CC BY
101
Биотехнология растений
УДК 635.21:631.524: 582.281.144 DOI: 10.18384/2310-7189-2018-3-110-124
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МОНИТОРИНГА ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИТОФТОРОЗА КАРТОФЕЛЯ PHYTOPHTHORA INFESTANS
Соколова ЕА.1, Кузнецова МА.2, Рогожин АН.2, Демидова В.Н.2, Уланова ТИ.2, Сметанина ТИ.2, Рогозина ЕВ.3, Хавкин Э.Е.1
1 Всероссийский институт сельскохозяйственной биотехнологии 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 42, Российская Федерация
2 Всероссийский институт фитопатологии
143050, Московская обл., Одинцовский р-н, р.п. Большие Вяземы, ул. Институт, вл. 5, Российская Федерация
3 Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР)
190000, Санкт-Петербург, ул. Б. Морская, 42-44, Российская Федерация
Аннотация. Фитофтороз (возбудитель - оомицет Phytophthora infestans Mont. de Bary) остается первостепенной экономической проблемой производства картофеля. Молекулярный скрининг генов (а)вирулентности патогена (Avr генов) и генов устойчивости растений к P. infestans (Rpi генов) позволяет предсказать изменения в составе популяции патогена и предположить, какие сорта картофеля пострадают в первую очередь. Для оценки разнообразия изолятов, которое определяется миграцией патогена, мы сравнили генотипы в изолятах P. infestans, собранных в 2013-2015 гг. в коллекционных посадках межвидовых гибридов картофеля в Пушкинских лабораториях ВИР и в коммерческих посадках картофеля в нескольких регионах России. Присутствие двух типов спаривания, А1 и А2, также способствует увеличению разнообразия за счет половой рекомбинации. Молекулярные методы были использованы для генотипирования образцов патогена и определения типа спаривания и состава Avr генов. Результаты молекулярных исследований сопоставили с такими фенотипическими характеристиками, как тип спаривания, устойчивость к металаксилу, состав факторов вирулентности, выявляемых с помощью растений-дифференциаторов, и агрессивность в тесте с клубнями картофеля.
Ключевые слова: Phytophthora infestans, фитофтороз картофеля, SSR генотипирование, A1/A2 тип спаривания, факторы вирулентности, Avr гены вирулентности P. infestans, Rpi гены устойчивости к P. infestans.
© CC BY Соколова Е.А., Кузнецова М.А., Рогожин А.Н., Демидова В.Н., Уланова Т.И., Сметанина Т.И., Рогозина Е.В., Хавкин Э.Е., 2018.
MOLECULAR METHODS OF RESEARCH AND MONITORING OF LATE BLIGHT PATHOGEN PHYTOPHTHORA INFESTANS
E. Sokolova1, M. Kuznetsova2, A. Rogozhin2, V. Demidova2, T. Ulanova2, T. Smetanina2, E. Rogozina3, E. Khavkin1
1 All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechmology ul. Timiryazevskaya, 42, Moscow, 127550, Russian Federation
2 All-Russian Research Institute of Phytopathology
ul. Institut, vl. 5, r.p. Bol'shie Vyazemy, Odintsovskii r-n, Moscow region, 143050, Russia
3 Federal Research Center the N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources (VIR), ul. Bol'shaya Morskaya, 42-44, St. Petersburg, 190000, Russia Federation
Abstract. The oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, the casual agent of the late blight, still remains the main cause resulting in economic problems for potato growers. Molecular screening of (a)virulence genes of the pathogen (Avr genes) and plant genes for resistance to P. infestans (Rpi genes) would help monitor the changes in the pathogen populations and predict the most vulnerable potato varieties. To assess variation in isolates due to pathogen migration, we compared P. infestans genotypes in the isolates sampled in 2013-2015 in the Pushkin collection of interspecific hybrids (St. Petersburg) and in the commercial potato stands in several regions of Russia. The presence of two mating types, A1 and A2, also promotes pathogen variation due to sexual recombination. Molecular methods were employed for geno-typing pathogen samples and assessing their mating type and Avr gene profiles. These molecular indices were related to such phenotypic characteristics as mating type, metalaxyl resistance, virulence factors tested with the differential plants and aggressiveness in the potato tuber test.
