CC BY
86
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2016, том 51, № 3, с. 376-384
УДК 635.21:632.4:582.281.144:577.21 doi: 10.15389/agrobiology.2016.3.376rus
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА РАС-ДИФФЕРЕНЦИАТОРОВ Phytophthora infestans*
Е.А. СОКОЛОВА1, Е.В. МОРОЗОВА2, Т.И. УЛАНОВА2, О.П. МАЛЮЧЕНКО1, 3, Я.И. АЛЕКСЕЕВ1, 3, М.А. КУЗНЕЦОВА2, Э.Е. ХАВКИН1
Фитофтороз, возбудителем которого является оомицет Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, остается серьезной агрономической и экономической проблемой в картофелеводстве. Традиционная классификация специализированных рас Phytophthora infsstans основана на 11 генах устойчивости (R-генах), перенесенных из Solanum demissum в культурный картофель S. tuberosum. Выборку сортов картофеля, каждый из которых несет один из этих R-ге-нов, называют набором растений-дифференциаторов Мастенброка-Блека. Этот набор используют для определения генов вирулентности (r-генов) в изолятах и штаммах P. infsstans. Коллекции таких индивидуальных штаммов поддерживают в качестве рас-дифференциаторов для выявления R-генов у культурных и дикорастущих растений Solanum. Хотя расы-дифференциаторы широко применяются в селекции картофеля на устойчивость к фитофторозу, они все еще недостаточно исследованы молекулярными методами. В настоящей работе мы изучали полиморфизм рас-дифференциаторов Phytophthora infestans, поддерживаемых в коллекции Всероссийского НИИ фитопатологии (Московская обл.). Для этого расы исследовали методом микросателлитного анализа по 12 геномным локусам; кроме того, провели сравнительный структурный анализ трех Avr генов, клонированных после ПЦР-амплификации геномной ДНК P. infestans. Геномную ДНК выделяли из 11 простых и сложных рас (1; 3; 4; 10; 11; 1.2; 1.3; 1.4; 1.2.3; 1.2.4; 1.2.3.4) и изолята 161, который содержал все 11 генов вирулентности. Нуклеотидные последовательности трех Avr генов депонировали в GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США) и сопоставили с другими хранящимися в нем последовательностями. Генотипирование рас-дифференциаторов P. infsstans показало, что они резко отличаются от референтных A1 штаммов и высокоагрессивных линий, доминировавших в последние годы в Западной и Центральной Европе. SSR кластеры рас-дифференциаторов не согласовались с профилями r-генов. Гены ipiO (распознаются геном устойчивости RB/Rpi-bb1 растений S. bulbocastanum и его ортологом Rpi-sto1 S. stolo-niferum), а также Avr3a и Avr4 (соответствуют генам R3a и R4 S. demissum) были обнаружены во всех исследованных изолятах P. infestans. Каждый ген был представлен несколькими аллелями. Сложный состав Avr генов противоречит традиционным представлениям о «простых» моногенных расах. В случае ipiO (номера последовательностей в GenBank KP308170-KP308174, KF154431-KF154433 и KF154434-KF154439) раса 1 была представлена аллелями I и II классов, в то время как расы 3 и 4 содержали только гены I класса. Ни в одной из этих рас не был обнаружен ген ipiO наиболее вирулентного III класса. Вирулентный аллель Avr3a_EM был найден у всех исследованных рас, а авирулентный аллель Avr3d_KI— только у рас 1, 3 и 1.2.3 (номера последовательностей KF154421-KF154426, KF154430, KP317568, KP317572, KP317580-KP317584, KP317588, KP317589). Ген Avr4 клонировали из рас-дифференциаторов 1, 3, 1.4 и 11 (KF188215-KF188223). Все эти расы содержали вирулентный аллель, а раса 11 несла вирулентный и авирулентный аллели. Результаты молекулярного и фи-топатологического анализа Avr и r генов сходились лишь у 30 % рас. Причинами этих расхождений могли стать накопление мутаций в Avr генах рас-дифференциаторов в процессе их длительного поддержания в коллекции и более сложный состав R генов у растений-дифференциаторов, на которых эти расы изначально отбирались.
Ключевые слова: Phytophthora infestans, Аигены, микросателлитные (SSR) маркеры.
Фитофтороз, возбудителем которого является оомицет Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, остается одной из самых серьезных агрономических и экономических проблем в картофелеводстве (1-3). Сведения об этой болезни, полученные фитопатологическими методами (1), в последние два десятилетия существенно пополнились благодаря молекулярным исследованиям патогена и растения-хозяина. Получены данные о строе-
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 14-04-31613а и 16-04-00098) и Министерства образования и науки Российской Федерации (проект № КГМЕГ162114X0003). Фитопатолотическая оценка изолятов РЬуююрЬиют infestansвыполнена в рамках Государственного задания 0598-2015-0018.
