CC BY
0BIOLOGICAL SCIENCES
Федотов О.В.
Декан б1олог1чного факультету Донецького нацюнального утверситету, м. Втниця, Укра'та
Велигодська А.К.
Старший викладач кафедри ф1зюлоги та 6ioxiMiiрослин Донецького нацюнального ун1верситету, м. Втниця, Украша
МОЛОКОЗС1ДАЛЬНА I АНТИОКСИДАНТНА АКТИВН1СТЬ ЕНЗИМНИХ ПРЕПАРАТ1В ШТАМ1В ГРИБ1В ПОРЯДКУ
POLYPORALES S.L.
MILK-CLOTTING AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF ENZYME PREPARATIONS OF FUNGI STRAINS OF THE ORDER POLYPORALES S.L.
Fedotov O.V., dean of the Biology Faculty, Donetsk National University, Vinnytsia, Ukraine
Velygodska A.K., senior lecturer of the Department Physiology and Biochemistry of Plants, Donetsk National University, Vinnytsia, Ukraine
АНОТАЦ1Я
Робота присвячена вивченню молокозсiдальноi i антиоксидантно'1' активностi ензимних препаратiв грибного похо-дження. Матерiал до^дження - 13 ензимних препаратiв (ЕП) молоко.задально1' dii, видшем i3 культурально'1'рiдини шта-Mie грибiв 10 видiв - Corticium laeve Fr.; Chaetoporus ambiquus (Bres.) Bond. et Sing.; Fibuloporia mollusca (Pers.) Bond. et Sing.; Tyromyces lacteus (Fr.) Murr.; T. revolutus (Bres.) Bond. et Sing.; T. undosus (Peck.) Murr.; Irpex lacteus (Fr.: Fr.) Fr.; Amyloporia lenis (Karst.) Bond. et Sing.; Hydnum ochraceum Pers.; Sparassis crispa (Fr.) Fr. з порядку Polyporales s.l. та 2 про-мисловi молокоз^дальт ензимт препарати. ЕП отримували шляхом фракцюнування сульфатом амотю з культурального фтьтрату. Молокозадальну активтсть (МЗА) препаратiв визначали за методом Кавт i Мукш; юльюсний вмют протешу - на аммтокислотному аналiзаторi. Загальну АОА матерiалу оцiнювали за iнтенсивнiстю гальмування накопичення про-дуктiв ПОЛ в модельтй реакци окиснення Твт-80 киснем повтря. Встановлено, що отриманi препарати грибних ензимiв мають вмют протешу до 50%, що пояснюеться ступенем 1'х очищення задiяними методами. Молокозадальна активтсть ЕП не залежить вiд вмiсту протешу та коливаеться в широких межах. Максимальна МЗА грибних ЕП характерна для штамму А-025 T. revolutus, штамму В-059 1. lacteus i штамму В-046 H. ochraceum. МШмальний рiвень МЗА ЕП зафжсовано для штамму Б-004 S. crispa i штамму М-250 T. undosus. Ензимш препарати проявляють в р1знш мiрi антиоксидантну активтсть, рiвень яко'1' залежить вiд АОА сполук р1зно'1' природи, що ввтшли до складу ЕП. Найвищу, понад 90%, АОА мають препарати штамму М-250 T. undosus, штамму В-046 H. ochraceum i штамму В-0591. lacteus.