Key words: Phytophthora infestans, potato late blight, SSR genotyping, A1/A2 mating types, virulence factors, Avr avirulence genes of P. infestans, Rpi genes for resistance to P. infestans.
Введение
Фитофтороз, возбудителем которого является оомицет Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, является наиболее серьезной агрономической и экономической проблемой картофелеводства. В результате эволюции и миграции патогена его популяции обнаруживают значительный фенотипи-ческий полиморфизм, который резко возрастает при половом размножении. В последние годы проблема фитофто-роза обострилась в связи с появлением агрессивных рекомбинантных генотипов P. infestans (13_A2 и др.), поражающих те сорта картофеля, которые до этого времени считались устойчивы-
ми. Особенностью P. infestans является поразительная скорость эволюции генов вирулентности (avirulence genes, Avr гены), расположенных в тех областях генома, которые бедны housekeeping генами, но богаты мобильными элементами. Avr гены кодируют белки-эффекторы, которые и являются агентами патогенеза. Отбор Avr генов в популяции P. infestans также тесно связан с составом генов устойчивости к P. infestans (Rpi генов) в колонизуемой популяции растений. Rpi гены эволюционируют за счет дупликации и рекомбинации, однако много медленнее, чем Avr гены. В результате создание новых коммерческих сортов
картофеля отстает от появления новых патотипов Р. infestans, которые быстро «преодолевают» устойчивость этих сортов, вызывая эпидемии фитофтороза [9; 10; 11].
Быстрые изменения расового состава популяций Р. infestans делают особенно важным надежный мониторинг посадок картофеля. Молекулярные методы характеристики патогена позволят сделать этот мониторинг более оперативным. Обязательным элементом разработки технологии молекулярного мониторинга патогена является валидация используемых приемов путем сопоставления молекулярных и традиционных фитопатоло-гических методов.
В этом сообщении приведены результаты такого сопоставления на материале изолятов Р. infestans, собранных в 2013-2015 гг. в полевой коллекции ВИР (Пушкин, С. Петербург) и в различных регионах России.
Условия, материалы и методы
Листья, пораженные фитофторо-зом, собирали в 2013-2015 гг. с сортов и межвидовых гибридов картофеля, растущих в полевой коллекции ВИР (Пушкин, С. Петербург), и в коммерческих посадках картофеля в нескольких регионах России. В работе было проанализировано 19 изолятов, 18 моно-зооспоровых линий из Пушкина и 16 изолятов из регионов. Листья с некротическими пятнами помещали между срезами клубней соответствующих генотипов картофеля и в таком виде перевозили в Институт фитопатологии. Далее, кусочки зараженных листьев помещали между стерилизованными ломтиками клубней восприимчивого сорта картофеля сорта Вт^'е, свобод-
ного от известных Rpi генов, и инкубировали 3-4 дня при 18-20 °C. Фрагменты проросшего сквозь ломтики мицелия помещали на агаризованную овсяную среду. Чистые культуры сохраняли при 5 °C и один раз в месяц пересевали на ту же среду. Поскольку на одном растении могут поселяться два и более штамма патогена, из изо-лятов, собранных с индивидуальных растений в пушкинской коллекции в 2015 г., были выделены монозооспоро-вые линии. Более подробное описание микробиологических методов изолирования генотипов P. infestans можно найти в публикациях [1; 17].
Вирулентность изолятов и линий P. infestans определяли на отделенных долях листьев среднего яруса растений [18], используя набор растений-дифференциаторов из Международного Картофельного Центра (CIP, Lima, Peru), распознающий 22 патотипа Р. infestans (гены вирулентности r, Rn и их различные сочетания). Чтобы сгруппировать изоляты и линии Р. infestans по этому признаку методом филогенетического анализа, мы использовали алгоритм Neighbor Joining и пакет программы Statistica 8.
