Мониторинг чувствительности к антимикотикам природных штаммов и клинических изолятов дрожжевых грибов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ИММУНОЛОГИЯ

5. Boyko E.R., Evdokimov V.G., Potolitsyna N.N., Kaneva A.M., Varlamova N.G., Kochan T.I. et al. The pituitary-thyroid axis and oxygen consumption parameters under the conditions of chronic cold exposure in the North. Fiziologiya cheloveka. 2008; 34 (2): 93-8. (in Russian)

6. Popkova V.A., Tipisova E.V., Yur'ev Yu.Yu. Endocrine profile specific at pulp and paper industry workers in Arkhangelsk. Ekologiya cheloveka. 2009; (3): 26-30. (in Russian)

7. Dobrodeeva L.K., Sen'kova L.V., Lyutfalieva G.T., Kornienko G.B., Prelovskaya I.B., Dobrodeev G.V. Levels of autoantibodies in healthy subjects. Fiziologiya cheloveka. 2006; 32 (1): 99-107. (in Russian)

8. Lyutfalieva G.T., Churkina T.S. Autoantibodies' role in adaptive mechanisms of regulation of functional activity of thyroid hormone and thyrotropin hormone of hypophisis in northern inhabitants. Ekologiya cheloveka. 2010; (10): 33-6. (in Russian)

9. Repina V.P. Influence different concentration of catecholamines on the functions of immunocompetentive cells. Ekologiya cheloveka. 2008; (2): 30-3. (in Russian)

10. Maayan M.L., Sellitto R.V., Volpert E.M. Dopamine and L-dopa: inhibition of thyrotropin-stimulated thyroidal thyroxine release. Endocrinology. 1986; 118 (2): 632-6.

11. Sapronov N.S., Fedotova Yu.O. Hormones of the Hypothalamic-pituitary-thyroid System and the Brain [Gormony gipotalamo-gipofizarno-tireoidnoy sistemy i mozg]. St. Petersburg: Lan'; 2002. (in Russian)

12. Melander A. Aminergic regulation of thyroid activity: Importance of the sympathetic innervation and of the mass cells of the thyroid gland. Acta Med. Scand 1977; 201 (4): 257-62.

13. Levey G.S., Klein I. Catecholamine-thyroid hormone interactions and the cardiovascular manifestations of hyperthyroidism. Am. J. Med. 1990; 88 (6): 642-6.

14. Gorenko I.N. Dependence of thyroid hormone levels on dopamine concentration in blood of men from Arkhangelsk and Nes (Nenets Autonomous area). Vestnik Ural'skoy meditsinskoy akademicheskoy nauki. 2014; (2): 122-4. (in Russian)

15. Trukhacheva N.V. Mathematical Statistics in Biomedical Research Using Statistica Package [Matematicheskaya statistika v mediko-bioloogicheskikh issledovaniyakh s primeneniem paketa Statistica]. Moscow: GEOTAR-Media; 2013. (in Russian)

16. Nasledov A.D. Mathematical Methods of Psychological Research. Analysis and Data Interpretation [Matematicheskie metody psikho-logicheskogo issledovaniya. Analiz i interpretatsiya dannykh]. St. Petersburg: Rech'; 2012. (in Russian)

17. Gilman A.G., ed. Clinical Pharmacology by Goodman and Gilman. Volume 1 [Klinicheskaya farmakologiya po Gudmanu i Gilmanu. Tom 1]. Moscow: Praktika; 2006. (in Russian)

18. Kitaeva Yu.N., Tipisova E.V. Functional activity of the pancreatic gland in local and native wandering population of the European North. Izvestiya Samarskogo nauchnogo tsentra RAN. 2011; 13 (1-7): 1714-6. (in Russian)

19. Sunahara R.K., Niznik H.B., Weiner D.M., Stormann T.M., Brann M.R., Kennedy J.L. et al. Human dopamine D1 receptor encoded by an intronless gene on chromosome 5. Nature. 1990; 347 (6288): 80-3.