нии геномов P. infestans и растений Solanum (4), а также проведен транс-криптомный и протеомный анализ растений картофеля, пораженных фи-тофторозом (5-8). Большие успехи достигнуты в изучении генов виру-лентности/авирулентности (Avr генов) P. infestans и генов устойчивости (R генов) дикорастущих и культурных форм Solanum (9-11). Клонирование этих генов открыло новые возможности для исследования взаимодействия патоген—растение-хозяин на уровне отдельно взятого растения и аг-роценоза (9, 12, 13). Разработка высокоразрешающих методов микросател-литного анализа позволила надежно различать изоляты и линии P. infestans (14). В целом, методы молекулярной генетики и биотехнологии позволили достичь заметных успехов в изучении патогенеза и создании сортов картофеля, устойчивых к фитофторозу (12, 15, 16).
Для обнаружения и идентификации R генов в растениях селекционеры широко используют стандартные наборы простых и сложных рас-дифференциаторов P. infestans, которые различаются составом факторов вирулентности. Эти факторы соответствуют R1-R11 генам устойчивости видов Solanum, отвечающим за реакцию сверхчувствительности к патогену. Расовый состав изолятов P. infestans традиционно определяют с помощью набора растений-дифференциаторов: ими служат сорта картофеля, в которые перенесены R гены S. demissum (17-19). Достижения молекулярной фитопатологии позволили охарактеризовать факторы вирулентно-сти/авирулентности P. infestans как AVR эффекторы — продукты Avr генов. Их узнавание NB-LRR рецепторными киназами (продуктами R генов) индуцирует защитную реакцию растения. Если такого узнавания не происходит, эффекторы подавляют иммунитет растения или перестраивают его обмен веществ для обеспечения своих потребностей (9, 20, 21).
К настоящему времени полиморфные Avr гены достаточно полно охарактеризованы по строению (включая аллельный полиморфизм) и функциональной активности (9, 20, 22), однако соответствие между Avr генами и факторами вирулентности, валидированными с помощью растений-дифференциаторов, исследовано недостаточно. По определению, расы-дифференциаторы Блека-Мастенброка (18) различают только 11 R генов S. demissum и не опознают другие гены, которые могут присутствовать у видов Solanum. Однако ранее мы показали, что простые расы P. infestans содержат несколько классов Avr гена ipiO, узнающего отсутствующий у S. demissum ген RB/Rpi-blb1 S. bulbocastanum (23). Кроме того, часть растений-дифференциаторов содержат более одного R гена (24). В настоящее время имевшиеся затруднения преодолены благодаря созданию нового набора «моногенных» растений-дифференциаторов (25), однако этот набор еще не стал достоянием большинства научных и селекционных лабораторий.
В представленном исследовании фитопатологическая характеристика рас-дифференциаторов P. infestans была впервые дополнена результатами их генотипирования с помощью молекулярных маркеров и прямого анализа генов вирулентности.
Целью настоящей работы стало изучение полиморфизма рас-дифференциаторов Phytophthora infestans разного географического происхождения. Для этого расы исследовали методом микросателлитного анализа по 12 геномным локусам; кроме того, провели сравнительный структурный анализ трех Avr генов, клонированных после ПЦР-амплификации геномной ДНК P. infestans.
Методика. Использовали образцы Phytophthora infestans из коллекции Всероссийского НИИ фитопатологии (ВНИИФ).
Геномную ДНК выделяли с помощью набора AxyPrep™ Multisource Genomic DNA Miniprep Kit («Axygen Biosciences», США) из 11 простых и сложных рас (1; 3; 4; 10; 11; 1.2; 1.3; 1.4; 1.2.3; 1.2.4; 1.2.3.4) и изолята 161, который содержал все 11 генов вирулентности. Концентрацию ДНК измеряли с помощью нанофотометра UV/Vis NanoPhotometer P300 («IMPLEN», Германия).
Праймеры, использованные для амплификации Avr генов, были синтезированы ЗАО «Синтол» (Россия). Реакционная смесь для ПЦР содержала 1 мкл 10* ПЦР-буфера, 100-150 нг геномной ДНК, 1 мкл 2,5 мкМ dNTP, по 10 пмоль каждого праймера, 1 ед. Pfu ДНК-полимеразы («Fermentas», Литва) для клонирования или Taq ДНК-полимеразы (ЗАО «Синтол», Россия) для скрининга и стерильную воду до объема 10 мкл. Амплификацию проводили в термоциклере MJ PTC-200 («Bio-Rad», США) с использованием описанных ранее программ (23, 27-29).
ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 1 % агарозном геле с добавлением в буфер бромида этидия. Амплифицированные фрагменты ДНК вырезали из геля под УФ и очищали при помощи набора реагентов QIAquick Gel Extraction Kit («Qiagen N.V.», Германия) по протоколу фирмы-производителя. Клонирование осуществляли в pGEM/T Vector («Pro-mega», США). Выделенные плазмиды секвенировали с помощью анализатора Нанофор 05 («Институт аналитического приборостроения РАН», Россия). Нуклеотидные последовательности трех Avr генов депонировали в GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США) и сопоставляли с другими хранящимися в нем последовательностями.
Для различения генотипов P. infestans использовали 12 микроса-теллитных (simple sequence repeats, SSR) маркеров (14, 26). Протокол анализа и стандартизации длин ампликонов был описан ранее (30).
Результаты. В таблице 1 представлены изученные в работе расы-дифференциаторы Phytophthora infestans, в таблице 2 — праймеры, использованные для амплификации Avr генов.
1. Набор рас-дифференциаторов Phytophthorn . . Гены Avr33, Avr4 и infestans, использованный в работе (коллек- ipiO были °бнаружены в° ция Всероссийского НИИ фитопатологии, всех исследованных изоля-Московская обл.) тах P. infestans. Эти резуль-
таты подтверждают данные, полученные нами ранее (23), и свидетельствуют о более сложном составе Avr генов в изолятах по сравнению с традиционными представлениями о «простых» расах.
Наличие большого числа аллелей у Avr генов усложняет задачу создания высокоспецифичных SCAR (sequence characterized amplified region) маркеров, с помощью которых можно было бы скринировать изоляты P. infestans для характеристики патогена на ранних этапах заражения. Полноразмерные последовательности Avr генов приходится ампли-фицировать с помощью консервативных праймеров, а затем клонировать полученные ампликоны. Мы выявили значительный полиморфизм трех исследованных Avr генов.
Наиболее значительным полиморфизмом обладал ген ipiO = Avr-
Изолят Происхождение Фактор вирулентности Тип спаривания Год выделения
2K Германия 1 А1 1970
4K Германия 3 А1 1970
5K Германия 4 А1 1970
6К Грузия 10 А1 1978
7K Грузия 11 А1 1978
8K Германия 1.2 А1 1970
9K Германия 1.3 А1 1970
10K Германия 1.4 А1 1970
14K Россия 1.2.3 А1 1974
15K Россия 1.2.4 А1 1974
18K Германия 1.2.3.4 А1 1970
161 Россия (Москов-
ская обл.) 1-11 А1 2010
blbl, распознаваемый геном устойчивости RB/Rpi-blb1 растений S. bul-bocastanum и его ортологом Rpi-stol у S. stoloniferum (9). Широкое распространение этого Avr гена у P. infestans придает видам Solanum и сортам картофеля, несущим гены RB/Rpi-blbl и Rpi-stol, устойчивость к большинству рас патогена. Ген ipiO был представлен тремя полиморфными классами. В опытах по транзиентной ко-экспрессии ipiO и Rpi-blbl в растениях Nicotiana benthamiana было показано, что аллели ipiO I класса распознавались геном Rpi-blbl и, следовательно, были авирулентными. Гены, относящиеся ко II классу, также оказались авирулентными, но только в отсутствие генов I класса. Аллели ipiO более редкого III класса не взаимодействовали с Rpi-blbl и были вирулентными (9).
2. Последовательности праймеров, использованные для амплификации Avr генов у рас-дифференциаторов Phytophthora infestans
Ген
+3' последовательность праймеров
Температура отжига, °С
Длина ампли-кона, п.н.
Ссылка
ipiO F - CTTTCCGGCAATGCGTTCGC
R - CTATACGATGTCATAGCATGACAC Avr3a F - CCATGCGTCTGGCAATTATGCT
R - CTGAAAACTAATATCCAGTGA Avr4 F - ATGCGTTCGCTTCACATTTTGCTGG
R - CTAAGATATGGGCCGTCTAGCTTGGAG
65 5l0 (23, 27)
6l 451 (28)
6l 864 (29)
В наших опытах ген ipiO был клонирован и секвенирован из простых рас 1, 3 и 4. Мы обнаружили в расе 1 замены, характерные для I и II классов ipiO генов. У рас 3 и 4 не было ipiO генов II класса. Ни один из исследованных изолятов не содержал ipiO генов, принадлежавших к наиболее вирулентному III классу (табл. 3). Следовательно, расы 1, 3 и 4 должны быть авирулентными на растениях с генами RB/Rpi-blb1 и 1^—8101.
3. Варианты гена ipiO по классам вирулентности, выявленные в простых расах-дифференциаторах Phytophthora (коллекция Всероссий-
ского НИИ фитопатологии, Московская обл.)
Раса I класс II класс Номер последовательности в GenBank NCBI
ipiO-ül ipiO-üö ipiO-ü8 ipiO-09 ipiO-Ю ipiO-ll ipiO-l2 ipiO-03-l3
l + - - + - - + + KP308 l70-KP308174
3 + - - - - + - - KFl5443l-KFl54433
4 + - - - + - - - KFl54434- KFl54439
Примечание. «+» и «-» - соответственно наличие и отсутствие варианта.
