CC BY
17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 615.03:616-01/09
ШИФР СПЕЦИАЛЬНОСТЬ
14.03.06 Фармакология, клиническая фармакология
Молекулярный поиск перспективных молекул-кандидатов в селективные антагонисты ионного канала TRPAi
Е. А. Бесхмельницына1, Д. В. Кравченко2, М. В. Покровский1, М. В. Корокин1, А. А. Пересыпкина1, Е. И. Варавин1, Д. А. Костина1
1 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», Российская Федерация, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85
2 Закрытое акционерное общество «Исследовательский институт химического разнообразия», Российская Федерация, 141400, Химки, ул. Рабочая, д. 2а, корп. 1
Статья поступила 03.07.2017 г. Принята к печати 21.08.2017 г.
Резюме: Проведен анализ ряда молекул-кандидатов в селективные антагонисты ионного канала TRPA1 с помощью методов молекулярного моделирования в высокопроизводительном скрининге. Определены их механизмы действия и специфическая активность на клетках с суперэкспрессией ионного канала TRPA1. Подтверждена антагонистическая активность изученных субстанций в отношении ионного канала TRPA1 в результате молекулярного скрининга биологически активных молекул в сравнении с контрольным антагонистом. Установлено, что наибольшая активность проявлена веществом под шифром ZC02-0012, которое является основным кандидатом и может быть рекомендовано для проведения дальнейших исследований безопасности и селективности в тестах in vitro с последующим рядом экспериментов in vivo для определения его активности и безопасности применительно к живым системам.
Ключевые слова: ионный канал TRPA1; боль; ноцицепция; воспаление; высокопроизводительный молекулярный скрининг; молекулы-кандидаты в селективные антагонисты ионного канала TRPA1.
Библиографическое описание: Бесхмельницына ЕА, Кравченко ДВ, Покровский МВ, Корокин МВ, Пересыпкина АА, Варавин ЕИ, Костина ДА. Молекулярный поиск перспективных молекул-кандидатов в селективные антагонисты ионного канала TRPA1. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения 2017; 7(3): 186—189.
Учитывая огромное количество пациентов, страдающих от хронического болевого синдрома, одной из ведущих задач современной фармакологии являются поиск и создание новых анальгетических препаратов, не обладающих побочными эффектами нестероидных противовоспалительных средств и наркотических анальгетиков, но при этом имеющих достаточную эффективность. Проводимые на современном этапе исследования физиологии и патофизиологии боли с применением новейших достижений в области науки и техники привели к открытию новых рецепторов, участвующих в передаче болевых раздражений, что открыло перспективу на создание качественно новой группы анальгетических лекарственных препаратов, способных обеспечить достаточно эффективную и безопасную фармакотерапию болевого синдрома [1]. Одним из таких рецепторов является анкириновый рецептор ТЯРА1, экспрессия которого наиболее выражена в ноцицепторах малого диаметра [2—5]. Проводимое на сегодняшний день огромное количество исследований подтвердило его роль в восприятии боли, что повысило к нему интерес исследователей как к потенциальной биологической мишени [6—8]. Некоторые авторы отмечали даже увеличение экспрессии ТЯРА1 в условиях хронической боли и воспаления [9—12]. Сегодня ряд западных фармацевтических компаний работает над выводом на рынок новых лекарственных препаратов на основе селективных антагонистов ионного канала
ТЯРАЬ которые находятся на разных фазах клинических испытаний [13, 14].
Цель работы — подтверждение активности перспективных молекул-кандидатов в селективные антагонисты ионного канала ТЯРАЬ полученных в результате высокопроизводительного скрининга сфокусированной библиотеки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изначально из полуторамиллионной библиотеки малых органических молекул, имевшейся в распоряжении ЗАО «Исследовательский институт химического разнообразия», методом высокопроизводительного молекулярного скрининга были отобраны наиболее перспективные кандидаты в селективные антагонисты ионного канала ТЯРА1. Затем на клетках с суперэкспрессией ионного канала ТЯРА1 были подтверждены их механизм действия и специфическая активность.