Поступила 11.10.16 Принята к печати 29.11.16

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 615.282.015.8

Глушакова А.М.1, Качалкин А.В.1, Ахапкина И.Г.2

МОНИТОРИНГ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИМИКОТИКАМ ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ И КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ

1ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова», 119991, Москва; 2ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова», 105064, Москва

Диско-диффузным методом протестирована чувствительность к антимикотикам 15 штаммов грибов рода Candida, выделенных из природных субстратов, и 25 клинических изолятов. Грибы относились к видам C. albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. parapsilosis, C. tropicalis. Обнаружена высокая чувствительность клинических изолятов к флуконазолу, нистатину, клотримазолу, итраконазолу, амфотерицину В за исключением штаммов C. glabrata 5 и C. tropicalis 4, которые показали средний уровень чувствительности. Продемонстрирована высокая чувствительность к антимикотикам штаммов, выделенных из природных образцов, за исключением 4 резистентных штаммов C. parapsilosis. Можно предположить, что до четверти природных штаммов грибов рода Candida могут обладать резистентностью к антимико-тикам, вызывая разные формы микотических поражений.

Ключевые слова: дрожжи; Candida; флуконазол; микозы; чувствительность к антимикотикам; оппортунистические инфекции.

Для цитирования: Глушакова А.М., Качалкин А.В., АхапкинаИ.Г. Мониторинг чувствительности к антимикотикам природных штаммов и клинических изолятов дрожжевых грибов. Клиническая лабораторная диагностика.2017; 62 (5): 296-299. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-5-296-299 GlushakovaA.M.1, KachalkinA.V.1, AkhapkinaI.G.2

THE MONITORING OF SENSITIVITY OF NATURAL STRAINS AND CLINICAL ISOLATES OF YEAST FuNGuS To ANTI-MYcoTIcS

1The M.V. Lomonosov Moscow state university, 119991 Moscow, Russia

2The I.I. Mechnikov research institute of vaccines and sera, 105064 Moscow, Russia

Для корреспонденции: Глушакова Анна Марковна, мл. науч. сотр., канд. биол. наук, МГУ им. М. В. Ломоносова; e-mail: annglushakova@ yandex.ru

immunology

The disc diffusion technique was applied to test sensitivity to anti-mycotics of 15 strains of fungi genus Candida separated from natural substrates and 25 clinical isolates. The fungi were of species C. albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. parapsilosis, C. tropicalis.The high sensitivity of clinical isolates to Fluconazole, Nystatin, Clotrimazole, Itraconazole, Amphotericin Bwas established, except strains C. glabrata 5 and C. tropicalis 4 demonstrating average level of sensitivity. The high sensitivity to anti-mycotics of strains separated from natural samples was demonstrated except 4 resistant strains C. parapsilosis. It can be supposed that up to one forth of natural strains of fungi genus Candida can have resistance to antibiotics, bringing to various forms of mycotic affections.

Keywords: yeast; Candida; Fluconazole; mycosis; sensitivity to anti-mycotics; opportunistic infections. For citation: Glushakova A.M., Kachalkin A.V., Akhapkina I.G. The monitoring of sensitivity of natural strains and clinical isolates of yeast fungus to anti-mycotics. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostic) 2017; 62 (5): 296-299. (inRuss.). D0I:http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-5-296-299

For correspondence: Glushakova A.M., candidate of biological sciences, junior researcher. e-mail: annglushakova@yandex.ru Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.

Acknowledgment. The study had sponsor support by the Russian Scientific Foundation № 14-50-00029

Received 26.10.2016 Accepted 29.11.2016

Введение. Активное воздействие человека на окружающую среду ведет к существенным изменениям пейзажа сообщества микроорганизмов, развитию в почвенно-растительных субстратах комплекса оппортунистических и патогенных дрожжевых грибов. Отмечено активное развитие в природных субстратах некоторых видов грибов рода Candida, способных вызывать различные поверхностные и системные микозы. В сообществах грибов, развивающихся на пыльце ветроопыляемых растений в городской среде, постоянно присутствуют Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, в то время как в лесных массивах в пыльце названные грибы не выявлены [1]. В плодах яблонь и груш, растущих в городских условиях, обнаружено значительное количество C. parapsilosis, причем на протяжении всего периода формирования и развития [2]. В условиях крупного мегаполиса в окружающей среде увеличивается доля потенциально опасных для человека видов грибов, контакт с которыми становится постоянным, и соответственно велика доля вероятности инфицирования человека новыми штаммами. Отсутствуют данные о чувствительности к ан-тимикотикам природных штаммов патогенных и условно-патогенных грибов - потенциальных возбудителей микозов. Анализ чувствительности к антимикотикам грибов из природных субстратов в сравнении с клиническими штаммами представляется актуальным.

