CC BY
57
Молекулярные нарушения мембраны эритроцитов при сосудистых осложнениях сахарного диабета 1 типа
Е.Б. Кравец, Н.В. Рязанцева, Н.М. Яковлева,
В.Н. Бутусова, Р.Т. Тухватулин, Л.К. Новикова
ГОУ ВПО «Сибирский Государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
(ректор — акад. РАМН В.В. Новицкий), Томск |
Важнейшую медико-социальную проблему современной диабетологии представляет ранняя инвалидизация и летальность больных сахарным диабетом (СД) 1 типа, причиной которых чаще всего являются диабетические ангиопатии. Патогенез микрососудистых осложнений сопряжен с вовлечением в патологический процесс самой многочисленной клеточной популяции сосудистого русла -красных кровяных клеток. Эритроциты осуществляют не только присущую им специфическую газотранспортирующую функцию, но и принимают участие в регуляции реологических свойств крови [16].
Известно, что особенности молекулярной организации эритроцитарной мембраны определяют такие микрореологические свойства красных клеток крови, как деформируемость и агрегационная способность. В условиях хронической гипергликемии закономерно возникающая дезорганизация структуры мембраны эритроцитов приводит к утрате способности клеток регулировать ионный гомеостаз и окислительный метаболизм, а также к нарушению работы мембрансвя-занных энзимов, что в конечном итоге является причиной необратимых нарушений структурно-функционального статуса красных клеток крови [3,7,8,14,15]. Исходя их этого, исследование молекулярной организации мембраны эритроцитов, направленное на формирование новых представлений о функциональных нарушениях этих клеток при СД 1 типа, позволит разработать патогенетически обоснованные способы коррекции нарушений микрореологических свойств клеток крови, обеспечив тем самым поиск путей профилактики и лечения поздних сосудистых осложнений.
Целью настоящего исследования явилось определение роли нарушений структурно-функциональной организации мембраны эритроцитов в механизмах развития и прогрессирования сосудистых осложнений СД 1 типа.
Объект и методы исследований
В исследование было включено 88 пациентов с СД 1 типа (45 мужчин и 43 женщины) в возрасте от 18 до 55 лет с различными стадиями сосудистых осложнений. Первую группу обследованных составили 29 больных, имевших непролиферативную стадию диа-
бетической ретинопатии и/или диабетическую нефропатию в стадии микроальбуминурии; вторую группу — 38 пациентов с препролиферативной и пролиферативной стадиями диабетической ретинопатии и/или диабетической нефропатией в стадии протеи-нурии или хронической почечной недостаточности. В группу сравнения был включен 21 пациент с СД 1 типа без сосудистых осложнений. При оценке компенсации углеводного обмена учитывали гликемию натощак, постпрандиальную гликемию, уровень гликиро-ванного гемоглобина (НЬА1с). Данные показатели углеводного обмена проанализированы согласно «Национальным стандартам сахарного диабета» (Федеральная целевая программа «Сахарный диабет», 2002).
Контрольную группу составили 25 практически здоровых лиц (14 мужчин и 11 женщин) аналогичного возраста с нормальной толерантностью к глюкозе, без наследственной предрасположенности к СД и хронических очагов инфекции.
Все пациенты были обследованы на момент госпитализации на фоне проведения интенсифицированной инсулинотерапии (суточная доза инсулина составляла от 0,58 до 0,68 ЕД/кг массы тела). Из них 38 пациентов (43%) обследованы в динамике лечения (через 15 сут после проведения комплексной терапии) препаратами а-липоевой кислоты и сулодекси-дом: 20 пациентов получали лечение препаратами а-липоевой кислоты в дозе 600 мг/сут внутривенно ка-пельно; 18 больных — лечение по комбинированной схеме (а-липоевая кислота в дозе 600 мг/сут внутривенно капельно и сулодексид в дозе 600 липопроте-инлипазных единиц (LSU)^^ внутримышечно).
