нерациональное использование антибиотиков [8].
Материалы и методы
Для выявления токсигенных штаммов S. aureus нами было отобрано 397 проб различных продуктов животного происхождения: молоко сырое с местных ферм и фермерских рынков, несколько наименований мороженного местного производителя; мясные продукты, реализуемые в торговых точках города и рынках: фарш, мясные полуфабрикаты (пельмени, котлеты) холодец, колбасы местных производителей.
С целью обнаружения S. aureus производили посевы взятых образцов продуктов. Пробы жидких продуктов первоначально высевали в МПБ. Для накопления микроорганизмов в бульоне помещали в термостат на 24 часа при
температуре 370С. На следующий день пересевали пробы на маннит-солевой агар. Инкубация происходила 24 часа при температуре 370С.
Пробы твердых продуктов первоначально сеяли на МПА, инкубация также происходила 24 часа при температуре 370С. На следующий день колонии пересевались с МПА на манит-солевой агар (рисунки 1,2)
Рис. 1-2. Посев образцов на МПА и пересев колоний на манит-солевой агар
Для идентификации S. aureus проводили тесты на каталазу и плазмокоагулазу (рис. 3-4). Учет результатов проводили через 1, 2 и 4 часа. Пробирки держали в термостате при температуре 370С (рисунки 3,4).
Рис. 3-4. Проведение проб на каталазу и плазмокоагулазу
В результате проведенных тестов, удалось выделить и идентифицировать 32 штаммов S. aureus.
Для накопления энтеротоксинов S. aureus с целью их выявления методом ИФА использовали специализированную среду BHI Broth (бульон с сердечно-мозговой вытяжкой) производства компании Himedia (Индия).
Для выявления энтеротоксинов продуцируемых S. aureus использовали специализированный набор для ИФА «Ridascreen Set A, B, C, D, E» производства «R-Biopharm AG» (Германия). Набор представляет собой иммуноферментный сэндвич-анализ для выявления энтеротоксинов стафилококка A, B, C, D и E в жидких и органических пищевых продуктах, а также в бактериальных культурах. Предполагается, что для интоксикации необходима популяция 5 x 105 клеток штаммов S. aureus, продуцирующих энтеротоксин, на грамм пищи. Однако другие исследования показывают, что всего 100-200 нг энтеротоксинов стафилококка могут вызвать симптомы пищевого отравления [9].
ИФА проводили согласно инструкции производителя к набору.
Исследования по изучению антибиотикорезистентности проводили диско-диффузным методом на среде Мюллера-Хинтона (MHA, Merck, Germany). Интерпретацию осуществляли в соответствии с рекомендациями EUCAST, версия 9.0, МУК 4.2.1890—04 МУ. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам [10].
Диски с антибиотиками для S. aureus: ампициллин (10 мкг), амоксициллин (25 мкг), бензилпенициллин (10 ЕД), стрептомицин (10 мкг), цефоперазон (75 мкг), цефокситин (30 мкг), канамицин (30 мкг), неомицин (30 мкг), гентамицин (120 мкг), тетрациклин (30 мкг), доксициклин (30 мкг), ципрофлоксацин (5 мкг), норфлоксацин (10 мкг), эритромицин (15 мкг), тилозин (15 мкг) сульфаметокзол с триметопримом (1,25/23,75).
Результаты и обсуждение
В результате проведенных исследований выделено, идентифицировано и исследовано методом ИФА 32 штамма S. aureus (таблица 1).
