CC BY
52
УДК 550.72
DOI: 10.24411/1728-323X-2019-18027
МОНИТОРИНГ МИКОБИОТЫ КАМЕННЫХ ПАМЯТНИКОВ МУЗЕЙНЫХ НЕКРОПОЛЕЙ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА
С. Ю. Бобир, аспирант Российского государственного педагогического университета им. А. И. Герцена, sv_bobir@mail.ru, Санкт-Петербург, Россия, М. С. Зеленская, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник кафедры ботаники Санкт-Петербургского государственного университета, marsz@yandex.ru, Санкт-Петербург, Россия, Д. Ю. Власов, доктор биологических наук, профессор кафедры ботаники Санкт-Петербургского государственного университета, dmitry.vlasov@mail.ru, Санкт-Петербург, Россия, Е. М. Нестеров, доктор педагогических наук, профессор, заведующий кафедрой геологии и геоэкологии Российского государственного педагогического университета им. А. И. Герцена, nestem26@mail.ru, Санкт-Петербург, Россия
В работе представлены результаты многолетних мониторинговых исследований памятников из карбонатных пород, экспонирующихся на территории двух некрополей Государственного музея городской скульптуры. Комплексный методический подход к изучению памятников позволил понять главные причины деструкции материала, оценить скорость происходящих изменений, а также определить очередность необходимых мер, направленных на противодействие разрушению объектов культурного наследия. Приведена методика описания биоповреждений и определена роль отдельных видов микромицетов в процессах разрушения камня. С использованием культуральных и молекулярных методов выявлен видовой состав микроскопических грибов, встречающихся на памятниках. Стало возможным оценить возможную роль микромицетов в деструкции каменного материала. Приведен список доминирующих видов, родов и порядков микромицетов на территории Музейных некрополей. Проведено сравнение результатов, полученных при помощи разных методов отбора материала, с указанием их сходств и различий. Определены особенности применения молекулярных методов.
Полученные данные послужили основой для проведения мероприятий, направленных на защиту памятников из различных типов природного камня от биологического разрушения, и позволили дать рекомендации по очередности и характеру требуемых реставрационных и консервационных работ.
The article presents the results of long-term monitoring studies of carbonate monuments, displayed at the two necropolises of the State Museum of City Sculpture. A comprehensive methodical approach to the study of monuments made it possible to understand the main reasons of the destruction of the material, to assess the rate of on going changes, as well as to determine the sequence of necessary measures aimed at countering the destruction of cultural heritage objects. A method for describing biodeterioration is given and the role of certain types of micromycetes in the processes of stone destruction is determined. The species composition of microscopic fungi found on the monuments was identified, using cultural and molecular methods. It became possible to evaluate the potential role of micromycetes in the destruction of the stone material. A list of the dominant species, genera and orders of micromycetes in the territory of the Museum necropolis is given. A comparison was made on the results obtained using various methods of material selection, with an indication of their similarities and differences. The features of the application of molecular methods are determined. The obtained data served as a basis for carrying out activities aimed at protecting monuments of various types of natural stone from biological destruction, and made it possible to give recommendations on the order and nature of the required restoration and conservation works.
Ключевые слова: мониторинг памятников, биоповреждения, микромицеты, каменные материалы, биопленки.
Keywords: monitoring of monuments, biodeterioration, micromycetes, rock materials, biofilms.
Введение. Мониторинг объектов культурного наследия — сложный и длительный процесс. Эффективность комплексного мониторинга во многом определяется регулярностью наблюдений, сочетанием полевых и лабораторных методов оценки происходящих изменений памятника. В его проведении могут участвовать сотрудники музея, реставраторы, биологи, геологи, материаловеды.
Одним из важнейших элементов мониторинга памятников, экспонирующихся на открытом воздухе, является оценка развития процессов биологической колонизации и биоповреждений каменного материала [1—3]. Особое внимание уделяется микроскопическим грибам (микромицетам) как активным деструкторам различных типов природного и искусственного камня. При этом основным способом борьбы с биоповреждениями до настоящего времени остается биоцидная обработка [3, 4]. Большинство авторов обращает внимание на необходимость разработки и совершенствования методов мониторинга объектов культурного наследия. Так, в работах О. В. Франк-Каменецкой с соавторами предложено использовать ква-лиметрическую экспертизу для этой цели [5], позволяющую определять текущее состояние памятника по степени
его разрушения числовым значением — от нуля (полное разрушение) до единицы (идеальное состояние).