ABSTRACT
The purpose of this work was to study milk-clotting and antioxidant activity ofbasydiomycetes enzyme preparation. The material of the study was 13 enzyme preparations (EP) with milk-clotting activity isolated from culture fluid from fungi strains of 10 species: Corticium laeve Fr.; Chaetoporus ambiquus (Bres.) Bond. et Sing.; Fibuloporia mollusca (Pers.) Bond. et Sing.; Tyromyces lacteus (Fr.) Murr.; T. revolutus (Bres.) Bond. et Sing.; T. undosus (Peck.) Murr.; Irpex lacteus (Fr.: Fr.) Fr.; Amyloporia lenis (Karst.) Bond. et Sing.; Hydnum ochraceum Pers.; Sparassis crispa (Fr.) Fr. from the order Polyporales s.l. and 2 industrial milk-clotting enzyme preparations. EP obtained by ammonium sulfate fractionation from the culture filtrate. Milk-clotting activity (MCA) ofpreparation was investigated by Kawai andMukai method. Quantitative protein identified by the amino acid analyzer. The total AOA of material estimated by intensity of inhibition of lipid peroxidation accumulation products in the model reaction of Tween-80 oxidation by ox-ygen. 1t was found that received fungal enzymes preparation contain 50% of protein because of the degree of preparation purification level. Milk-clotting activity of EP activity is not dependent on protein content and varies widely. The maximum of MZA was recorded in preparation of strain А-025 T. revolutus, В-0591. lacteus and В-046 H. ochraceum. Minimum level of MZA EP was observedfor strain Б-004 S. crisцpa i штамму М-250 T. undosus. Antioxidant activity of enzyme preparations varies widle, the level of it depends on the AOA compounds of different nature. The highest level of AOA (over 90%) was recorded in strain of штамму М-250 T. undosus, штаму В-046 H. ochraceum i штаму В-059 1. lacteus.
Ключовi слова: бiотехнологiя, базидюмщети, ензимн препарати, молокозадальна активтсть, антиоксидантна активтсть.
Keywords: biotechnology, basidiomycetes, enzyme preparations, milk-clotting activity, antioxidant activity
За останш роки помггао iнтенсифiкувалося вивчення бюлопчно активних речовин (БАР), в т.ч. антиоксиданпв i ензимiв вищих базидiальних грибiв з метою з'ясування ix практичного використання [2, 7, 8]. Примiром, ензимш комп-
лекси грибiв задiянi в бютрансформацп складних та xiмiчно стшких бiополiмерiв, що мае промислове [1, 5] та еколопчне значения [18]. У культурах базидюмщепв знайдеш вс класи протеолггачних ферменпв - карбоксильш, серинов^ тiоловi
i металозалежш. B^Mi4aerbCH, що бiльшiсть позаклiтинних ферментiв базидiомiцетiв становлять кислi проте!нази [8, 11]. Ензими i полщукри, полiфеноли i терпени, полжетиди i стеро!ди, вiтамiни i вiтамiноподiбнi речовини та iншi БАР rp^iB мають терапевтичну дiю. Вона обумовлена, зокрема, !х антиоксидантною актившстю - здатнiстю до поглинання (scavenging) вшьних радикалiв, модуляцп активностi ензи-мiв шляхом хелатування металiв та шпбування окисления лiпiдiв. Дослвдження показали, що грибн метаболiти, в т.ч. антиоксиданти мають високий рiвень бюдоступносп i здат-нi швидко метаболiзуватися в орrанiзмi [7, 12, 16].
Перспектившсть штродукци i використання в бютех-нолоriчних виробництвах базидiомiцетiв, i особливо - тг-нотрофiв, обумовлена невибагливютю до поживного се-редовища та придатнiстю до промислово! ферментацп, здатнiстю утворювати рясну бiомасу при рiзних режимах культивування. Вони здатн до синтезу широкого спектру фiзiолоriчно активних метаболiтiв, в тому чи^ ензимiв рiз-ного спектру до та антиоксидантних сполук [11].
Виконанi численнi скринiнrовi дослiдження дозволили виявити придатнi для бiотехнолоriчних цiлей штами-про-дуценти певних ензимiв [3, 8]. Проте наявн публтаци охо-плюють, враховуючи рiзноманiття i чисельнiсть видiв бази-дiомiцетiв, достатньо вузьку систематичну групу rрибiв. Цi дослiдження не завжди завершуються розробкою технологи отримання ензимних препаратiв (ЕП) та дослщженням !х характеристик.