Ген Avr3a был представлен двумя наиболее распространенными формами: Avr3a_KI — авирулентный аллель, распознаваемый киназой R3a, и Avr3a_EM — вирулентный аллель, не распознаваемый этой киназой. Эффекторы, соответствующие двум аллелям Avr3a, различались тремя аминокислотными остатками. Для авирулентного аллеля Avr3a_KI характерны аминокислотные остатки Cl9, K80 и Il03, для вирулентного Avr3a_EM— Sl9, E80 и Ml03 (28).
Ген Avr3a клонировали из рас l, l.2, l.3, l.2.3, l.2.4, 3, 4, l0, ll и l.2.3.4 и секвенировали (табл. 4). При этом мы обнаружили вирулентный аллель Avr3a_EM во всех исследованных расах, тогда как гаплотип, идентичный авирулентному аллелю Av3_KI, был найден только в расах l, 3 и l.2.3. Кроме того, у расы l был обнаружен неактивный паралог PEXl47-2. Примечательно, что только у трех рас (l, l.3, l.2.3.4) состав аллелей соответствовал составу генов вирулентности, который был определен на основе проведенного ранее фитопатологического анализа с растениями-дифференциаторами (см. табл. 4). Некоторые расы содержали ранее не описанные аллели Avr3a.
4. Аллельное разнообразие гена ЛугЗа в простых расах-дифференциаторах РЬуЬзрЬОюгв тбоШк (коллекция Всероссийского НИИ фитопатологии, Московская обл.)
Ожидаемый генотип AVR3a Аллель Avr3a (молекулярные данные)
Avr3a_KI (авирулентный) Avr3a_EM (вирулентный)
Раса
Номер последовательности в GenBank NCBI
1е
3
4 1.2 1.3е
1.2.3
1.2.4 10 11
1.2.3.4e
Avr3a_KI
Avr3a_EM
Avr3a_KI
Avr3a_KI
Avr3a_EM
Avr3a_EM
Avr3a_KI
Avr3a_KI
Avr3a_KI
Avr3a EM
KF154421, KP317568- KP317572
KF154422, KF154423 KF154424, KF154425 KF154426-KF154429 KF154430
KP317580-KP317584 KP317588, KP317589
Примечание. «+» и «-» — соответственно наличие и отсутствие варианта; е — расы, для которых полученные результаты соответствовали ожидаемым на основе фитопатологического анализа.
0
Генетическая дистанция Ю 15 20 25
30
11
ш
IV
1.2.4 161
1.2.3.4 11 10
1.4 1,3 1.2 1.2.3 4 3 1
23 А 1.2 23 All 10Л2 \_А 1.3 1А1.2
1 Л1.5 ГА1.4 1_А1.1
ЕС1 US8
5 А 1.2 5_А1.1 8_А1.4 8 А1.3 8 А1.2 Н А /. 1
4_Л1
2 Л 1.2 2 А1-1
057 6_А1.2
6 А 1.3 6 Al l
13 А2.2 13 А 2.4 13А2.3 —13 А2.1
D-
79
83
97
Кб
П-
100
>
82
90
Л-
Ген Луг4 клонировали из рас 1, 3, 1.4 и 11 (номера последовательностей в ОеиБаик КП88215-КР188223) и секвенировали. В случае Луг4 вирулентный аллель отличался от ави-рулентного сбоем рамки считывания и наличием стоп-кодонов — АТ12, АТ196 и С376Т (29).
С нуклеотидной последовательности вирулентного Луг4 не может транслироваться полноразмерный белок. Мы обнаружили этот аллель во всех исследованных расах. В расе 11 были найдены оба аллеля Луг4. Только результаты для рас 1.4 и 11 согласовывались с предположением, сделанным на основе фитопатологического анализа, о том, что авирулентный аллель Луг4 присутствует в геномах рас, в названии которых цифра 4 отсутствует, и наоборот.
При генотипировании сортов картофеля фитопатологическими методами с целью определения состава Я1-Я11 генов у £ ёетввит предполагается, что сорт, поражаемый определенной расой, содержит Я ген (или
Рис. 1. Дендрограмма, построенная на основании геноти-пирования рас-дифференциаторов и референтных изо-лятов Phytophthora infestans по 12 микросателлитным ло-кусам (14, 26): кластер I — расы-дифференциаторы, кластеры II-V — референтные штаммы (метод Neighbor Joining; указаны значения бут-стрепа для 1000 повторений, превышающие 0,70).