Присутствие широкого спектра микроорганизмов на поверхности поврежденного камня отмечали многие авторы. Особо следует выделить работы, показывающие роль микромицетов в ухудшении состояния знаменитых памятников в городской среде [6—10]. В большинстве работ отмечается, что на поверхности памятников формируется сложное микробное сообщество (биопленка), которое влияет на состояние каменного материала.
Целью данного исследования было сравнительное изучение состава микробного сообщества памятников, подвергающихся биологической колонизации, на основе данных многолетнего мониторинга (на примере каменных памятников некрополей Государственного музея городской скульптуры в Санкт-Петербурге). Основной задачей было исследование состава и структуры сообществ микромицетов на памятниках некрополей как одних из наиболее опасных деструкторов каменного материала в условиях городской среды.
Материал и методы. Исследования проводились на территории двух некрополей (XVIII века и Мастеров искусств), которые в настоящее время принадлежат государственному Музею городской скульптуры. Здесь находятся более 1000 надгробных памятников, выполненных из бронзы, чугуна и различных видов натурального камня, среди которых широко представлены карбонатные породы: известняки и мраморы. Месторасположение Музейных некрополей (Центральный район Санкт-Петербурга) способствует привнесению на поверхность памятников атмосферных загрязнений с высоким содержанием тяжелых металлов, пылевых частиц и др. Памятники находятся в тени старовозрастных деревьев, что влияет на формирование в некрополях своеобразного микроклимата, благоприятствующего развитию процессов биообрастания памятников.
Наиболее уязвимыми и подверженными биоповреждениям являются памятники, созданные из карбонатных пород (мрамор и известняк). Некоторые из них экспонируются здесь уже более 200 лет.
В период 2007—2018 гг. нами было обследовано 156 памятников. Отбор проб (неповреждаю-щими методами) для исследований состава мико-биоты на каменных памятниках проходил ежегодно в период полевых исследований (с июня по сентябрь) и был приурочен к плановым мероприятиям по текущему контролю за состоянием памятников. Во всех случаях основными крите-
риями выбора объектов исследования служили признаки их биологической колонизации. Учитывалась сложность формы и рельефа памятника, а также его местоположение. Основное внимание было уделено уникальной коллекции памятников, созданных из мрамора.
Общее число всех собранных проб составило 2285. Эти пробы отбирали неповреждающими методами по согласованию с сотрудниками Музея городской скульптуры. Часть проб была отобрана на пробных площадках, при заложении которых отмечали изменения поверхности каменного материала: эрозия поверхности, выкрашивание и осыпание поверхностного слоя, трещиноватость, микропиттинг (слабые углубления на поверхности), макропиттинг (заметные углубления на поверхности), следы потеков влаги и исщерблен-ность поверхности.
Отбор проб проводился с использованием стерильных ватных палочек, а также отпечатков с поверхности на питательную среду. Для первичного выделения грибов использовалась питательная среда Чапека-Докса. Культивирование и идентификация микромицетов осуществлялись в соответствии с общепринятыми методиками и с использованием отечественных и зарубежных определителей.
Одним из методов выявления микроорганизмов на поверхности камня стал метагеномный анализ. Для его проведения отбирали типичные биопленки нескольких типов: а) биопленка с преобладанием лишайников на карбонатных породах (рускеальский мрамор, брекчиевидный мрамор); б) наслоение водорослей на поверхности гранита (сердобольский и гранит рапакиви); в) типичные грязевые наслоения; г) биопленки с доминированием грибов на поверхности карбонатных пород.
В работе использованы праймеры для амплификации участка 1Т81-5.8Б-1Т82 («Бигль», Россия): 1ТЯ4 ТССТССОСТТАТТОАТАТОС 1ТЯ7
сатаАктсАТсаАятсттш.
Исследования выполнены на базе ресурсного центра СПбГУ «Развитие клеточных и молекулярных технологий».
Основные характеристики сообществ микро-мицетов оценивали по Т. Г. Мирчинк (1988). Для обработки результатов использовалась программа Б^йвйса.