Материалом исследования являлась венозная кровь, стабилизированная гепарином (25 ЕД/мл). Мембраны эритроцитов выделяли путем гипоосмо-тического гемолиза [12]. В мембранной суспензии микробиуретовым методом определяли содержание белка. Проводили флюоресцентное зондирование мембран флюорофором пирен («Sigma»). Взаимодействие мембран с флюоресцентным зондом регистрировали на спектрофлюориметре «Hitachi-MPF-4». Микровязкость липидной фазы мембраны эритроцитов оценивали по степени эксимеризации пирена, мигрирующего в их гидрофобном компартменте, в среде следующего состава (ммоль): NaCl — 145, трис-
НС1 — 10 (pH 7,4) при длине волны возбуждающего света (Хв) 285 и 340 нм. Раствор пирена (растворитель — этанол) добавляли в кювету с мембранами краснык клеток крови (содержание белка — 0,3 мг/мл) до конечной концентрации 10 мкмоль, инкубировали в течение 10 мин при постоянном помешивании. Определяли степень эксимеризации пирена в области анулярных и общих липидов, выгаисляя отношение интенсивности флюоресценции эксиме-ров и димеров (1470/1370) при длине волны возбуждающего света (Хв) 285 и 340 нм соответственно [10], а также 1370/1390 при Хв=340 нм для оценки полярности окружения молекул пирена [2]. Рассчитывали показатель миграции энергии с триптофановык остатков на пирен по формуле, предложенной [1].
Активность №+,К+-АТФазы в мембране эритроцитов определяли методом [4] по нарастанию содержания неорганического фосфора (Р1) в инкубационной среде следующего состава (ммоль): №С1 — 125, КС1 -25, MgCl2 - 3, ЭДТА - 0,5, АТФ - 2, трис-НС1 - 50 (рН 7,4). Инкубацию проводили при 37°С в течение 1 ч. Реакцию останавливали добавлением 20% трихло-руксусной кислоты. Активность №+,К+-АТФазы рассчитывали как разницу между активностью АТФазы, измеренной в условиях, описанных выше, и активностью АТФазы, определенной в среде того же состава (но без №С1 ) в присутствии 125 ммоль КС1.
Определение показателей обратимой агрегации эритроцитов проводили фотометрическим способом, основанном на свойстве крови изменять свою оптическую плотность в зависимости от степени агрегиро-ванности эритроцитов [9]. Измеряя интенсивность
света, проходящего через пробу крови, с одновременной регистрацией величины механического воздействия, разрушающего агрегаты клеток, определяли показатели обратимой агрегации эритроцитов, характеризующие ио - минимальную механическую прочность агрегатов (В); и - максимальную механическую прочность агрегатов (В); т - полупериод спонтанной агрегации эритроцитов (с) и А - амплитуду фотометрического сигнала, характеризующего количество клеток, участвующих в процессе обратимой агрегации (мм). На основании измеренных показателей рассчитывали индекс агрегации ^а=и/т, усл.ед.), характеризующий соотношение агрегационных и дезаг-регационных процессов, а также коэффициент агрегации эритроцитов по формуле: К=ио'№А/т, усл.ед.
Достоверность различий показателей между сравниваемыми группами устанавливали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (и-тест), предварительно проверив гипотезу нормальности распределения (по критерию Колмогорова-Смирнова). Корреляционным анализ проводили по методу Спирмена. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.