+
гены), строго соответствующий номеру расы. Расы для генотипирования (простые расы) отбираются на растениях-дифференциаторах (растения с известным набором R генов). Несовпадение молекулярных и фитопатоло-гических данных может быть вызвано изменением набора активных Avr генов в простых расах P. infestans в процессе их длительного поддержания в коллекции и более сложным составом R генов у растений-дифференциаторов, чем считалось ранее (24).
Мы провели филогенетический анализ полученных в нашей работе результатов (рис. 1), используя для сравнения опубликованные ранее данные об аллельном составе тех же локусов у стандартных генотипов US1-A1, EC1_A1 и US8-A2, нескольких западноевропейских референтных A1 линий и появившихся недавно высокоагрессивных клонов 13_A2 и 6_A1 (14, 26) (см. рис. 1).
Генетическая дистанция Рис. 2. Дендрограмма, постро-
0 5 10 15 20 25 30 35 енная на основании генотипирования рас-дифференциаторов Phytophthora infestans по 12 микросателлитным локусам (14, 26), отражающая связь SSR профиля с их географическим происхождением (использован метод Neighbor Joining).
Генотипирование по 12 микросателлитным локусам выявило заметные различия между расами-дифференциаторами и всеми линиями из Западной Европы (14, 26). Любопытно отметить, что подкластеры рас-дифференциаторов на дендрограмме частично совпали с географическим происхождением этих рас (рис. 2).
Таким образом, мы впервые определили профиль генов вирулентности у рас-дифференциаторов с помощью молекулярных методов. Оказалось, что эти расы имеют более сложный аллельный состав Avr генов, чем предполагалось ранее. Все они содержали активные формы гена ipiO и вирулентные аллели генов Avr3a и Avr4. Присутствие авирулентных аллелей Avr генов, которые соответствуют r генам, определяемым фитопатологиче-ским методом (с растениями-дифференциаторами), не всегда соответствовало ожидаемым результатам. Причинами расхождения молекулярных и фитопатологических данных о составе генов вирулентности могли стать накопление мутаций в Avr генах рас-дифференциаторов в процессе их длительного поддержания в коллекции и более сложный состав R генов у растений-дифференциаторов, на которых эти расы изначально отбирались. Генотипирование по 12 микросателлитным локусам выявило заметные различия между расами-дифференциаторами и референтными изоля-тами из Западной Европы. Возможно, это связано с тем, что расы-дифференциаторы поддерживаются в коллекции с 1970-х годов и могут сильно отличаться от современных изолятов патогена. Вместе с тем микросател-литные профили рас-дифференциаторов не были связаны с профилями генов вирулентности/авирулентности.
Авторы благодарят Центр коллективного пользования научным оборудованием ВНИИ СБ «Биотехнология», в котором проводилось секвенирование Avr клонов и разделение SSR ампликонов капиллярным электрофорезом.
ЛИТЕРАТУРА
1. Fry W.E. Phytophthora infestans, the crop (and R gene) destroyer. Mol. Plant Pathol., 2008,
9(3): 385-402 (doi: 10.1111/j.1364-3703.2007.00465.x).
2. Haverkort A.J., Boonekamp P.M., Hutten R., Jacobsen E., Lotz A.P., Kessel G.J., Visser R.G., van der Vossen E.A. Societal costs of late blight in potato and prospects of durable resistance through cisgenic modification. Potato Res., 2008, 51(1): 4757 (doi: 10.1007/s11540-008-9089-y).
3. Haverkort A.J., Boonekamp P.M., Hutten R., Jacobsen E., Lotz L.A.P., Kessel G.J.T., Vossen J.H., Visser R.G.F. Durable late blight resistance in potato through dynamic varieties obtained by cisgenesis: Scientific and societal advances in the DuRPh project. Potato Res., 2016, 59(1): 35-66 (doi: 10.1007/s11540-015-9312-6).
4. Visser R.G.F., Bachem C.W.B., Borm T., de Boer J., van Eck H.J., Finkers R., van der Linden C., Maliepaard C.A., Uitdewilligen J.G.A.M.L., Voor-rips R., Vos P., Wolters A.M.A. Possibilities and challenges of the potato genome sequence. Potato Res., 2014, 57(3): 327-330 (doi: 10.1007/s11540-015-9282-8).
5. Gyetvai G., S 0 nderk « r M., G o bel U., Basekow R., Ballvora A., Imhoff M., Kersten B., Nielsen K.-L., Gebhardt C. The transcriptome of compatible and incompatible interactions of potato (Solanum tuberosum) with Phytophthora infestans revealed by DeepSAGE analysis. PLoS One, 2012, 7(2): e31526 (doi: 10.1371/journal.pone.0031526).
6. Jupe F., Witek K., Verweij W., Sliwka J., Pritchard L., Etherington G.J., Maclean D., Cock P.J., Leggett R.M., Bryan G.J., Cardle L., Hein I., Jones J.D.G. Resistance gene enrichment sequencing (RenSeq) enables reannotation of the NB-LRR gene family from sequenced plant genomes and rapid mapping of resistance loci in segregating populations. Plant J., 2013, 76(3): 530-544 (doi: 10.1111/tpj.12307).