При определении типа совместимости изоляты и линии P. infestans высевали в чашки Петри на ржано-овощ-ной агар на расстоянии 4-5 см друг от друга попарно с тестерными штаммами: 2К и 48К (соответственно, А1 и А2 тип спаривания). После инкубации в течение 14 дней в темноте при 18 °С с помощью светового микроскопа определяли наличие или отсутствие ооспор в месте контакта гиф, принадлежащих А1 или А2 типу. В том случае, когда исследуемый штамм образовывал ооспо-ры с обоими тестерами, этот штамм
V11V
учитывали как А1А2; если ооспоры появлялись в монокультуре, штамм считали самофертильным.
Для изучения устойчивости изоля-тов и линий P. infestans к металаксилу в чашки Петри на бумажные фильтры, смоченные дистиллированной водой (контроль) или фунгицидом в концентрации 1, 10 и 100 мг/л, помещали по 10 дисков (3x10 мм) из клубней картофеля сорта Santé. На каждый диск наносили каплю (10 мкл) суспензии зооспоран-гиев тестируемого изолята или линии. После инкубации в темноте при 1820 °C в течение 6-7 дней регистрировали спороношение. Изолят или линию считали чувствительным(ой) к мета-лаксилу (susceptible, S), если спороно-шение было полностью подавлено при концентрации фунгицида 1 мг/л, слабоустойчивым (intermediately resistant, IR), если спороношение происходило при 1-10 мг/л, но отсутствовало\ при 100 мг/л, и устойчивым (resistant, R), если споры появлялись даже при концентрации 100 мг/л.
Уровень агрессивности линий P. in-festans определяли в тесте с клубнями картофеля, как описано ранее [1].
Геномную ДНК выделяли из мицелия P. infestans с помощью набора Axy-Prep Multisource Genomic DNA Mini-prep Kit (Axygen Biosciences, США). Концентрацию ДНК определяли с помощью UV/Vis NanoPhotometer P300 (IMPLEN, Германия). Амплификацию ДНК проводили в термоциклере MJ PTC-200 (Bio-Rad, США). Для определения типа спаривания использовали CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) маркер W16 [13]. Генотипи-рование изолятов и линий P. infestans проводили методом SSR (simple sequence repeats) по 12 локусам [15]. Гены
авирулентности Avr2 [12], Avr3a [4], Avr4 [19] и Avr-blb1 = ipiO [7] амплифи-цировали в соответствии с протоколами указанных выше авторов, амплико-ны очищали c помощью QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия), клонировали с использованием pGEM-T Easy Vector System I (Promega, США) и секвенировали на анализаторе нуклеиновых кислот ABI PRISM 3130xl или Нанофоре 05. Все ПЦР праймеры были синтезированы ЗАО Синтол (Москва). Секвенирование фрагментов ДНК проводили в Центре коллективного использования оборудования ВНИ-ИСБ «Биотехнология».
Результаты и обсуждение
Генотипы P. infestans. SSR профили изолятов и линий патогена, обнаруженных на растениях картофеля в коллекции ВИР в Пушкине и в коммерческих посадках картофеля [17], обнаруживают географические различия и значительные изменения по годам (рис. 1). В целом по всей проанализированной за три года выборке изолятов P. infestans мы обнаружили от 34 до 40 аллелей в 12 SSR локусах, от 2 до 6 аллелей на локус. Локусы D13, G11, Pi63, Pi02/SSR3, SSR4, SSR6 и SSR11 оказались наиболее полиморфными (табл. 1). Сравнение наших результатов с данными других исследователей [8; 9] свидетельствует о заметных различиях SSR профилей генотипов P. infestans, выявленных на европейской территории России и в Западной и Центральной Европе. Уже на этом этапе исследования мы выделили характерные аллели, прежде всего в наиболее полиморфных ло-кусах D13, G11, Pi63, Pi02/SSR3, SSR4, SSR6 и SSR11, по которым различают-
\mj
ся две географически удаленные группы генотипов P infestans; эти аллели выделены в табл. 1 полужирным шрифтом. Вероятно, эти аллели станут надежными дескрипторами, на основе которых будет создана классификации изолятов, необходимая для мониторинга распространения
патогена на европейской территории нашей страны.