Вибiр молокозсiдальних ЕП грибного походження, як об'екта дослi-дження обумовлений наступним. По-перше, проведений первинний скриншг велико! групи базидюмь цетiв дозволив отримати штами з високим рiвнем молокоз-свдально! активностi у культура По-друге, iснуe дефiцит промислових молокозадальних ЕП. По-трете, ЕП е екстра-целюлярними, що зменшуе собiвартiсть !х отримання в умо-вах бютехнолопчного виробництва. По-четверте, корекцiя прооксидантно-антиоксидантного балансу шляхом попов-нення запаав антиоксидантiв ззовнi певними продуктами харчування чи лiкувально-профiлактичними препаратами може значно знизити стутнь прояви оксидантного стресу
[15]. Однак, перелiк природних продукпв (natural product-based drug discovery - NPDD), багатих на антиокисн речовини обмежений. У зв'язку з цим, доцiльним е пошук нових активних продуцентiв природних ан-тиоксиданпв та про-дуктiв, що мiстять так1 сполуки [7, 10, 11].
Виходячи з вищезазначеного, метою роботи було порiв-няльне дослi-дження молокозсвдально! i антиоксидантно! активностi ензимних препаралв грибного походження.
Матерiали i методи дослщжень
Матерiалами дослiджень були 13 ЕП молокозадально! ди, видiленi iз культурально! рвдини штамiв грибiв (табл.) 10 видiв - Corticium laeve Fr.; Chaetoporus ambiquus (Bres.) Bond. et Sing.; Fibuloporia mollusca (Pers.) Bond. et Sing.; Tyromyces lacteus (Fr.) Murr.; T. revolutus (Bres.) Bond. et Sing.; T. undosus (Peck.) Murr.; Irpex lacteus (Fr.: Fr.) Fr.; Amyloporia lenis (Karst.) Bond. et Sing.; Hydnum ochraceum Pers.; Sparassis crispa (Fr.) Fr. з порядку Polyporales s.l. [14] та 2 промисловi молокозсiдальнi ензимн препарати.
Штами поверхнево перiодично культивували на глюко-зо-пептонному середовищi (ГПС) до максимально! молокозадально! активносп (МЗА) культурального фiльтрату (КФ). Ферментацш вели при iндивiдуальних, оптимальних для кожно! культури значеннях рН i температури. Грибнi моло-козсiдальнi ЕП отримували шляхом фракцiонування сульфатом амонш з культурального фiльтрату [4, 8]. МЗА препара-тiв визначали за методом Кава! i Мука! [8]. Кшьшсний вмiст проте!ну визначали за допомогою амшокислотного аналiза-тора моделi ААА-881. Загальну АОА матерiалу оцiнювали за iнтенсивнiстю гальмування накопичення продуктiв ПОЛ в модельнiй реакци окиснення Твiн-80 киснем повiтря [9].
Дослщи проводили у трикратнiй повторносп. Статистич-ну обробку експериментальних даних проводили з викорис-танням Microsoft Excel та пакету програм для проведення статистично! обробки результатiв бюлопчних експеримен-тiв. Достовiрною вважалася рiзниця за рiвня вiрогiдностi Р>0,95 [6].
Результати дослвджень та !х обговорення
Процес отримання ЕП дослiджуваних шташв включав наступнi етапи (рис.).