7. Gao L., Tu Z.J., Millett B.P., Bradeen J.M. Insights into organ-specific pathogen defense responses in plants: RNA-seq analysis of potato tuber-Phytophthora infestans interactions. BMC Genomics, 2013, 14: 340 (doi: 10.1186/1471-2164-14-340).
8. Seidl M.F., Schneider A., Gover F., Snel B. A predicted functional gene network for the plant pathogen Phytophthora infestansas a framework for genomic biology. BMC Ge-nomics, 2013, 14(1): 483 (doi: 10.1186/1471-2164-14-483).
9. Vleeshouwers V.G.A.A., Raffaele S., Vossen J., Champouret N., Oliva R., Segretin M.E., Rietman H., Cano L.M., Lokossou A., Kessel G., Pel M.A., K a m o u n S. Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors. Annu. Rev. Phytopathol., 2011, 49: 507-531 (doi: 10.1146/annurev-phyto-072910-095326).
10. Rodewald J., Trognitz B. Solanum resistance genes against Phytophthora infestans and their corresponding avirulence genes. Mol. Plant Pathol., 2013, 14(7): 740-757 (doi: 10.1111/mpp.12036).
11. Vossen J.H., Jo K.R., Vosman B. Mining the genus Solanum for increasing disease resistance. In: Genomics of plant genetic resources /R. Tuberosa, A. Graner, E. Frison (eds.). Springer, Netherlands, Dordrecht, 2014: 27-46 (doi: 10.1007/978-94-007-7575-6_2).
12. F a w k e S., D o u m a n e M., Schornack S. Oomycete interactions with plants: infection strategies and resistance principles. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2015, 79(3): 263-280 (doi: 10.1128/MMBR.00010-15).
13. Mariette N., Mabon R., Corbiere R., Boulard F., Glais I., Marquer B., Pasco C., Montarry J., Andrivon D. Phenotypic and genotypic changes in French populations of Phytophthora infestans: are invasive clones the most aggressive? Plant Pathol., 2016, 65(4): 577-586 (doi: 10.1111/ppa.12441).
14. Li Y., Cooke D.E., Jacobsen E., van der Lee T. Efficient multiplex simple sequence repeat genotyping of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans. J. Microbiol. Meth., 2013, 92(3): 316-322 (doi: 10.1016/j.mimet.2012.11.021).
15. Halterman D., Guenthner J., Collinge S., Butler N., Douches D. Biotech potatoes in the 21st century: 20 years since the first biotech potato. Am. J. Potato Res., 2016, 93(1): 1-20 (doi: 10.1007/s12230-015-9485-1).
16. Hogenhout S.A., Van der Hoorn R.A., Terauchi R., Kamoun S. Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms. Mol. Plant-Microbe Interact., 2009, 22(2): 115-122 (doi: 10.1094/MPMI-22-2-0115).
17. Black W., Mastenbroek C., Mills W.R., Peterson L.C. A proposal for an international nomenclature of races of Phytophthora infestansand of genes controlling immunity in Solanum demissum derivatives. Euphytica, 1953, 2(3): 173-179 (doi: 10.1007/BF00053724).
18. Malcolmson J.F., Black W. New R genes in Solanum demissum Lindl. and their complementary races of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Euphytica, 1966, 15(2): 199-203 (doi: 10.1007/BF00022324).
19. Bradshaw J.E. Potato breeding at the Scottish Plant Breeding Station and the Scottish Crop Research Institute: 1920-2008. Potato Research, 2009, 52(2): 141-172 (doi: 10.1007/s11540-009-9126-5).
20. Bouwmeester K., van Poppel P., Govers F. Genome biology cracks enigmas of oomycete plant pathogens. In: Molecular aspects of plant disease resistance. UK, Oxford, Wiley-Blackwell, 2009, 102-134 (doi: 10.1111/b.9781405175326.2009.00005.x).
21. Win J., Chaparro-Garcia A., Belhaj K., Saunders D.G.O., Yoshida K., Dong S., Schornack S., Zipfel C., Robatzek S., Hogenhout S.A., Ka-
m o u n S. Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 2012, 77: 235-247 (doi: 10.1101/sqb.2012.77.015933).
22. Rietman H. Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel aviru-lence and potato resistance gene candidates revealed. PhD thesis. Wageningen, The Netherlands, Wageningen University, 2011. Режим доступа: http://library.wur.nl/WebQuery/wurpubs/406778. Дата обращения: 31.05.2016.