Для эксперимента использовали клеточную суспензию в культуральной среде с 1-ммолярным раствором изопропилтиогалактопиранозида (ИПТГ) в концентрации 8-Ю5 клеток/мл, которую при помощи автоматических роботизированных станций Вютек БХ или Вютек МХ раскапывали в 384-луночные экспериментальные культуральные плашки с оптическим дном, по 25 мкл в каждую лунку. После этого экспериментальные плашки центрифугировали при
1500 об/мин в течение 5 мин и инкубировали при 37 "C в присутствии 5 % C02.
В день эксперимента к полученной клеточной суспензии добавляли Ca2+-чувствительную краску. Для этого содержимое одной ампулы тест-системы ФЛИПР® Кальций 4 («Molecular Devices», USA) растворяли в 20 мл буфера Хенкс/20тМ ХЕПЕС и использовали в качестве 25-кратного стока. 25 мл рабочего раствора Ca2+-чувствительной краски добавляли в каждую лунку 384-луночной экспериментальной плашки, после чего плашку инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре в темном месте.
Серийные разведения исследуемых веществ готовили путем растворения в диметилсульфоксиде (ДСМО) с помощью Biomek 2000. Финальная максимальная тестируемая концентрация веществ составила 30 мкмоль.
С целью стимуляции ионного канала TRPA1 использовали его агонист, аллилизотиоцианат, в концентрации EC80, что составило 30 мкмоль. В качестве контроля использовали известный антагонист ионного канала TRPA1 рутениевый красный в максимальной ингибирующей концентрации (IC100), равной б мкмоль.
Для определения антагонистической активности тестируемых молекул-кандидатов в селективные антагонисты ионного канала TRPA1 в каждую лунку 384-луночной плашки в соответствии с ее схемой добавляли по 12,5 мкл тестируемых веществ и приступали к считыванию на ФЛИПР. После инкубации в течение бб7 секунд в каждую лунку экспериментальной плашки раскапывали по 12,5 мкл аллилизотио-цианата и сразу проводили повторное считывание на ФЛИПР с целью определения активности потенциальных антагонистов ионного канала TRPA1.
Для веществ был выполнен анализ зависимости антагонистической активности от концентрации, на основании которого была определена величина концентрации полумаксимального ингибирования (IC50). Для анализа полученных данных использовали программу GraphPad Prizm («GraphPad Software, Inc.», San Diego, CA, USA). Концентрационная зависимость рассчитывалась по следующей формуле:
У= Нижнее плато кривой + Верхнее плато кривой - Нижнее плато кривой
1 + Ю^^О-X) Наклон кривой
(1)
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного молекулярного скрининга биологически активных молекул-кандидатов в селективные антагонисты ионного канала ТЯРА2 бышо установлено, что все исследованные кандидаты подтвердили свою активность. Механизм действия всех молекул заключается в антагонизме ионного канала ТЯРА2. Активность веществ в сравнении со стандартом (рутениевый красный) приведена в таблице 1 и на рисунке 1.
Рутениевый красный
С276-1460
ZC02-0007
ZC02-0011
ZC02-0012
ZC02-0020
Ю-8 10"
Концентрация, M
Рис. 1. Концентрационная зависимость антагонистической активности от концентрации исследуемых веществ (каждая концентрационная точка представляет собой усредненное значение для двух повторов)
Таблица 1
КОНЦЕНТРАЦИЯ ПОЛУМАКСИМАЛЬНОГО
ИНГИБИРОВАНИЯ ИССЛЕДУЕМЫХ МОЛЕКУЛ-КАНДИДАТОВ В СЕЛЕКТИВНЫЕ АНТАГОНИСТЫ ИОННОГО КАНАЛА ТИРА2
Вещество IC5O, НМОЛЬ
Рутениевый красный 118,2
С27б-14б0 303,3
ZC02-0007 204,0
ZC02-0011 135,2
ZC02-0012 91,3
ZC02-0020 120,2
Представленные данные свидетельствуют о высокой специфической активности, которую ряд исследованных биологически активных молекул-кандидатов в селективные антагонисты ионного канала TRPAi демонстрирует in vitro. Наибольшую активность проявило соединение под шифром ZC02-0012, его IC50 составила 91,3 нмоль.