Штаммы S. aureus A B C D E Штаммы S. aureus A B C D E
1 - - + - + 17 - - + - -
2 + - - + - 18 - - - - -
3 + - - - + 19 + - - - -
4 - - - - - 20 - - + - -
5 + - - + - 21 - - - - -
6 - - - - + 22 - + - - -
7 + - - - - 23 + + - + -
8 - - + + - 24 - - - - -
9 - - - - + 25 + + + + +
10 + - + - - 26 - - - - -
11 - - - - - 27 - - - - -
12 + - - - - 28 + - - + +
13 - - - + + 29 - - - - -
14 - - - - - 30 + - - + -
15 - - + - - 31 + - + - -
16 + - - - - 32 + + - + -
Таблица 1 - Результаты исследований штаммов S. aureus методом ИФА
Из 32 исследованных штаммов 10 (31,2%) штаммов S. aureus не продуцировали токсины. 22 (68,7%) штамма оказались продуцентами токсинов разных типов: 9 штаммов продуцировали 1 тип различных токсинов, 8 штаммов - токсины 2 разных типов, 4 штамма - токсины 3 типов.
Выделен один штамм S. aureus, в культуральном фильтрате которого обнаружены одновременно энтеротоксины всех 5 типов.
Наибольшее количество выявленных токсинов относится к типам А и Д. Токсин типа А был обнаружен в 14 пробах (63,6%), типа Д в 9 пробах (40,9%). Меньше всего S. aureus продуцировали токсин типа В - 4 штамма (18,1%) что, возможно, объясняется отсутствием благоприятных условий для выживания и размножения энтеротоксигенных стафилококков, синтезирующих токсин типа B в данных продуктах.
Наши данные согласуются с данными Pérez-Boto, D. с соавторами (2023), которые утверждают, что SEA является энтеротоксином, наиболее часто встречающимся в случаях пищевых отравлений, чем SEB, SEC и SED [11].
По результатам тестирования на антибиотикорезистентность 25 (78,1%) штаммов S. aureus из 32 были устойчивы как минимум к двум антибактериальным препаратам. Из 25 резистентных изолятов, резистентность к АБП группы в - лактамов проявили 25, группы макролидов - 13, группы сульфаниламидов - 17, тетрациклинов-11, аминогликозидов - 24 и фторхинолонов- 5 изолятов S. aureus (таблица 2).
Группа АБП Наименование Кол-во % Кол-во %
к АБП резистентных от общего резистентных от общего
m штаммов кол-ва изолятов в группе АБП кол-ва изолятов
ампициллин 19 76,0%
амоксициллин 7 28,0%
Р-лактамы бензилпенициллин 8 32,0% 25 78,1
цефоперазон 18 72,0%
цефокситин 23 92,0%
стрептомицин 6 75%
(N m Амино- канамицин 2 25,0% 8 32,0
1 1 й гликозиды неомицин 1 12,5%
и гентамицин 3 37,5%
<и !-н тетрациклины тетрациклин 9 81,8% 11 44,0
й GO доксициклин 4 36,3%
макролиды эритромицин 5 38,4% 13 52,0
тилозин 7 53,8%
сульфаниламиды сульфаметоксазол /триметоприм 13 76,4% 17 68,0
фторхинолоны ципрофлоксацин 3 60,0% 5 20,0
норфлоксацин 3 60,0%
Таблица 2 - Антибиотикограмма штаммов S.aureus
Наибольшее количество изолятов S. aureus проявили высокую чувствительность к в - лактамным антибиотикам - до 78,1%, сульфаниламидам до 68,0%, макролидам до 52,0%.
Наименьшее количество резистентных штаммов выявлено к группе аминогликозидов - 8% и фторхинолонов -5%.
Также из 25 изолятов S. aureus с установленной резистентностью 7 (28,0%) изолятов проявили резистентность к одному антибактериальному препарату, 4 (16,0%) изолята к двум, 5 (20,0%) изолятов были резистентны к трем АБП; 6 (24,0%) изолята к четырем, 3 (12,0%) изолята к пяти АБП. Выводы
Присутствие энтеротоксигенных штаммов S. aureus в продуктах животного происхождения является потенциальным фактором риска для безопасности пищевых продуктов. Изученные штаммы обладают высокой степенью резистентности к АБП, что повышает опасность энтеротоксигенных штаммов S. aureus для здоровья людей, сельскохозяйственных животных и требует постоянного мониторинга со стороны специалистов.