88И профили изолятов из пушкинской коллекции заметно изменились с 2013-2015 гг. (табл. 1, рис. 1); эти изо-ляты отличались от тех, которые были
собраны в коммерческих посадках картофеля за пределами пушкинской коллекции. Изоляты, собранные с различных гибридов картофеля и в разные годы, значительно различались. Различия между генотипами P infes-tans, колонизующими пушкинскую коллекцию и коммерческие посадки картофеля, можно объяснить влиянием завозного семенного материала во втором случае. Существенные изменения состава популяции P infestans в пушкинской коллекции, возможно, указывают на миграцию патогена.
Tree Diagram for ВО Variables
Kiriljli; I ink^llft!
Euclidean distances
179 78 77 7® 74 74 7J72 717t W WM *7ti 4-1 41W J» 33 37 34 03 3-13J 32 Si DP IV 4IS 47 46 4S 44 41 10 4J К 39 JO JE JT Л if Ji J2i\tQ29 ZSZ7Z9 ¿3 it JJ JU IT If 10 Ü 1? lJ 11 11 S WU12 »0237
I___J_
t lL
6_А1 13_А2
Изоляты, собранные в коммерческих посадках картофеля
Линии стандарты
Пушкинские изоляты 2014
Пушкинские изоляты 2013
Пушкинские монозооспоровые линии 2015
89
100
EC 1 US
US-1
A1 линии
Рис. 1. Филогенетический анализ изолятов P. infestans, собранных в Пушкине и в коммерческих посадках в европейской части России, и линий из Западной Европы и США, использованных в качестве стандартов. Дендрограмма построена методом Neighbor Joining; указаны значения бутстрепа для 1000 повторений, превышающие 0.70. 1-13 - монозооспоровые линии из Пушкина (2015 г.), 14-23 - изоляты из Пушкина (2013 г.); 24-30, 33-38 - изоляты из Пушкина (2014 г.); 39 - стандарт N161; 31, 32, 40-55 - изоляты, собранные в коммерческих посадках картофеля; 56-80 - линии P infestans из Западной Европы и США [15], в том числе стандарты: 64 - US1_A1; 73 - US8_A2; 74 - EC1_A1.
Тип спаривания и устойчивость к металаксилу. Показатели типа спаривания при фенотипическом анализе и с помощью CAPS маркера W16 совпадали в 90% случаев (табл. 2). Можно
со всей определенностью утверждать, что молекулярный метод определения типа спаривания надежен и позволяет получить результаты намного быстрее и с меньшими затратами труда,
V11V
чем традиционный фитопатологиче- ный полиморфизм маркера по-ский метод. Более того, как показало зволяет дифференцировать патотипы недавнее исследование [6], аллель- P infestans.
Таблица 1
Изменения частот аллелей наиболее вариабельных SSR локусов у изолятов, собранных в Европейской части России
Посадки картофеля в Пушкине (ВИР) Коммерческие посадки
SSR локусы 2013 г. 2014 г. 2015 г. картофеля, 2014-2015 гг.
Аллели, в скобках - их частоты
SSR11 331 (0.15) 341 (0.73) 331 (0.12) 331 (0.11)
341 (0.55) 355 (0.27) 341 (0.40) 341 (0.55)
355 (0.30) 355 (0.48) 355 (0.33)