VOL 1, N0 2 (2) (2016) | # BЮLOGICAL SCIENCES #
73
Культивування штаму-продуценту
Вiддiлення бюмаси (фiльтрування), 5±1°С
Культуральний фiльтрат
Мщелш
Деградацiя клiтин, 5±1°С
Екстрагування бшюв, 5±1°С
Висолювання бiлкiв, 5±1°С
Центрифугування (2000 15 хв., 5±1°С)
Дiалiз проти дистильовано! води (24 год., 5±1°С)
Лiофiльна сушка
Екстрацелюлярш ЕП
Iнтрацелюлярнi ЕП
Рис. Схема отримання препаратiв ензимiв штамiв базидiальних грибiв
На початковому етапi отримання препарапв грибних ензимiв, штами-продуценти культивували в оптимальних умовах. Пiсля досягнення максимально! ферментативно! ак-тивностi, ввддшяли бiомасу вiд культурально! рвдини шляхом фшьтрування. Фракцiонування ензимiв в КФ проводили шляхом розчинення сульфату амонш до 90% концентрацi!. Використовували цей метод завдяки висок1й розчинносп у водi та стабiлiзуючiй ди на бiлкову молекулу (NH4)2SO4. Фракцш бiлку, яка утворила осад, вщщляли центрифугу-ванням на рефрижераторнiй центрифузг Потiм проводили первинну очистку отримано! бшково! фракцп за допомогою дiалiзу проти охолоджено! дистильовано! води. Для приско-рення дифузп, розчинник дешлька разiв замiнювали до пов-
ного очищення розчину бiлкiв ввд сульфату амонш. Завдя-ки осмосу, молекули розчинника призводили до часткового розведення дослiдного розчину.
Завершальним етапом, бiлковi розчини тддавали лю-фiльнiй сушцi, отримуючи таким чином ензимш препарати екстрацелюлярного походження, як1 мали вигляд порошку ввд свiтло-сiрого до свiтло-кремового забарвлення. Вихвд ЕП становив 0,16±0,04 г/ л КФ. Для ФП встановлено опти-муми рН i температурно! ди, якi коливаються в межах 4,56,5 i 25-35 °С вщповщно.
Дослiдженi ЕП мають iндивiдуальнi характеристики: вмют бiлку, мо-локозсвдальну та антиоксидантну активнiсть (табл.).
Таблиця
Походження, молокозадальна i антиоксидантна актившсть ензимних препарапв
№ з/п Вид гриба чи ЕП Штам Протеш, % МЗА ЕП, тис. од. МЗА протеьну, тис. од. АОА ЕП, %
Грибш ЕП
1. Corticium laeve Р-330 20,74 689,0 3322,08 52,98
2. Chaetoporus ambiquus В-062 33,20 457,9 1379,22 80,24
3. Fibuloporia mollusca А-020 17,37 611,2 3518,71 24,19
4. Tyromyces lacteus А-027 37,12 675,0 1818,43 46,30
5. Tyromyces revolutus А-025 36,20 884,0 2441,99 39,51
6. Tyromyces undosus С-070 31,05 524,0 1687,60 -62,85
7. М-250 29,60 320,0 1081,08 94,78
8. Irpex lacteus В-059 39,11 883,9 2260,04 90,80
9. М-232 34,07 611,2 1793,95 16,89
10. М-253 33,76 427,8 1267,18 86,73
11. Amyloporia lenis A-004 43,63 442,9 1015,13 56,08
12. Hydnum ochraceum В-046 41,17 829,1 2013,85 92.63
13. Sparassis crispa Б-004 35,22 160,1 454,57 -42,80
Промисловi молокозадальш ЕП
14. Хiмозин (ЕС 3.4.23.4) - 8,36 918,0 10980,86 19,79
15. Пепсин А (ЕС 3.4.23.1) - 12,05 550,0 4564,32 12,89
Примггка: результати надаються без зазначення похибки, оскiльки ЕП аналiзувалися в кшъкосп 1 зразка кожного виду
Встановлено, що найвищш - понад 40% вмют протешу, серед дослi-джених мали ЕП штаму А-004 A. lenis та штаму В-046 H. ochraceum. Найнижчий вiдсоток бiлкових сполук - близько 20% мали грибш ЕП штаму А-020 F. mollusca та штаму Р-330 C. laeve. Порiвняно низький вмiст протешу -до 50% у ензимних препаратах дослвджених rp^iB поясню-еться ступенем гх очищення задiяними методами. У цiлому, найменший процентний вмiст протешу зафшсовано у про-мислових молокозсiдальних ЕП, що пояснюеться стандар-тизацieю препарапв за рiвнем МЗА.