Результаты и их обсуждение
Анализ клинико-лабораторных показателей об-следованнык больных СД 1 типа показал, что наибольший стаж заболевания (в среднем 16,9±1,1 лет) отмечался во второй клинической группе пациентов, имевших выраженные (II и III стадии) сосудистые
Таблица 1
Показатели обратимой агрегации эритроцитов у больных СД 1 типа (Х±т)
Показатели
Здоровые
Больные СД
обратимой агрегации эритроцитов доноры без сосудистых осложнений с I стадией диабетической ретинопатии и/или нефропатии со II и III стадиями диабетической ретинопатии и/или нефропатии
НЬ А1с,% НЬ А1с,%
7,0-7,5 >7,5 7,0-7,5 >7,5
п=15 п=11 п=8 п=9 п=8 п=12
ио, В13,50±0,57 11,96±0,54 12,00±0,79 17,50±1,36*+ 16,00±0,97 25,21±1,87*+ЛХ
и^ В 77,57±2,34 76,50±3,65 82,25±2,10 95,67±4,71*+ 96,88±4,97*+# 111,17±2,42*+лХ
А, мм 46,80±1,32 45,68±2,30 49,00±2,80 55,72±3,03*+ 53,44±2,57* 47,88±2,61
т, с 31,07±1,89 26,46±2,81 24,50±4,64 15,00±1,17*+ 15,25±1,37*+# 10,92±0,53*+ЛХ
Jа, усл. ед 2,58±0,13 3,14±0,32 4,04±0,56* 6,55±0,35*+# 6,51±0,30*+# 10,40±0,45*+ЛХ
К, усл.ед 1632,1±110,6 1711,6±213,0 2297,6±350,9+ 6313,97±551,2*+# 5568,1±487,0*+# 12146,0±900,65*+ЛХ
Примечание. Здесь и в табл. 2:
*р<0,05 по сравнению с показателями у здоровых доноров;
+р<0,05 по сравнению с показателями у больных СД 1 типа без сосудистых осложнений;
#р<0,05 по сравнению с показателями у больных СД 1 типа первой группы в фазе субкомпенсации углеводного обмена; Лр<0,05 по сравнению с показателями у больных СД 1 типа первой группы в фазе декомпенсации углеводного обмена; хр<0,05 по сравнению с показателями у больных СД 1 типа второй группы в фазе субкомпенсации углеводного обмена.
осложнения, по сравнению с больными первой группы и пациентами группы сравнения (р<0,001). Дебют заболевания во второй клинической группе наступал в более раннем возрасте, в среднем составив 15,7±1,6 года, по сравнению с пациентами, входящими в группу больных с начальными стадиями микроанги-опатий (р<0,01), и пациентами, не имевшими диабетических сосудистых осложнений (р<0,001). У обследованных больных второй клинической группы был установлен более высокий уровень НЬА1с — 10,2±
0,5% по сравнению со значениями в первой группе (р<0,05) и в группе сравнения (р<0,001).
Пациенты с сосудистыми осложнениями в зависимости от фазы компенсации СД 1 типа были разделены на 2 подгруппы. При этом у больных с I стадией диабетической ретинопатии и/или нефропатии, находившихся в фазе декомпенсации углеводного обмена, был меньше средний стаж заболевания (9,6±1,8 лет) по сравнению с таковым у больных с субкомпенсацией углеводного обмена (13,4±2,4 лет). У пациентов с II и III стадиями сосудистых осложнений в фазе декомпенсации средний стаж заболевания также оказался меньше (15,7±1,2 года), чем у обследованных в фазу субкомпенсации (18,5±1,8 лет). Полученные данные свидетельствовали о более быстром развитии сосудистых осложнений у больных с длительной декомпенсацией и неудовлетворительным самоконтролем за состоянием углеводного обмена.
У обследованных с СД 1 типа группы сравнения был выявлен наименьший стаж заболевания — от 2 до
4 лет. Все пациенты находились в фазе компенсации и субкомпенсации (уровень НЬА1с составлял 6,3±0,2%).
Ранее нами было установлено, что у больных СД 1 типа имеются нарушения поверхностной архитектоники эритроцитов [5], способствующие снижению деформируемости эритроцитов и нарушению функциональной способности красных кровяных клеток. Как показало исследование (табл. 1), наиболее выраженные изменения показателей обратимой агрегации эритроцитов были выявлены у больных СД 1 типа второй группы (со II и III стадиями сосудистых осложнений), находившихся в фазе декомпенсации углеводного обмена. Было обнаружено увеличение минимальной прочности агрегатов эритроцитов в 1,9 раза, максимальной прочности агрегатов эритроцитов — в 1,4 раза, индекса агрегации эритроцитов — в 4,0 раза, интегрального коэффициента агрегации — в 7,4 раза, а также уменьшение полупериода спонтанной агрегации в 2,9 раза по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе (р<0,001). Кроме того, выраженные нарушения обратимой агрегации красных кровяных клеток были выявлены у пациентов первой группы с декомпенсацией углеводного обмена и у больных второй группы, находившихся в фазе субкомпенсации. Усиление обратимой агрегации эритроцитов, являющихся самой многочисленной популяцией клеток крови, способствует нарушению кровотока и повреждению эндотелия кровеносных сосудов, что может явиться одним из патогенетических звеньев ми-крососудистых осложнений при СД 1 типа.