Список литературы
1. Флуер Ф.С., Логинова О.Г., Панова Я.А., Азанова А.А., Мамычева Е.В. Частота встречаемости энтеротоксигенных штаммов Staphylococcus aureus, продуцирующих энтеротоксины типов SEC и SEI, выделенных при нарушении кишечной микрофлоры у детей. // Педиатрия. - 2019. - Т. 98, № 6. - С. 60-64.
2. Langley R.J., Tian Y., Clow F., Young P.G., Radcliff F.J., Choi M., Sequeira R.P., Holtfreter S., Baker H., Fraser J.D. Staphylococcal enterotoxin-like X (SElX) is a unique superantigen with functional features of two major families of staphylococcal virulence factors. // PLoS Pathog. - 2017. - Vol. 13. - Article e1006549.
3. Newbould M.J., Malam J., McIluray J.M., Morris J.A., Telford D.R., Barson A.J. Immunological localization of staphylococcal toxic syndrome (TSST-1) antigen in sudden infant death syndrome. // J. Clin. Pathol. - 1989. - Vol. 42. -P. 935-939.
4. Сотникова В.М., Шурдуба Н.А. Методы обнаружения энтеротоксинов золотистых стафилакокков, выделенных из молока больных маститом коров. // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. -Москва, 2014. - № 2(12). - С. 100-108.
5. National Center for Biotechnology Information. Электронный ресурс. -Режим доступа: http://ncbi.nlm.nih.gov/ (дата обращения: [05.05.2024].
6. Флуер Ф.С., Панова Я.А., Азанова А.А., Мамычева Е.В. Обнаружение энтеротоксигенных штаммов Staphylococcus aureus, продуцирующих SEС и SEI, выделенных у больных с пневмонией, сепсисом и ожогами. // Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. - 2019. - № 6. - С. 7278. - DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-6-72-78.
7. Venkateswaran P., Vasudevan S., David H., Shaktivel A., Shanmugam K., Neelakantan P., Solomon A.P. Revisiting ESKAPE Pathogens: virulence, resistance, and combating strategies focusing on quorum sensing. // Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. - 29 June 2023. - Sec. Biofilms. - Vol. 13. - Article 1159798. - DOI: https://doi.org/10.3389/fcimb.2023.1159798.
8. Langley R.J., Tian Y., Clow F., Young P.G., Radcliff F.J., Choi M., Sequeira R.P., Holtfreter S., Baker H., Fraser J.D. Staphylococcal enterotoxin-like X (SElX) is unique superantigen with functional features of two major families of staphylococcal virulence factors. // PLoS Pathog. - 2017. - Vol. 13. - Article e1006549.
9. Zhussupova G., et al. Evaluation of Antibiotic Use in Kazakhstan for the Period 2017-2019 Based on WHO Access, Watch and Reserve Classification (AWaRe 2019). // Antibiotics (Basel). - 2021. - Jan 8. - Vol. 10, № 1. - Article 58. -DOI: 10.3390/antibiotics 10010058. - PMID: 33430122; PMCID: PMC7826608.
10. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 9.0, 2019. - Режим доступа: https://iacmac.ru/ru/info/eucast.shtml (дата обращения: 07.05.2024).
11. Pérez-Boto D., D'Arrigo M., García-Lafuente A., Bravo D., Pérez-Baltar A., Gaya P., Medina M., Arqués J.L. Staphylococcus aureus in the Processing Environment of Cured Meat Products. // Foods. - 2023. - Vol. 12. - Article 2161. - DOI: https://doi.org/10.3390/foods12112161.
Literature
1. Fluer F.S., Loginova O.G., Panova Y.A., Azanova A.A., Mamycheva E.V.
Frequency of Enterotoxigenic Staphylococcus aureus Strains Producing Enterotoxins of Types SEC and SEI Isolated from Disruptions of Intestinal Microflora in Children. // Pediatrics. - 2019. - Vol. 98, No. 6. - Pp. 60-64.