Результаты и обсуждение. За годы экспонирования памятников на открытом воздухе на территории Музейных некрополей сформировалось агрессивное микробное сообщество, в составе которого широко представлены микромицеты-деструкторы. Всего было выявлено 79 видов мик-ромицетов и два неспороносящих типа мицелия
1
5 2:
а т
но
<u u
н р
п м о
a -1
-2
Cladosporium „dados porioi des
Peni cillium s p. «
•
\ureob35idium _р.|Ии ,.п s PenialliiCDnß Asff 1Г
Aller naria _alternata Epicoccu n IftifiKMfBrTpa _vi ride
SïdO^ îicllïfrïi^fîgr cola
Ptioma _h erb arum
-3
-4
-16 -14 -12 -10
8 -б -4 -2 Компрнента 1: 85,54 %
Рис. 1. Распределение видов в пространстве главных компонент
3
2
о
2
4
б
(светлый и темный). Наиболее богатыми по числу видов оказались роды Aspergillus и Penicillium — 5 и 12 видов соответственно. Роды Phoma, Clado-sporium, Mucor содержали от 3-х до 4-х видов. Остальные роды были представлены 1—2 видами. Значительную часть видового списка составили темноокрашенные микромицеты, в том числе — дрожжеподобные. Отметим, что среди часто встречающихся видов заметное м есто занимают типичные представители почвенной микобиоты (виды родов Penicillium, Cladosporium, Fusarium и др.).
В выделенных с камня культурах микромице-тов было зафиксировано образование кристаллов оксалата кальция, что указывает на активное выделение этими грибами щавелевой кислоты, являющейся одним из опасных факторов коррозии природного и искусственного камня. Их образование было связано с отдельными видами грибов. При этом кристаллы отличались по форме и размерам. В наибольшем количестве кристаллы были отмечены в культурах следующих грибов: Aspergillus niger, Aspergillus versicolor и Penicillium brevicompactum.
По 36 видов микромицетов было выделено из образцов биопленок с лишайниками, доминированием грибов и грязевыми наслоениями; 31 вид микромицетов был выявлен в биопленках с доминированием водорослей. Меньшее видовое разнообразие отмечалось в пробах гипсовой кор-
ки (23 вида) и из мест выкрашивания поверхностного слоя камня (26 видов). По показателю встречаемости подавляющее большинство видов относились к редким и случайным. Группы доминирующих и часто встречающихся видов выделяются достаточно четко и формируются, преимущественно, за счет темноокрашенных грибов.
Доминирующие группировки для всех типов повреждений практически совпадают. Небольшие различия касаются встречаемости отдельных видов. Интересно отметить, что виды родов Aspergillus и Penicillium, несмотря на достаточное разнообразие, в целом имели низкие показатели встречаемости и не вошли в группы доминирующих или часто встречающихся видов. Следует отметить высокую встречаемость стерильных (не-спорулирующих) форм микромицетов в изучен -ных пробах.
Абсолютным доминантом по встречаемости оказался микромицет Aureobasidium pullulans. Для получения наглядной картины распределения видов грибов по встречаемости мы использовали метод главных компонент. Вычисления выполнены с применением пакета программ Statistica, использована ковариационная матрица. Первые две компоненты объясняют 85,54 и 5,91 % изменчивости признаков соответственно (рис. 1). На графике выделяется плотное скопление, объединяющее редкие и случайные виды на основании
№ б, V019
29
данных по пространственной встречаемости. Доминирующие виды ( темноокрашенные микроми-цеты Aureobasidium pullulans, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides) наиболее удалены от этой группы. Выделяется и группа часто встречающихся видов.
Отмечено явное преобладание анаморфных темноокрашенных микромицетов над представителями других групп, а такие виды как Aureobasi-dium pullulans, Cladosporium cladosporioides, Alternaria alternata, Coniosporium sp. и Sydowia polyspora имели наиболее высокие показатели встречаемости в разные годы наблюдений. Интересно отметить, что именно эти виды наиболее быстро появляются на поверхности памятников после проведения биоцидных обработок.
В результате метагеномного анализа было выявлено 73 рода из 19 порядков грибов и грибопо-добных организмов. Наиболее многочисленным в отделе Ascomycota по количеству родов оказался порядок Pleosporales; из этого порядка встретились виды рода Helicosporium, Herpotrichia, Lepto-sphaeria, Lophiostoma, Paraconiothyrium, Phoma, Pyrenochaeta и Tubeufia. Такие порядки, как Chaetothyriales и Hypocreales также были представлены достаточным родовым разнообразием. Из числа базидиомицетов наиболее многочисленным по количеству родов оказался порядок Trem-mellales с родами: Bullera, Cryptococcus, Derxomy-ces, Fibulobasidium, Kwoniella и Tremella.