Цель исследования - мониторинг чувствительности к ан-тимикотикам природных штаммов и клинических изолятов грибов рода Candida.

Материал и методы. Использованы стандартные диски с антимикотиками: флуконазол (40 мкг/диск), нистатин (80 мкг/диск), клотримазол (10 мкг/диск), амфотерицин В (40 мкг/диск), итраконазол (10 мкг/диск) производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, а также агаризо-ванная глюкозо-пептонная среда лабораторного приготовления (агар - 20 г/л, пептон - 5 г/л, дрожжевой экстракт - 2,5 г/л, глюкоза - 10 г/л). Выделены 25 клинических изолятов и 15 штаммов из природных субстратов C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis, C. guilliermondii. Чувствительность к антимикотикам определяли диско-диффузионным методом. Готовили инокулят каждого штамма, соответствующего по плотности 0,5 по МакФарланду, содержащий примерно 1,4 108 КОЕ/мл. 1 мл инокулята засевали газоном на чашки Петри. Через 15 мин после инокуляции на поверхность питательной среды наносили диски с антибиотиками. Посевы инкубировали при 25 и 370С в течение 72 и 24 ч соответственно. Результаты учитывали в отраженном свете при помощи штангенциркуля. Диаметр зон задержки роста измеряли с точностью до 1 мм. Все штаммы исследовали для каждого антимикотика в трех повторностях. Статистическую

обработку данных проводили с использованием программы Statistica 8.0.

Результаты. Исследовано 40 штаммов C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. guilliermondii. Чувствительность исследованных штаммов к антимикоти-кам приведена в таблице.

Все штаммы Candida, выделенные от иммунокомпро-метированных больных, чувствительны к протестированным антимикотикам (d > 25 мм) за исключением штаммов C. glabrata 5 и C. tropicalis 4. Эти штаммы продемонстрировали промежуточную чувствительность (d = 15-20 мм) к клотримазолу, итраконазолу, амфотерицину В; C. glabrata 5 - к флуконазолу; C. tropicalis - к нистатину. Грибы, выделенные из природных сустратов, оказались чувствительными к антимикотикам. Исключением явились штаммы C. parapsilo-sis 1-4, которые показали высокую степень резистентности ко всем протестированным антимикотикам, наиболее часто применяемым в настоящее время.

с. albicans 1 С. aibicans 8 С. tropicalis 8 С. aibicans 2 С. aibicans 7 С. tropicalis 1 С. glabrata 6 С. glabrata 2 с. glabrata 4 С. tropicalis 2 С. tropicalis 7 С. albicans 3 С. glabrata 1 С. aibicans 5 С. glabrata 7 С. aibicans 6 С. guilliermondii 8 С. glabrata 8 С. tropicalis 3 С. guilliermondii 1 С. albicans 4 С. glabrata 3 С. parapsilosis 5 С. parapsilosis 6 С. parapsilosis 8 С. parapsilosis 7 с. tropicalis 5 С. guilliermondii 7 С. tropicalis 6 С. guilliermondii 6 С. guilliermondii 2 С. guilliermondii 5 С. guilliermondii 3 С. guilliermondii 4 С. tropicalis 4 С. glabrata 5 С. parapsilosis 3 С. parapsilosis 1 С. parapsilosis 2 С. parapsilosis 4 С. parapsilosis 3

20 40 60 80 Уровень сходства, %

Кластеризация исследованных штаммов по степени чувствительности к антимикотикам.