Таблица 2
Результаты исследования структурных свойств и активности №*,К*-АТФазы в мембране эритроцитов у больных СД типа 1 (Х±т)
Показатель Здоровые доноры Больные СД
без сосудистых осложнений с I стадией диабетической ретинопатии и/или нефропатии со II и III стадиями диабетической ретинопатии и/или нефропатии
НЬ А1с,% НЬ А1с,%
7,0-7,5 >7,5 7,0-7,5 >7,5
п II ю о п=19 п=14 п=11 п=16 п=21
Параметры флюоресценции, усл.ед. 1470/1370 (Хв=285 нм) 0,357±0,014 0,334±0,019 0,321±0,012 0,284±0,019* 0,256±0,012*+# 0,240±0,015*+Л
1470/1370 (Хв=340 нм) 0,431±0,015 0,399±0,018 0,372±0,018* 0,370±0,022* 0,328±0,011*+# 0,320±0,020*+л
1370/1390 (Хв=340 нм) 0,948±0,003 0,956±0,004 0,958±0,004* 0,962±0,004 0,965±0,004* 0,960±0,003*
Величина миграции энергии с триптофана на пирен,% 53,44±2,00 53,02±1,77 52,23±2,37 57,51±1,69 52,05±1,87 52,40±1,84
№*,К*-АТФаза мкмольй/ч^мгбелка 0,060±0,003 0,061±0,005 0,046±0,005+ 0,053±0,005 0,042±0,004*+ 0,040±0,002*+л
Известно, что гемореологические свойства красных кровяных клеток обусловлены прежде всего особенностями организации их клеточных мембран [11, 13]. Учитывая этот факт, мы провели исследование структурных свойств мембраны эритроцитов с использованием флюоресцентного зондирования. Степень эксимеризации неполярного зонда пирен, диффундирующего в гидрофобном компартменте мембраны, характеризует подвижность углеводородных цепей липидов, что позволяет использовать данный параметр для исследования микровязкостных свойств липидной фазы мембраны [2]. Кроме того, определение степени эксимеризации пирена при А,в=340 и Хв=285 нм дает возможность дифференцированно оценивать молекулярные особенности упорядоченности интегрального липидного бислоя и анулярной липидной фракции соответственно [1]. У больных СД 1 типа первой группы с субкомпенсацией углеводного обмена (табл. 2) было обнаружено статистически достоверное снижение средних значений І470/І370 при Хв=340 нм, что указывает на возрастание упорядоченности липидных молекул. У пациентов с СД 1 типа второй группы и у больных первой группы с декомпенсацией углеводного обмена было выявлено значительное снижение (по сравнению с подобными величинами у здоровых лиц) коэффициента эксимеризации пирена при длинах волн возбуждающего света 340 и 285 нм, что указывает на повышение микровязкости как суммарной липидной фазы, так и прибел-кового липидного окружения в мембране эритроцитов. Наиболее выраженное снижение средних значений степени эксимеризаци пирена (І470/І370) при Хв=285 и Хв=340 нм по сравнению с аналогичными показателями у здоровых лиц (р<0,05) отмечалось у больных второй группы, находившихся в фазе декомпенсации (на 33% и 26% соответственно). Увеличение микровязкости липидного матрикса мембраны может быть причиной нарушений латеральной диффузии белковых и липидных молекул, трансмембранного флип-флоп-переноса липидов [11].
Определение средних значений показателя І370/І390 (Хв=340 нм) при исследовании структуры мембраны эритроцитов у больных с сосудистыми осложнениями позволило выявить факт возрастания полярности микроокружения зонда в интегральной липидной фазе эритроцитарной мембраны, что может быть следствием повышения содержания полярных молекул воды в условиях интенсификации пе-рекисного окисления липидов [15]. У пациентов с СД 1 типа без сосудистых осложнений, определяемые параметры достоверно не отличались от таковых у здоровых доноров.