23. Pankin A., Kinash E., Rogozina E., Kozlovskaya I., Kuznetsova M., Khavkin E. Are simple Phytophthora infestans races that simple? In: PPO-Special Report no. 15 /H.T.A.M. Schepers (ed.). DLO Foundation, Wageningen, 2012: 205-211. Режим доступа: http://130.226.173.223/euroblight/Workshop/2011StPetersburg/Proceedings/Page205-212_ArtemPan-kin_web.pdf. Дата обращения: 31.05.2016.
24. Kim H.-J., Lee H.-R., Jo K.-R., Mortaz avian S.M.M., Huigen D.J., Ev-enhuis B., Kessel G., Visser R.G.F., Jacobsen E., Vossen J.H. Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes. Theor. Appl. Genet., 2012, 124(5): 923-935 (doi: 10.1007/s00122-011-1757-7).
25. Zhu S., Vossen J.H., Bergervoet M., Nijenhuis M., Kodde L., Kessel G.J.T., Vleeshouwers V., Visser R.G.F., Jacobsen E. An updated conventional-and a novel GM potato late blight R gene differential set for virulence monitoring of Phytophthora infestans. Euphytica, 2015, 202(2): 219-234 (doi: 10.1007/s10681-014-1276-0).
26. Cooke D., Cano L., Raffaele S., Bain R., Cooke L., Etherington G.J., Deahl K.L., Farrer R.A., Gilroy E.M., Goss E.M., Gr й nwald N.J., Hein I., MacLean D., McNicol J.W., Randall E., Oliva R.F., Pel M.A., Shaw D.S., Squires J.N., Taylor M.C., Vleeshouwers V.G., Birch P.R., Lees A.K., K a m o u n S. Genome analyses of an aggressive and invasive lineage of the Irish potato famine pathogen. PLoS Pathog., 2012, 8(10): e1002940 (doi: 10.1371/journal.ppat.1002940).
27. Champouret N., Bouwmeester K., Rietman H., van der Lee T., Maliepaard C., Heupink A., van de Vondervoort P.J.I., Jacobsen E., Visser R.G.F., van der Vossen E.A.G., Go vers F., Vleeshouwers V.G.A.A. Phytophthora infestans isolates lacking class 1 ipio variants are virulent on Rpi-blb1 potato. Mol. Plant-Microbe Interact., 2009, 22(12): 1535-1545 (doi: 10.1094/MPMI-22-12-1535).
28. Armstrong M.R., Whisson S.C., Pritchard L., Bos J.I.B., Venter E., Av-rova A.O., Rehmany A.P., B о hme U., Brooks K., Cherevach I., Hamlin N., White B., Fraser A., Lord A., Quail M.A., Churcher C., Hall N., Berri-man M., Huang S., Kamoun S., Beynon J.L., Birch P.R.J. An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognised in the host cytoplasm. PNAS USA, 2005, 102(21): 7766-7771 (doi: 10.1073/pnas.0500113102).
29. van Poppel P.M.J.A., Guo J., van de Vondervoort P.J.I., Jung M.W.M., Birch P.R.J., Whisson S.C., Go vers F. The Phytophthora infestans avirulence gene Avr4 encodes an RXLR-dEER effector. Mol. Plant-Microbe Interact., 2008, 21(11): 1460-1470 (doi: 10.1094/MPMI-21-11-1460).
30. Кузнецова М.А., Козловский Б.Е., Бекетова М.П., Соколова Е.А., Малюченко О.П., Алексеев Я.И., Рогозина Е.В., Хавкин Э.Е. Фитопато-логическая и молекулярная характеристика изолятов Phytophthora infestans, собранных с устойчивых и восприимчивых генотипов картофеля. Микология и фитопатология, 2016, 50(3): 175-184.