Необходимо отметить, что отдельные таксоны грибов ранее не отмечались на памятниках Санкт-Петербурга и были выявлены нами благодаря использованию метагеномного анализа. Применение данного метода подтвердило, что подавляющее большинство выявленных родов относятся к числу редких и случайных, что согласуется с результатами, полученными с использованием культурального метода.
Биопленка с доминированием лишайников представлена наибольшим количеством грибов из отдела Basidiomycota и в целом заметно отличается от других проб по разнообразию и обилию видов. Интересно отметить, что при исследовании проб с использованием культуральных методов нам практически не удавалось выделить и идентифицировать грибы из этого отдела. Вероятно, к данной группе могли относиться изоляты стерильного светлого мицелия, которые не имели явных таксономических признаков.
Биопленка с доминированием водорослей по числу выявленных родов очень близка к пробе с лишайниками. Доля аскомицетов составила 70,6 % от общего числа всех выявленных грибов,
базидиомицетов — 16,4 %, гломеромицетов — 1,2 % и зигомицетов — 5,5 %.
Очевидно, что значительные отличия проб с доминированием лишайников от других проб связано с составом самих лихенизированных грибов, а особенности пробы с доминированием водорослей, вероятно, обусловлены влиянием автот-рофного компонента сообщества на накопление (закрепление) микромицетов из группы редких и случайных. Проба биопленок с грязевыми наслоениями оказалась самой многочисленной по числу родов (всего здесь выявлено 40 родов грибов).
Интересно отметить, что биопленка с доминированием грибов характеризовалась «супердоминированием» темноокрашенных микромицетов. Этим, вероятно, можно объяснить общее снижение видового разнообразия по сравнению с другими пробами, где разнообразие достигается преимущественно за счет редких и случайных видов. По данным метагеномного анализа в процентном соотношении число аскомицетов в данной пробе составило — 78,6 %; базидиомицетов — 12,9 %; гломеромицетов — 0,6 % и зигомицетов — 0,4 %.
Результаты метагеномного анализа образцов показали наличие заметного сходства с данными, полученными классическими методами микологии ( рис. 2). Однако стоит сказать и о значительных различиях. Главное из них состоит в более высоком разнообразии всех таксономических групп, выявленных методом метагеномного анализа (от рода до отдела). Интересно отметить, что при выделении грибов классическими методами базидиомицеты не были обнаружены совсем (в период проведения исследований), тогда как метагеномный анализ показал значительную долю этих грибов во всех пробах. В одной из них (№ 1 — биопленка с доминированием лишайников) они и вовсе составили конкуренцию с представителями отдела Ascomycota по общему содержанию в микобиоте.
Доминирующими порядками по данным ме-тагеномного анализа были порядки Pleosporales, Chaetothyriales и Tremmelales, тогда как результаты, полученные при помощи классических методов микологии, указывают на доминирование порядков Eurotiales, Hypocreales и Pleosporales. Общими для всех сравниваемых типов биоповреждений оказались 10 родов и 9 порядков грибов, что свидетельствует о значительном сходстве комплексов микромицетов в различных типах повреждений. Анаморфные грибы из отдела Asco-mycota можно отнести к абсолютным доминантам всех собранных проб. К сожалению, метагеном-ный анализ позволил провести идентификацию грибов только до уровня рода, что в некоторой
Рис. 2. Процентное соотношение основных таксонов грибов в изученных пробах.
Примечание: 1 — данные, полученные при помощи метагеномного анализа; 2 — данные, полученные культуральным методом
степени затрудняет сравнение данных, полученных разными методами.
Результаты культуральных исследований, в целом, согласуются с данными, встречающимися в литературе. В то же время результаты метаге-номного анализа во многом являются новыми, отличаются от данных ряда литературных источников и требуют более глубокого осмысления. По нашему мнению, можно выделить несколько главных причин наблюдаемых различий. Поскольку при изучении проб классическими методами микологии используются определенные питательные среды (среда Чапека-Докса в нашем случае), вероятно, далеко не все микромицеты, в силу собственных предпочтений, могут вырасти на такой среде. К тому же, существует множество грибов, которые сложно, а порой и невозможно вывести в культуру. Вероятно, этим можно объяснить отсутствие базидиомицетов в выделениях с поверхности поврежденных памятников, тогда как при метагеномном анализе они были представлены в значительном количестве.
Заключение. В целом, результаты проведенных исследований позволяют нам сделать заключение о необходимости сочетания классических культуральных методов с молекулярно-генетичес-кими исследованиями литобионтных сообществ. Данный подход дает возможность отобрать штаммы доминирующих микромицетов-деструкторов памятников для проведения последующих экспериментальных исследований. При таком сочета-
нии методов мы можем составить представление о наиболее активных культивируемых формах грибов, а также получить наиболее полные данные о всем разнообразии грибов на данном субстрате.