Дезорганизация липидной фазы мембраны эритроцитов может явиться причиной утраты способности клеток регулировать ионный и антиоксидант-ный гомеостаз, изменения конформации мембра-
нассоциированных транспортных белков [6]. Исходя из этих позиций, нами была проведена оценка активности ионтранспортирующего энзима плазматической мембраны эритроцитов — №+,К+-АТФазы, выявившая значительное ее угнетение у больных СД 1 типа, имевших диабетические микрососудистые осложнения (см. табл. 2), по сравнению с аналогичными показателями у лиц контрольной группы. При этом наиболее выраженное снижение активности энзима было обнаружено у пациентов второй клинической группы (в 1,5 раза по сравнению с показателями у здоровых доноров).
Проведенное нами исследование показало, что усиление процессов агрегации эритроцитов сопровождается изменениями структурно-функционального статуса их мембраны. Данное предположение подтверждается результатами корреляционного анализа между индексом и коэффициентом агрегации эритроцитов и показателями степени эксимеризации пирена (1470/1370 при Хв=340 нм и Хв=285 нм), а также значениями активности Ма+,К+-АТФазы (коэффициент Спирмена варьировал в пределах от -0,52 до -0,65, р<0,05).
Поскольку состояние мембраны эритроцитов определяет их микрореологические особенности, обнаруженные изменения молекулярной организации мембраны эритроцитарных клеток можно рассматривать в качестве патогенетического звена развития ми-кроангиопатий при СД 1 типа. В связи с этим нами проводилась коррекция реологических нарушений крови у пациентов с СД 1 типа, направленная в конечном итоге на замедление прогрессирования поздних осложнений. В качестве препаратов выбора выступали а-липоевая кислота, обладающая антиокси-дантной активностью, и сулодексид, содержащий гликозаминогликаны и являющийся низкомолекулярным гепарином. Было выявлено, что в условиях лечения препаратами а-липоевой кислоты возникала тенденция к восстановлению структурных свойств мембраны эритроцитов, о чем свидетельствовало увеличение средних значений степени эксимеризации флуорофора (1470/1370) при Хв=285 и А,в=340 нм по сравнению с их величинами до лечения (табл. 3). На фоне комбинированной терапии (а-липоевая кислота + сулодексид) отмечалось достоверно значимое повышение средних значений показателя 1470/1370 при Хв=285 и Хв=340 нм (по сравнению с аналогичными показателями до лечения, р<0,05), а также повышение активности №+,К+-АТФазы до пределов, статистически не отличавшихся от показателей у здоровых лиц. Таким образом, в условиях проводимой терапии отмечался очевидный мембраностабилизирующий эффект, что позволяет рассматривать приведенную схему лечения как патогенетически оправданную терапию, направленную на предупреждение развития поздних сосудистых нарушений.