ИММУНОЛОГИЯ

Чувствительность дрожжевых грибов к антимикотикам

№ штамма Место выделения Диаметр зоны задержки роста, мм*

флуконазол нистатин клотримазол итраконазол амфотерицин В

C. albicans 1 Почва 43 28 27 28 25

C. albicans 2 Пыльца березы 40 33 26 25 25

C. albicans 3 Кожа головы 33 30 27 28 25

C. albicans 4 То же 31 25 25 31 26

C. albicans 5 " " 33 26 25 26 27

C. albicans 6 Кожа вокруг глаз 34 27 26 26 25

C. albicans 7 То же 37 26 25 26 26

C. albicans 8 Кожа предплечья 44 28 26 26 25

C. parapsilosis 1 Мякоть яблока 2 2 2 3 2

C. parapsilosis 2 Плоды пижмы 3 1 2 2 2

C. parapsilosis 3 Почва 3 1 3 2 4

C. parapsilosis 4 Пыльца березы 2 1 2 2 2

C. parapsilosis 5 Кожа на пояснице 25 25 26 26 25

C. parapsilosis 6 Кожа вокруг рта 26 25 27 25 25

C. parapsilosis 7 Кожа головы 25 26 26 28 26

C. parapsilosis 8 Кожа вокруг глаз 25 25 29 26 26

C. glabrata 1 Кишечный тракт таракана рыжего 31 29 27 29 27

C. glabrata 2 Цветки копытня европейского 42 28 29 29 28

C. glabrata 3 Пыльца березы 38 25 32 30 30

C. glabrata 4 Зев 38 27 29 27 27

C. glabrata 5 Кожа голени 16 35 16 15 15

C. glabrata 6 Кожа головы 37 30 27 28 25

C. glabrata 7 Кожа вокруг глаз 33 27 26 26 27

C. glabrata 8 То же 36 26 27 28 28

C. tropicalis 1 Пыльца березы 37 27 27 25 25

C. tropicalis 2 Почва 40 28 29 27 28

C. tropicalis 3 Кожа вокруг глаз 33 27 28 27 26

C. tropicalis 4 Кожа предплечья 36 15 16 15 17

C. tropicalis 5 Зев 31 25 26 26 27

C. tropicalis 6 Кожа голени 31 26 26 28 26

C. tropicalis 7 Кожа головы 41 27 27 26 27

C. tropicalis 8 Кожа стопы 45 25 26 25 28

C. guilliermondii 1 Плоды шиповника 33 25 27 28 27

C. guilliermondii 2 Цветки клевера лугового 30 28 26 26 26

C. guilliermondii 3 Плоды кокосовой пальмы 30 26 29 26 26

C. guilliermondii 4 Пыльца березы 32 26 27 25 25

C. guilliermondii 5 Зев 29 27 25 25 25

C. guilliermondii 6 Кожа вокруг глаз 31 27 26 27 26

C. guilliermondii 7 Кожа на животе 31 26 25 26 27

C. guilliermondii 8 Кожа предплечья 34 28 25 26 26

Примечание. * - средняя величина диаметра зоны задержки роста без указания доверительного интервала, который составлял ±2 практически для всех позиций.

Обсуждение. Более 20 видов грибов рода Candida могут быть этиологическими агентами инвазивного кандидо-за у человека; более 90% кандидозов связаны с C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei [3-15].

Для исследования взяты штаммы C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. guilliermondii. Последний является анаморфой Meyerozyma guilliermondii, широко распространен в природе, являясь эврибионтным видом,

встречается в самых различных субстратах и регионах, ассоциирован с различными, прежде всего кожными, инфекциями. Кластеризация исследованных штаммов по чувствительности к протестированным антимикотикам показывает высокое сходство разных видов и штаммов грибов. Исключение составляют природные штаммы C. parapsilosis (см. рисунок). Это требует особого внимания, поскольку данный вид активно развивается в природных субстратах и с течением времени может вытеснить чувствительные штаммы как этиологический агент оппортунистических инфекций. C. parapsilosis представляет потенциальную опасность для иммунокомпрометированных пациентов и детей младшего возраста с не полностью сформировавшейся иммунной системой. В нашем исследовании наиболее активным антими-котиком оказался флуконазол.

В условиях активного изменения окружающей среды происходит перестройка природных сообществ дрожжевых грибов, все более значительную долю среди них начинают занимать оппортунистические и патогенные виды, которые раньше встречались спорадически. Некоторые из них могут обладать резистентностью к наиболее часто назначаемым антифунгаль-ным препаратам. Изучена чувствительность к антимикотикам только 15 штаммов, причем случайно выбранных из природных субстратов, среди которых 4 оказались резистентными. Можно предположить, что около четверти природных штаммов грибов рода Candida могут нести потенциальную опасность развития микозов у людей. Мониторинг чувствительности к антимикотикам и вирулентности грибов из антропогенной среды представляется целесообразным и своевременным.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке грантом РНФ 14-50-00029.