ВЫВОДЫ
Результаты молекулярного скрининга биологически активных молекул-кандидатов в селективные антагонисты ионного канала TRPA1 в сравнении с контрольным антагонистом (рутениевый красный) подтвердили антагонистическую активность изученных субстанций в отношении ионного канала TRPA1, при этом наибольшую активность проявило вещество под шифром ZC02-0012, его IC50 составила 91,3 нмоль. Таким образом, вещество под шифром ZC02-0012 является основным кандидатом и может быть рекомендовано для проведения дальнейших исследований безопасности (влияние на hERG К+ ионный канал и цитохромы) и селективности в тестах in
Е. А. Бесхмельницына, Д. В. Кравченко, М. В. Покровский и др.
vitro с последующим рядом экспериментов in vivo для определения его активности и безопасности применительно к живым системам.
ЛИТЕРАТУРА
1. Тактика и неотложная терапия болевого синдрома. Научно-информационный материал. М.: Ассоциация московских ВУЗов; 2010.
2. JordtSE, Bautista DM, Chuang HH, McKemy DD, Zygmunt PM, Ho-gestatt ED, et al. Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1. Nature 2004; 427(6971): 260-5.
3. Trevisani M, Siemens J, Materazzi S, Bautista DM, Nassini R, Cam-pi B, et al. 4-Hydroxynonenal, an endogenous aldehyde, causes pain and neurogenic inflammation through activation of the irritant receptor TRPA1. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104(33): 13519-24.
4. Shelukhina I, Mikhailov N, Abushik P, Nurulin L, Nikolsky EE, Gini-atullin R. Cholinergic Nociceptive Mechanisms in Rat Meninges and Trigeminal Ganglia: Potential Implications for Migraine Pain. Front Neurol. 2017; (8): 163.
5. Bohonyi N, Pohoczky K, Szalontai B, Perkecz A, Kovacs K, Kaj-tar B, et al. Local upregulation of transient receptor potential anky-rin 1 and transient receptor potential vanilloid 1 ion channels in rectosigmoid deep infiltrating endometriosis. Mol Pain 2017; (13): 1744806917705564.
6. Asai Y, Holt JR, Geleoc GS. A quantitative analysis of the spatiotemporal pattern of transient receptor potential gene expression in the developing mouse cochlea. J Assoc Res Otolaryngol. 2010; 1 1(1): 27-37.
7. Matta JA, Cornett PM, Miyares RL, Abe K, Sahibzada N, Ahern GP. General anesthetics activate a nociceptive ion channel to enhance pain and inflammation. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105(25): 8784-9.
8. Бесхмельницына ЕА, Покровский МВ, Корокин МВ, Якушев ВИ, Гудырев ОС. Биологическая роль ионного канала TRPA1 при различных патологических состояниях. Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация 2012; 20(22-3): 30-5.
9. Nie Y, Huang C, Zhong C, Wortley MA, Luo Y, Luo W, et al. Cigarette smoke extract (CSE) induces transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) expression via activation of HIF1a in a549 cells. Free Ra-dic Biol Med. 2016; (99): 498-507.
10. NakaoS, Mabuchi M,WangS, KoqureY,ShimizuT, Noguchi K,etal. Synthesis of resveratrol derivatives as new analgesic drugs through desensitization of theTRPA1 receptor. Bioorg Med Chem Lett. 2017; 27(14): 3167-72.
11. Pryde DC, Marron BE, West CW, Reister S, Amato G, Yoger K, et al. Discovery of a Series of Indazole TRPA1 Antagonists. ACS Med Chem Lett. 2017; 8(6): 666-71.