6
13
Таблица 3
Динамика изменений показателей структурно-функционального статуса эритроцитов у больных СД 1 типа препаратами а-липоевой кислоты и сулодексидом (Х±т) на фоне лечения
Показатель Здоровые доноры n=20 Больные СД 1 типа
до лечения препаратами а-липоевой кислоты n=20 после лечения препаратами а-липоевой кислоты n=20 до лечения препаратами а-липоевой кислоты в сочетании с сулодексидом n=18 после лечения препаратами а-липоевой кислоты в сочетании с сулодексидом n=18
Параметры флюоресценции, усл.ед. 1470/1370 (Хв=285 нм) 1470/1370 (Хв=340 нм) 1370/1390 (Хв=340 нм) 0,357±0,014 0,431±0,015 0,948±0,003 0,279±0,013* 0,347±0,014* 0,966±0,003* 0,313±0,020* 0,373±0,016* 0,959±0,003* 0,272±0,016* 0,348±0,018* 0,963±0,003* 0,315±0,011*+ 0,384±0,011*+ 0,955±0,003
Величина миграции энергии с триптофана на пирен,% 53,44±2,00 54,53±1,60 51,94±1,44 51,42±1,97 52,41±1,72
№*К*-АТФаза, мкмольРУч^мг белка 0,060±0,003 0,042±0,004* 0,052±0,003 0,042±0,003* 0,055±0,002+
Показатель обратимой агрегации эритроцитов ио, В ш, В А, мм т, с Jа, усл. ед К, усл.ед 13,50±0,57 77,57±2,34 46,80±1,32 31,07±1,89 2,58±0,13 1632,1±110,6 18,38±1,69* 93,29±4,11* 48,83±2,42 16,08±2,05* 6,67±0,68* 6048,6±844,1* 15,42±1,07 88,50±3,25* 50,04±2,12 18,25±1,87* 5,37±0,50* 4183,3±506,5*+ 19,47±2,07* 103,83±3,94* 52,63±1,98* 16,53±2,78* 7,74±0,81* 8660,0±1376,6* 15,11±1,53 94,29±3,17* 52,75±2,06* 19,11±2,67* 5,71±0,50* 4553,1±599,63*+
*р<0,05 по сравнению с показателями у здоровых доноров; +р<0,05 по сравнению с показателями до лечения.
Выводы
1. Выраженность микрососудистых осложнений у больных СД 1 типа определяется стажем заболевания и уровнем компенсации углеводного обмена. Механизмы развития и прогрессирования сосудистых осложнений сопряжены с изменением микроре-ологических свойств эритроцитов.
2. Нарушения структурно-функциональных свойств мембраны красных клеток крови (возрастание микровязкости липидной фазы, угнетение активности ион-
транспортирующего энзима №+,К+-АТФазы) и изменения их агрегационных характеристик наиболее выражены у больных СД 1 типа с декомпенсацией углеводного обмена.
3. Использование в комплексном лечении больных СД 1 типа препаратов, обладающих мембраностабилизирующим эффектом, является патогенетически обоснованным.
4. В условиях комбинированной терапии а-липо-евой кислотой и сулодексидом наблюдалась стабилизация микрореологических свойств эритроцитов.
Литература
1. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследова- 9. нии биологических мембран. - М., 1980.
2. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мемб- 10 ран и липопротеидов. - М., 1989.
3. Кагава Я. Биомембраны. - М., 1985. 1 1
4. Казеннов А.М., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д.//Биохимия. - 1984. - 12
№7. - С.1089-1094.
5. Кравец Е.Б., Яковлева Н.М., Рязанцева Н.В.//Сахарный диабет. - 13
2005. - №1. - С.14-17. 14
6. Мацкевич Ю.А., Казеннов А.М., Маслова М.Н.//Эволюционная биохимия и физиология. - 1994 - № 4. - С. 497-504. 15
7. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Физиология и патофизиология эритроцита. - Томск, 2004. 16
8. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. и др. Атлас. Клинический патоморфоз эритроцита. - Томск, 2003.
Тухватулин Р.Т. Шуваева В.Н., Шадрина Н.Х., Левтов В.А.// Физиологический журнал СССР. - 1986. - Т. 72, №6. - С.775-784 Boldyrev A.A., Lopina O.D., Prokopjeva V.D. et al.//Biochem Int. -1984 - Vol. 8. - P. 851-859.
Catania A., Caimi G. //Minerva Med. - 1992 - Vol 83. - P. 187-192. Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan D.J. et al.//Arh. Biochem. Biophys. -1963 - Vol.100, № 1. - P.119-130.
Gimsa J. //Biophys. J. - 1998 - Vol. 75, № 1. - P. 568-569.
Heude B. // Amer. J. Clin. Nutrition. - 2003. - Vol. 77, № 4. - P. 803808.
Martin-Gallan P., Carrascosa A., Gussinye M., Dominguez C.//Free Rad. Biol. Med. -2003 - Vol. 34, № 12. - P. 1563-1574.
Reinhart W.H.//Schweiz. Med. Wochenchr. - 1995. - Vol. 125, № 9. P. 387-395.