ЛИТЕРАТУРА (пп. 5-15 см. REFERENCES)

1. Глушакова А.М., Качалкин А.В., Желтикова Т.М., Чернов И.Ю. Дрожжевые грибы, ассоциированные с ветроопыляемыми растениями - ведущими пыльцевыми аллергенами в средней полосе России. Микробиология. 2015; 84 (5): 612-5.

2. Глушакова А.М., Качалкин А.В. Эндофитные дрожжи в сочных плодах в условиях антропогенизации. Микробиология. 2016; 85 (6): 725-31.

3. Лебедева Т.Н. Патогенез аллергии к Candida species (обзор). Проблемы медицинской микологии. 2004; 6 (1): 3-8.

4. Рунке М. Грибковые инфекции у иммунокомпрометированных пациентов (эпидемиология, диагностика, терапия, профилактика). Проблемы медицинской микологии. 2000; 2 (1): 4-16.

IMMuNOLOGY

REFERENCES

1. Glushakova A.M., Kachalkin A.V., Zheltikova T.M., Chernov I.Yu. Yeasts associated with wind-pollinated plants - leading pollen allergens in Central Russia. Mikrobiologiya. 2015; 84 (5): 612-5. (in Russian)

2. Glushakova A.M., Kachalkin A.V. Endophytic yeasts in Malus domestica and Pyrus communis fruits under anthropogenic impact. Mikrobiologiya. 2016; 85 (6): 725-31. (in Russian)

3. Lebedeva T.N. Pathogenesis of allergy to Candida species (Review). Problemy meditsinskoy mikologii. 2004; 6 (1): 3-8. (in Russian)

4. Runke M. Fungal infections in immunocompromised patients (epidemiology, diagnosis, thereapy, prophylaxis). Problemy meditsinskoy mikologii. 2000; 2 (1): 4-16. (in Russian)

5. Davies J.M., Stacey A.J., Gilligan C.A. Candida albicans hyphal invasion: thigmotropism or chemotropism. FEMS Microbiol. Lett. 1999; 171 (2): 245-9.

6. Gautret P., Rodier M.H., Kauffmann-Lacroix C. et al. Clustering of Candida parapsilosis blood stream infections in the hospital of Poitiers, France: a retrospective study. J. Mycol. Med. 2000; 10: 197202.

7. Hickey W.F., Sommerville L.H., Schoen F.J. Disseminated Candida glabrata: a report of a uniquely severe infection and a literature review. Ann. J. Clin. Pathol. 1983; 80: 724-7.

8. Hiruma M., Maeng D.J., Kobayashi M., Suto H., Ogawa H. Fungi and atopic dermatitis. Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi. 1999; 40 (2): 79-83.

9. Jobst D., Kraft K. Candida species in stool, symptoms and complaints in general practice a crosssectional study of 308 outpatients. Mycoses. 2006; 49: 415-20.

10. Kuhn M.D., Mukherjee P.K., Clark A.T., Pujol C., Chandra J., Hajjeh R.A. et al. Candida parapsilosis characterization in an outbreak setting. Emerg. Infect. Dis. 2004; 10 (6): 1075-81.

11. Meis J., Petron M., Bille J., Ellis D., Gibbs D. A global evaluation of the susceptibility of Candida species to fluconazole by disk diffusion. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2000; 36 (4): 215-23.

12. Prescott R.J., Harris M., Banerjee S.S. Fungal infections of small and large intestine. J. Clin. Pathol. 1992; 45 (9): 806-11.

13. Rinaldi M.G. Problems in the diagnosis of invasive fungal diseases. Rev. Infect. Dis. 1991; 13 (3): 493-5.

14. Stone H.H., Kolb L.D., Currie C.A., Geheber C.E., Cuzzell J.Z. Candida species: pathogenesis and principles of treatment. Ann. Surg. 1974; 179 (5): 697-711.

15. Wingard J.R. Importance of Candida species other than C. albicans as pathogens on oncology patients. Clin. Infect. Dis. 1995; 20 (1): 115-25.

Поступила 26.10.2016 Принята к печати 29.11.2016