Важно отметить, что метагеномный анализ подтвердил выделение (классическими методами) доминирующей группы видов литобионтных сообществ.
Результаты микологического исследования говорят о значительном влиянии внешней среды на формирование сообществ микромицетов, развивающихся на памятниках. Так, доминирующие виды темноокрашенных микромицетов на поверхности памятников из карбонатных пород были отмечены нами и на поверхности листьев деревьев, под которыми находились памятники.
Полученные данные легли в основу мероприятий, направленных на сохранение памятников некрополей и их защиту от биологического повреждения. Приведенные результаты свидетельствуют о необходимости осуществления долгосрочного мониторинга, который может показать пространственно-временную динамику процессов разрушения памятников и выявить влияние факторов окружающей среды на состояние каменного материала.
Исследования поддержаны проектом РНФ 1917-00141 «Современное минералообразование при участии микроорганизмов».
Библиографический список/ References
1. Dicus D. H. One response to a collection wide mould outbreak: how bad can it be, how good can it get? Journal of the American Institute for Conservation, 2000. Vol. 39. P. 85—105.
2. Sterflinger K. Fungi: their role in deterioration of cultural heritage. Fungal biology reviews. 2010. Vol. 24. No. 1. P. 47—55.
3. Sterflinger K., Picar G. Microbial deterioration of cultural heritage and works of art — tilting at windmills? Applied Microbiology and Biotechnology, 2013. Vol. 97. P. 9637—9646.
4. Abdelhafeza A. A., El-Wekeelb F. M., Ramadana E. M., Abed-Allaha A. A. Microbial deterioration of archaeological marble: Identification and treatment. Annals of Agricultural Sciences. 2012. Vol. 57. No. 2. P. 137—144.
5. Frank-Kamenetskaya O., Vlasov D., Egorova V., Karpenkov E., Rytikova V. Creation of the database on a state of Saint Petersburg stone monuments by complex monitoring result. Conference volume (Studia) of 1$h Meeting of the Association of European Geological Societies (MAEGS16) (9-13 July 2009), 2009. P. 116—117.
6. Saarela M., Alakomi H. L., Suihko M. L., Maunuksela L., Raaska L., Mattila-Sandholm T. Heterotrophic microorganisms in air and biofilm samples from Roman catacombs, with special emphasis on actinobacteria and fungi. Int. Biodeterior. Bio-degrad, 2004. Vol. 54. P. 27—37.
7. Scheerer S., Morales O., Gaylarde C. Microbial Deterioration of Stone Monuments-An Updated Overview. Advances in applied microbiology, 2009. Vol. 66. P. 97—139.
8. Marvasi M., Donnarumma F., Frandi A. Black microcolonial fungi as deteriogens of two famous marble statues in Florence, Italy. Int. Biodeterior. Biodegrad. 2012. Vol. 68. P. 36—44.
9. Grishkin V., Shigorets S., Vlasov D., Miklashevich E., Zhabko A., Kovshov A., Vlasov A. Development of Stone Monuments Monitoring System Using Computer Technology. Biogenic — Abiogenic Interactions in Natural and Anthropogenic Systems. Lecture Notes in Earth System Sciences. Springer, 2016. P. 415—421
10. GorbushinA A., Krumbein W. Subaerial microbial mats and their effects on soil and rock. Microbial Sediments, 2000. P. 161—170.
MONITORING THE MYCOBIOTA OF THE MARBLE MONUMENTS IN THE MUSEUM NECROPOLISES OF SAINT-PETERSBURG
S. Yu. Bobir, Postgraduate student, Herzen State Pedagogical University of Russia, sv_bobir@mail.ru, Saint Petersburg, Russia, M. S. Zelenskaya, Ph. D. (Biology), Senior Research Fellow, Saint Petersburg State University, marsz@yandex.ru, Saint Petersburg, Russia,
D. Yu. Vlasov, Ph. D. (Biology), Dr. Habil, Associate Professor, Saint Petersburg State University, dmitry.vlasov@mail.ru, Saint Petersburg, Russia,
E. M. Nesterov, Ph. D. (Pedagogy), Dr. Habil, Professor, Head of Department of Geology and Geoecology, Herzen State Pedagogical University of Russia, nestem26@mail.ru, Saint Petersburg, Russia