D13 118 (0.65) null (0.52) 118 (0.28) 136 (0.76)
136 (0.05) 118 (0.074) 134 (0.65) 138 (0.054)
138 (0.10) 134 (0.11) 136 (0.04) 140 (0.03)
140 (0.15) 136 (0.15) 154 (0.03) 142 (0.054)
154 (0.05) 152 (0.074) 152 (0.054)
154 (0.074) 154 (0.054)
G11 154 (0.10) null (0.07) null (0.14) null (0.06)
156 (0.05) 154 (0.29) 154 (0.17) 142 (0.08)
162 (0.20) 156 (0.29) 156 (0.29) 154 (0.36)
168 (0.65) 160 (0.07) 160 (0.33) 156 (0.11)
162 (0.21) 162 (0.05) 160 (0.11)
168 (0.07) 164 (0.02) 162 (0.25)
164 (0.03)
Pi63 270 (0.15) 270 (0.27) 270 (0.1) 270 (0.32)
273 (0.05) 273 (0.23) 273 (0.35) 273 (0.19)
276 (0.30) 279 (0.50) 279 (0.55) 276 (0.03)
279 (0.50) 279 (0.46)
Pi02/ 258 (0.30) 258 (0.23) 258 (0.07) 258 (0.17)
SSR3 266 (0.05) 266 (0.15) 268 (0.93) 268 (0.83)
268 (0.60) 268 (0.62)
270 (0.05)
SSR4 284 (0.40) 284 (0.30) 284 (0.38) 284 (0.28)
288 (0.05) 288 (0.21) 288 (0.29) 288 (0.28)
290 (0.40) 290 (0.15) 290 (0.17) 292 (0.14)
292 (0.05) 292 (0.04) 292 (0.06) 294 (0.28)
294 (0.14) 294 (0.30) 297 (0.03) 297 (0.03)
299 (0.07)
SSR6 240 (0.30) 240 (0.15) 242 (0.48) 240 (0.06)
242 (0.20) 242 (0.50) 244 (0.52) 242 (0.47)
244 (0.50) 244 (0.35) 244 (0.47)
Viisy
Характерно, что в 2013 г. 60-70% изолированных в Пушкине генотипов принадлежали к А2 типу спаривания, а в 2014-2015 гг. доля А2 генотипов сни-
жалась до 30-40%. Тип А1 преобладал и в изолятах, собранных в коммерческих посадках картофеля.
Таблица 2
Определение типа спаривания у изолятов Р. infestans фитопатологическим (Ф) и молекулярным (М) методами анализа (2013-2015 гг.)
Изоляты* Ф М Изоляты Ф М Изоляты Ф М Изоляты Ф М Изоляты Ф М
2-13 А2 A2 7-14 А1 A1 Лен. 17-14 А1 A1 Астр. 64-14 А1 A1 Яр. 69-15 А1 A1
4-13 А1 A1 36-14 A2 A2 Лен. 22-14 А1 A1 Астр. 65-14 А1 A1 Сверд. 72-15 А1 A1
111-13 А1А2 А2 43-14 A2 A2 Лен. 23-14 А1 A1 Тул. 71-14 А2 A2 Сверд. 81-15 А2 A2
7-13 А2 A2 82-14 А1 A1 Лен. 24-14 А1 A1 Тул.72-14 А2 A2 Чув. 8715 А1 A1
106-13 А1 A1 109-14 А1 A1 Лен. 28-14 А1А2 A2 Моск. 29-15 А1 A1 Чув. 98-15 А2 A2
132-13 А1А2 А2 119-14 А1 A1 Лен. 32-14 А1 A1 Моск. 51-15 А1 A1
113-13 А1А2 А2 132-14 А2 A1 Астр. 44-14 А1А2 A2 Моск. 56-15 А2 A1
131-13 А1 A1 28-14 А1 A2 Астр. 45-14 А1А2 A2 Моск. 59-15 А1А2 A1
87-13 А2 A2 Астр. 60-14 А1 A1 Яр. 65-15 А2 A2
"протокол описан подробнее ранее [1]; в нумерации изолятов второе число обозначает год отбора проб.
Примечание: Астр. - Астраханская обл.; Лен. - Ленинградская обл.; Моск. - Московская обл. ВНИИФ; Сверд. - Свердловская обл.; Тул. - Тульская обл.; Чув. - Чувашия. Яр. - Ярославская обл. Все остальные изоляты собраны в Пушкинской коллекции ВИР.
Металаксилустойчивые изоляты встречались довольно редко и были обнаружены только в Ленинградской и Свердловской областях (табл. 3).