ЕП проявляють молокозсвдальну активнiсть, яка не залежить ввд вмiсту протешу та коливаеться в широких межах. Мшмальний рiвень МЗА ЕП зафжсовано для штаму Б-004 S. crispa i штаму М-250 T. undosus. Максимальна МЗА грибних ЕП характерна для штаму А-025 T. revolutus, штаму В-059 I. lacteus i штаму В-046 H. ochraceum. Перерахунок молокозадально1 активносп на протеш ЕП показав наступ-не. Найвища МЗА властива бiлковим сполукам ЕП штаму А-020 F. mollusca i штаму Р-330 C. laeve. I навпаки, МЗА протешв ЕП штаму М-250 T. undosus i штаму A-004 A. lenis е найнижчою. Промисловi молокозсвдальш препарати мають МЗА, що врегульована зпдно вимог стандарту на цю продукцiю.
Цiкаво, що ва ЕП проявляють в рiзнiй мiрi антиокси-дантну активнiсть. Ïï рiвень, ймовiрно, залежить вiд АОА сполук рiзноï природи, як1 ввшшли до складу ЕП. Найвищу, понад 90%, АОА мають препарати штаму М-250 T. undosus, штаму В-046 H. ochraceum i штаму В-059 I. lacteus. Низь-кий рiвень АОА ввдшчено для ЕП штаму А-020 F. mollusca
i штаму М-232 I. lacteus. Найнижча АОА, що не перевищу-вала 20% характерна промисловим препаратам. Це поясню-еться високим рiвнем 1'х очищення та внесенням, з метою стандартизации за МЗА, до 1'х складу наповнювача - NaCl2. В ходi дослiду зафжсовано окисну дш ЕП штамiв С-070 T. undosus i Б-004 S. crispa. Останне можна пояснити перева-жанням прооксидантних процесiв в культурi цих штамiв.
Висновки
Таким чином, результати вивчення складу, молокозсь дально1 i антиоксидантно1 активностi ензимних препарапв грибного походження дозволяють стверджувати наступне.
1. Отриманi препарати грибних ензимiв мають вмiст протешу до 50%, що пояснюеться ступенем 1'х очищення за-дiяними методами.
2. Молокозадальна активнiсть ЕП не залежить ввд вмiсту протеïну та коливаеться в широких межах. Максимальна МЗА грибних ЕП характерна для штаму А-025 T. revolutus, штаму В-059 I. lacteus i штаму В-046 H. ochraceum. Мшмальний рiвень МЗА ЕП зафжсовано для штаму Б-004 S. crispa i штаму М-250 T. undosus.
3. Ензимш препарати проявляють в рiзнiй мiрi анти-оксидантну активнiсть, рiвень якоï залежить ввд АОА сполук рiзноï природи, що ввiйшли до складу ЕП. Найвищу, понад 90%, АОА мають препарати штаму М-250 T. undosus, штаму В-046 H. ochraceum i штаму В-059 I. lacteus.
Дослщження виконано в рамках програми прикладних дослщжень Мiнiстерства освiти i науки Украши (проект № 0115U000090). Висловлюемо щиру подяку науковим сшв-робiтникам ввддалу мiкологiï 1нституту ботанiки iм. М.Г.
Холодного НАН Украни за сшвпрацю, надаш матерiали Колекцй' культур шапинкових грибiв (1ВК), що мае статус Нацюнального надбання Укра!ни.
Список лгтератури
1. Белозерская Т. А. Активные формы кислорода и стратегия антиоксидантной защиты у грибов / Т.А. Белозерская, Н.Н. Гесслер // Прикладная биохимия и микробиология. - 2007. - Т.43, №5. - С. 565-575.
2. Вассер С.П. Лекарственные шляпочные грибы: история, современное состояние, тенденции и нерешенные проблемы в их изучении / С.П. Вассер. // Макромицеты: лекарственные свойства и биологические особенности. - К., 2012. - С. 5-45.