12. Kravchenko DV, Beskhmelnitsyna EA, Korokin MV, Avtina TV, Ser-nov LN, Tishin AN, Kostina DA. Molecular screening of prospective candidates forTRPA1 ion channel selective antagonists. Research Result: Pharmacology and Clinical Pharmacology 2016; 2(1): 63-6.
13. Skerratt S. Recent Progress in the Discovery and Development of TRPA1 Modulators. Prog Med Chem. 2017; (56): 81-115.
14. Mukhopadhyay I, Kulkarni A, Aranake S, Karnik P, Shetty M, Tho-rat S, et al. Transient receptor potential ankyrin 1 receptor activation in vitro and in vivo by pro-tussive agents: GRC 17536 as a promising anti-tussive therapeutic. PLoS One 2014; 9(5): e97005.
ОБ АВТОРАХ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет». Российская Федерация, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85.
Бесхмельницына Евгения Александровна. Ассистент кафедры фармакологии.
Покровский Михаил Владимирович. Заведующий кафедрой фармакологии Медицинского института, д-р мед. наук, проф.
Норокин Михаил Викторович. Профессор кафедры фармакологии, д-р мед. наук, проф.
Пересыпкина Анна Александровна. Ассистент кафедры фармакологии, канд. фарм. наук.
Варавин Евгений Игоревич. Научный сотрудник Центра доклинических и клинических исследований.
Ностина Дарья Александровна. Аспирант кафедры фармакологии.
Закрытое акционерное общество «Исследовательский институт химического разнообразия». Российская Федерация, 141400, Химки, ул. Рабочая, д. 2а, корп. 1. Нравченко Дмитрий Владимирович. Генеральный директор, д-р хим. наук.
АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ
Бесхмельницына Евгения Александровна; еудепу_Ь89@та11.ги
MOLECULAR SCREENING FOR POTENTIAL SELECTIVE ANTAGONISTS OF TRPA1
ION CHANNEL
E. A. Beskhmelnitsyna1, D. V. Kravchenko2, M. V. Pokrovsky1, M. V. Korokin1, A. A. Peresypkina1, E. I. Varavin1, D. A. Kostina1
1 Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education «Belgorod National Research University» Pobedy street 85, Belgorod 308015, Russian Federation 2 Private limited company «Chemical Diversity Research Institute» Rabochaya street 2a, bld. 1, Khimki 141400, Russian Federation
Abstract: The article discusses the results of analysis a number of candidate molecules for TRPA1 ion channel selective antagonists using molecular modeling methods of high throughput screening. The study determined their mechanisms of action and specific activity in cells with overexpression of TRPA1 ion channel. It demonstrated antagonistic activity of test substances in relation to TRPA1 ion channel based on the results of molecular screening of biologically active molecules and their comparison with the reference antagonist. The highest activity was demonstrated by the substance with the ZC02-0012 code which was regarded as the main candidate that could be recommended for use in further safety and selectivity studies using in vitro tests and subsequent in vivo experiments aimed at determining its activity and safety in relation to living systems.
Key words: TRPA1 ion channel; pain; nociception; inflammation; high throughput screening; candidate molecules for selective antagonists of TRPA1 ion channel.
For citation: Beskhmelnitsyna EA, Kravchenko DV, Pokrovsky MV, Korokin MV, Peresypkina AA, Varavin EI, Kostina DA. Molecular screening for potential selective antagonists of TRPAi ion channel. The Bulletin of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products 2016; 7(3): 186-189.
REFERENCES
1. Tactics and emergency treatment of pain. Research and information material. Moscow: Association of Moscow universities; 2010 (in Russian).
2. JordtSE, Bautista DM, Chuang HH, McKemy DD, Zygmunt PM, Ho-gestatt ED, et al. Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1. Nature 2004; 427(6971): 260-5.
3. Trevisani M, Siemens J, Materazzi S, Bautista DM, Nassini R, Cam-pi B, et al. 4-Hydroxynonenal, an endogenous aldehyde, causes pain and neurogenic inflammation through activation of the irritant receptor TRPA1.Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104(33): 13519-24.