2. Langley R.J., Tian Y., Clow F., Young P.G., Radcliff F.J., Choi M., Sequeira R.P., Holtfreter S., Baker H., Fraser J.D. Staphylococcal enterotoxin-like X (SElX) is a unique superantigen with functional features of two major families of staphylococcal virulence factors. // PLoS Pathog. - 2017. - Vol. 13. - Article e1006549.
3. Newbould M.J., Malam J., McIluray J.M., Morris J.A., Telford D.R., Barson A.J. Immunological localization of staphylococcal toxic syndrome (TSST-1) antigen in sudden infant death syndrome. // J. Clin. Pathol. - 1989. - Vol. 42. -P. 935-939.
4. Sotnikova V.M., Shchurduba N.A. Methods for Detecting Enterotoxins of Staphylococcus aureus Isolated from Milk of Cows with Mastitis. // Problems of Veterinary Sanitation, Hygiene, and Ecology. - Moscow, 2014. - No. 2(12). -Pp. 100-108.
5. National Center for Biotechnology Information. Electronic Resource. -Available at: http://ncbi.nlm.nih.gov/ (accessed: May 5, 2024).
6. Fluer F.S., Panova Y.A., Azanova A.A., Mamycheva E.V. Detection of Enterotoxigenic Staphylococcus aureus Strains Producing SEC and SEI Isolated from Patients with Pneumonia, Sepsis, and Burns. // Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. - 2019. - No. 6. - Pp. 72-78. - DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-6-72-78.
7. Venkateswaran P., Vasudevan S., David H., Shaktivel A., Shanmugam K., Neelakantan P., Solomon A.P. Revisiting ESKAPE Pathogens: virulence, resistance, and combating strategies focusing on quorum sensing. // Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. - 29 June 2023. - Sec. Biofilms. - Vol. 13. - Article 1159798. - DOI: https://doi.org/10.3389/fcimb.2023.1159798.
8. Langley R.J., Tian Y., Clow F., Young P.G., Radcliff F.J., Choi M., Sequeira R.P., Holtfreter S., Baker H., Fraser J.D. Staphylococcal enterotoxin-like X (SElX) is unique superantigen with functional features of two major families of staphylococcal virulence factors. // PLoS Pathog. - 2017. - Vol. 13. - Article e1006549.
9. Zhussupova G., et al. Evaluation of Antibiotic Use in Kazakhstan for the Period 2017-2019 Based on WHO Access, Watch and Reserve Classification (AWaRe 2019). // Antibiotics (Basel). - 2021. - Jan 8. - Vol. 10, № 1. - Article 58. -DOI: 10.3390/antibiotics 10010058. - PMID: 33430122; PMCID: PMC7826608.
10. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint Tables for Interpretation of MICs and Zone Diameters. Version 9.0, 2019. - Available at: https://iacmac.ru/ru/info/eucast.shtml (accessed: May 7, 2024).
11. Pérez-Boto D., D'Arrigo M., Garcia-Lafuente A., Bravo D., Pérez-Baltar A., Gaya P., Medina M., Arqués J.L. Staphylococcus aureus in the Processing Environment of Cured Meat Products. // Foods. - 2023. - Vol. 12. - Article 2161. - DOI: https://doi.org/10.3390/foods12112161.
© Чужебаева Г.Д., Киселев А.П., Байменов Б.М., Ошакбаева Н.М., Киселев И.П., 2024 Научный сетевой журнал «Столыпинский вестник»
Для цитирования: Чужебаева Г.Д., Киселев А.П., Байменов Б.М., Ошакбаева Н.М., Киселев И.П. Мониторинг токсигенных штаммов стафилококков и их антибиотикорезистентности в продуктах животного происхождения в Костанайской области //Научный сетевой журнал «Столыпинский вестник» №9/2024.