3. Волошко Т.£. Скриншг шташв базидюмщепв за актившстю антиоксидантних оксидоредуктаз / Т.£. Волошко, О.В. Федотов // Мшробюлопя i бiотехнологiя. - Одеса: ОНУ iм.. I.I. Мечшкова, 2011. - №. 4(16). - С. 69-81.
4. Дудка И.А. Методы экспериментальной микологии. / И.А. Дудка, С.П. Вассер, И.А. Элланская. - К.: Наук. думка, 1982. - 550 с.
5. Капич А.Н. Сопряжение перекисного окисления липидов с деградацией лигнина у дереворазрушающих ба-зидиомицетов / А.Н. Капич. // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты : сб. науч. тр. -2011. - Т. 3. - С. 316-335.
6. Приседський Ю.Г. Статистична обробка результапв бюлопчних експерименпв / Ю.Г. Приседський. - Донецьк: Кассиопея, 1999. - 210 с.
7. Сирчш С.О. Оцшка антиоксидантно! активносп де-яких дикорослих макромщепв. / С.О. Сирчiн, Г.А. Гродзин-ська. // Укр. ботан. журн. - 2015. - 72(3). - C. 257-260.
8. Федотов О.В. Порiвняльнa характеристика грибiв порядку Aphyllophorales - продуцентiв молокозгортаючих
ферменпв / О.В. Федотов, С.Ф. Негруцький, М.1. Бойко. // Укр. ботан. журн. - 1997. - 54, № 2. - С. 145-153.
9. Чайка О.В. Оцшка еколопчного стану довкшля з використанням прооксидантно-антиоксидантно1 активносп культур базидiомiцетiв / О.В. Чайка, О.В. Федотов. // Бюре-сурси i природокористування. - Т. 6. - № 1-2, 2014. - С. 5-11.
10. Asatiani M.D. Higher basidiomycetes mushrooms as a source of antioxidants / M.D. Asatiani, V Elisashvili, G. Songulashvil, A.Z. Reznick, S.P. Wasser. // Progress in Mycology / Eds M. Rai, G. Kovics. - Springer, 2010. - P. 311-326.
11. Fedotov O.V. Wood-destroying fungi as bio-sources of ferments for medicinal and nutritional purposes / O.V. Fedotov - Plant and Microbial Enzymes: isolation, characterization and biotechnology applications - Tbilisi: Myza, 2007. - P. 125-129.
12. Kalac P.A review of chemical composition and nutritional value of wild-growing and cultivated mushroom / P. Kalac. // J. Sci Food Agric. - 2013. - 93. - P. 209-218.
13. Kirk P.M. Ainsworth & Bisby's Dictionary of the fungi. 9th ed. / P.M. Kirk, P.F. Cannon, J.C. David, J.A. Stalpers -Wallingford, CAB International, 2001. - 655 р.
14. Mau J.L. Antioxidant properties of several medicinal mushrooms / J.L. Mau, H.C. Lin, C.C. Chen. // J. Agr. Food Chem. - 2002. - 50(21). - P. 6072-6077.
15. Radzki W. Antioxidant capacity and polyphenolic content of dried wild edible mushrooms from Poland / W. Radzki, A. Slawinska, E. Jablonska-Rys, W. Gustaw. // Int. J. Med. Mushrooms. - 2014. - 16(1). - P. 65-75.
16. Selvi S. In vitro Antioxidant and Antilipidperoxidative potential of Pleurotus florida / S. Selvi, P. Chinnaswamy. // Anc. Sci. Life. - 2007. - 26(4). - P. 11-17.
17. Winquist E. Production of lignin modifying enzymes on industrial waste material by solid-state cultivation of fungi / E. Winquist, U. Moilanen, А. Mettala. // Biochem. Eng. J. -2008. - V. 42. - Р. 128-132.