4. Shelukhina I, Mikhailov N, Abushik P, Nurulin L, Nikolsky EE, Gini-atullin R. Cholinergic Nociceptive Mechanisms in Rat Meninges and Trigeminal Ganglia: Potential Implications for Migraine Pain. Front Neurol. 2017; (8): 163.
5. Bohonyi N, Pohoczky K, Szalontai B, Perkecz A, Kovacs K, Kajtar B, et al. Local upregulation of transient receptor potential ankyrin 1 and transient receptor potential vanilloid 1 ion channels in recto-sigmoid deep infiltrating endometriosis. Mol Pain 2017; (13): 1744806917705564.
6. Asai Y, Holt JR, Geleoc GS. A quantitative analysis of the spatiotemporal pattern of transient receptor potential gene expression in the developing mouse cochlea. J Assoc Res Otolaryngol. 2010; 1 1(1): 27-37.
7. Matta JA, Cornett PM, Miyares RL, Abe K, Sahibzada N, Ahern GP. General anesthetics activate a nociceptive ion channel to enhance
pain and inflammation. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105(25): 8784-9.
Beskhmelnitsyna EA, Pokrovsky MV, Korokin MV, Yakushev VI, Gu-dyrev OS. The biological role of ion channel TRPA1 in various pathological conditions. Belgorod State University Scientific Bulletin. Medicine. Pharmacy 2012; 20(22-3): 30-5 (in Russian). Nie Y, Huang C, Zhong C, Wortley MA, Luo Y, Luo W, et al. Cigarette smoke extract (CSE) induces transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) expression via activation of HIFla in a549 cells. Free Ra-dic Biol Med. 2016; (99): 498-507.
Nakao S, Mabuchi M, Wang S, Koqure Y, Shimizu T, Noguchi K, et al. Synthesis of resveratrol derivatives as new analgesic drugs through desensitization of theTRPA1 receptor. Bioorg Med Chem Lett. 2017; 27(14): 3167-72.
Pryde DC, Marron BE, West CW, Reister S, Amato G, Yoger K, et al. Discovery of a Series of IndazoleTRPA1 Antagonists. ACS Med Chem Lett. 2017; 8(6): 666-71.
Kravchenko DV, Beskhmelnitsyna EA, Korokin MV, Avtina TV, Ser-nov LN, Tishin AN, Kostina DA. Molecular screening of prospective candidates for TRPA1 ion channel selective antagonists. Research Result: Pharmacology and Clinical Pharmacology 2016; 2(1): 63-6. 13. Skerratt S. Recent Progress in the Discovery and Development of TRPA1 Modulators. Prog Med Chem. 2017; (56): 81-115. Mukhopadhyay I, Kulkarni A, AranakeS, Karnik P, Shetty M, Thorat S, et al. Transient receptor potential ankyrin 1 receptor activation in vitro and in vivo by pro-tussive agents: GRC 17536 as a promising antitussive therapeutic. PLoS One 2014; 9(5): e97005.
9.
10.
11.
12.
14.
AUTHORS
Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education «Belgorod National Research University»,
Pobedy street 85, Belgorod 308015, Russian Federation.
Beskhmelnitsyna EA. Assistant professor of the Department of Pharmacology.
Pokrovsky MV. Head of the Department of Pharmacology of the Medical Institute. Doctor of Medical Sciences, professor. Korokin MV. Professor of the Department of Pharmacology. Doctor of Medical Sciences, professor. Peresypkina AA. Assistant professor of the Department of Pharmacology. Candidate of Pharmaceutical Sciences. Varavin EI. Research associate of the Centre of Preclinical and Clinical Research. Kostina DA. Postgraduate student of the Department of Pharmacology.
Private limited company «Chemical Diversity Research Institute», Rabochaya street 2a, bld. 1, Khimki 141400, Russian Federation. Kravchenko DV. Director General. Doctor of Chemical Sciences.
CONTACT E-MAIL
Beskhmelnitsyna Evgeniya Aleksandrovna; evgeny_b89@mail.ru