1 ФГБНУ Всероссийский НИИ Поступила в редакцию
сельскохозяйственной биотехнологии, 21 марта 2016 года
127550 Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42,
e-mail: katesokol83@mail.ru, seq@syntol.ru, jalex@iab.ac.ru, e-
mil.khavkin@gmail.com;
2ФГБНУ Всероссийский НИИ фитопатологии,
143050 Россия, Московская обл., пос. Большие Вяземы, ул. Институт, вл. 5,
e-mail: morozovela@mail.ru, ulanovatoma@mail.ru, kuznetsova@vniif.ru;
3ЗАО «Синтол»,
127550 Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42
Sel'skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2016, V. 51, № 3, pp. 376-384
MOLECULAR ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN DIFFERENTIATING Phytophthora infestans RACES
E.A. Sokolova1, E. V. Morozova2, T.I. Ulanova2, O.P. Malychenko1 3, Ya.I. Alekseev1 3,
M.A. Kuznetsova2, E.E. Khavkin1
1All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, Federal Agency of Scientific Organizations, 42,
ul. Timiryazevskaya, Moscow, 127550 Russia, e-mail katesokol83@mail.ru, seq@syntol.ru, jalex@iab.ac.ru,
emil.khavkin@gmail.com;
2All-Russian Research Institute of Phytopathology, Federal Agency of Scientific Organizations, 5, ul. Institute, pos. Bol'shie Vyazemy, Odintsovskii Region, Moscow Province, 143050 Russia, e-mail morozovela@mail.ru, ulanovatoma@mail.ru, kuznetsova@vniif.ru;
3Joint Stock Company Syntol, 42, ul. Timiryazevskaya, Moscow, 127550 Russia Acknowledgements:
The authors are grateful to the Center for Collective Use of Equipment «Biotechnology» (All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology) for sequencing Avrclones and separating SSR amplicons by capillary electrophoresis. Supported by the grants from Russian Foundation for Basic Research (projects 14-04-31613a and 16-04-00098) and the Ministry of Education and Science of the Russian Federation (project RFMEFI62114X0003). The phytopathologi-cal evaluation of Phytophthora infestansisolates was performed as part of the State Commission 0598-2015-0018. Received March 21, 2016 doi: 10.15389/agrobiology.2016.3.376eng
Abstract
Potato late blight caused by oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary is economically significant disease of worldwide importance. The traditional classification of specialized races of P. infestans is based on eleven resistance genes (R genes) introgressed from Solanum demissum to cultivated potato S. tuberosum. The selection of potato varieties, each comprising one of these R genes, is referred to as the Mastenbroek-Black set of differential plants. This set has been employed to establish the virulence genes (r genes) in isolates and strains of P. infestans, and collections of such individual strains have been maintained as tool sets of differential races for discerning R genes in cultivated and wild Solanum plants. While widely used in potato breeding for late blight resistance, these differential races have not been sufficiently explored by present-day molecular methods. We studied 11 differential races (1; 3; 4; 10; 11; 1.2; 1.3; 1.4; 1.2.3; 1.2.4; 1.2.3.4) maintained in the Institute of Phytopathology for over forty years and isolate 161 possessing all 11 genes of virulence. When the differential races of P. infestanswere genotyped with the standard set of 12 microsatellite (simple sequence repeat, SSR) loci, these races were distinct from reference A1 strains and highly aggressive lines lately dominant in the Western and Central Europe. SSR clusters of differential races did not match their rgene profiles. To assess the profiles of virulence genes in the differential races of P. infestans, we cloned three avirulence genes (Avr genes): ipiO = Avr-blb1, which recognizes the Rpi-blb1 = Rpi-sto1 gene of S. bulbocastanum and S. stoloniferum characterized by broad resistance to P. infestansraces, and also Avr3a and Avr4corresponding to R3a and R4of S. demissum. These Avr genes were found in all differential races under study, and each gene was represented by several alleles. The complex patterns of Avrgenes are in sharp contrast with the conventional concept of «simple» monogenic races. In the case of ipiO (NCBI GenBank accession numbers KP308170-KP308174, KF154431-KF154433 and KF154434-KF154439) race 1 was represented by the alleles of classes I and II, whereas races 3 and 4 comprised only the class I genes. None of three races contained the most virulent class III ipiO gene. The virulent allele Avr3a_EM was found in all investigated races, while the avirulent allele Avr3a_KI was discerned only in races 1, 3 and 1.2.3 (KF154421-KF154426, KF154430, KP317568, KP317572, KP317580-KP317584, KP317588, KP317589). The Avr4gene was cloned from differential races 1, 3, 1.4 and 11 (KF188215-KF188223). All these races contained the virulent allele, and race 11 comprised both avirulent and virulent alleles. The molecular and phytopathological evidence for Avr and r genes, respectively, matched only in 30 % of races. Probably, these discrepancies are due to the accumulation of mutations in the Avrgenes of differential races in the course of their long-term maintenance in the collection and more complex composition of R genes in plants which were initially to select the differentiating races.
Keywords: Phytophthora infestans, Avr genes, microsatellite (SSR) markers.
Научные собрания
МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ СИМПОЗИУМ «ГЕНЕТИКА И ГЕНОМИКА РАСТЕНИЙ ДЛЯ ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ»
(26-28 августа 2016 года, т. Новосибирск)
Основные задачи Симпозиума: определение вектора фундаментальных исследований в области генетики и геномики растений в контексте решения проблем продовольственной безопасности; обеспечение расширения контактов и развития совместных научных программ, в том числе междисциплинарных, между Российской Федерацией и странами Азии; обеспечение повышения активности участия молодых ученых России в этих международных программах; вклад в развитие дружественных партнерских отношений в области научного сотрудничества между РФ и странами Азии.
Будут рассмотрены вопросы генетики и геномики возделываемых растений, молекулярно-генетические и геномные подходы к управлению продуктивностью и технологическими свойствами, переход от повышенной химизации к новым биотехнологическим разработкам.
Контакты и информация: http://conf.bionet.nsc.ru/plant-food/?cat=1, info-vogis@bionet.nsc.ru