Состав генов вирулентности. Расы (патотипы) P. infestans традиционно определяют по составу генов вирулентности, выявляемых с помощью набора растений-дифференциаторов, несущих гены устойчивости к фитоф-торозу, интрогрессированные из дикорастущего вида Solanum demissum [5; 16]. При филогенетическом анализе по числу и составу генов вирулентности наша выборка изолятов и линий
распалась на три больших кластера (табл. 3). В первый кластер попали формы с наименьшим средним количеством генов на изолят. Среди них выделяется субкластер 1а - патотип, лишенный генов вирулентности 1, 2 и 4, которые распространены среди других изолятов. В субкластер 1Ь вошли остальные изоляты и линии с небольшим числом генов вирулентности. Во второй кластер объединили патотипы с 6-9 генами, среди которых отсутствовал ген вирулентности 8. В третий кластер попали патотипы с 6-11 генами вирулентности, среди которых обя-
зательно присутствует ген 8. У изоля-тов 2013 г. и монозооспоровых линий, выделенных из изолятов, собранных в 2015 г., преобладали гены вирулентности, относящиеся к кластеру 3. У пушкинских изолятов 2014 г. и изолятов, выделенных в коммерческих посадках картофеля, мы находим гены, характерные для кластера 2.
Эти данные еще раз свидетельствуют о том, что миграция патогена является важным фактором формирования популяций P infestans. Если географически отдаленные изоляты не слишком различаются по 88И локу-сам и генам вирулентности, то можно заключить, что распространение рас с зараженным семенным картофелем определяет основные различия между изолятами, собранными в пушкинских и коммерческих посадках картофеля.
Профили луг генов. Мы провели анализ изолятов Р. infestans по четырем генам авирулентности луг2, АугЗа, луг4 и Луг-ЫЬ1 = ipiO. К настоящему моменту наиболее подробно исследованы два аллеля гена Луг2 в изолятах и линиях из Пушкина и коммерческих посадках картофеля. В 2013 г. доминантный аллель Луг2 присутствовал менее чем у половины образцов. В 2014-15 гг. оба гомолога гена луг2 были обнаружены примерно у 40% всех исследованных изолятов, один ЛУЯ2 был обнаружен у 30% и один ЛУЯ2-Ике - у 20-40% образцов. Сходные соотношения аллелей описаны в работе Gilroy и др. [12]. Следует отметить, что соответствующий ЛУЯ2-Нке ген вирулентности 2, выявленный с помощью фитопатологи-ческих методов, распространен очень широко и присутствует у 75-90% исследованных образцов Р. infestans.
Соответствие между Луг генами, охарактеризованными по нуклеотид-ной последовательности, и генами вирулентности, выявленными с помощью растений-дифференциаторов, исследовано совершенно недостаточно. В нашем случае аллельный состав четырех исследованных нами Луг генов мало соответствовал составу одноименных генов вирулентности, определяемых с растениями-дифференциаторами (см. табл. 3). В качестве причин такого рассогласования можно указать тот факт, что исследованные нами Луг гены соответствуют лишь небольшой части известных сейчас 11 генов вирулентности [20; 21]. С другой стороны, часть растений-дифференциаторов содержит более одного гена устойчивости [14]. Вдобавок использованный набор дифференциаторов не содержал генов устойчивости, характерных для видов, иных, чем 5. demissum, например, Яр^ЫЬ1, который распознает Луг ген ipiO I, II [20]. Между тем несколько таких генов присутствуют в гибридах картофеля, с которых собирали изоля-ты Р infestans [2]. Поэтому в дальнейшем необходимо расширить спектр клонируемых Луг генов и определить их функциональную активность.
Наши фитопатологические наблюдения не выявили связи между профилями генов вирулентности изолятов и их агрессивностью в тесте с клубнями картофеля [1].
Заключение
Наши исследования показали, что обнаруженные в Западной и Центральной Европе высокоагрессивные штаммы Р. infestans отсутствовали в 2013-2015 гг. в посадках картофеля в Европейской части нашей страны. Метод
V117J
Таблица 3
Фитопатологическая и молекулярная характеристика изолятов и монозооспоровых линий P. infestans
Кластер1 Изоляты и монозооспоровые линии Устойчивость к металаксилу2 3 н е 1 Гены вирулентности Агрессивность 4
Изоляты, собранные в Пушкине в 2013 г.
2 2-13 Ч AVR2KN/avr2TV/MI 12341011 н.д.
1b 4-13 Ч AVR2K 234810 СА
3 111-13 Ч avr2TV/MI 12347891011 н.д.
2 7-13 Ч avr2TV/MI 124561011 н.д.
3 106-13 СУ AVR2K/avr2TV/MI 12345781011 УА
2 132-13 Ч avr2TV/MI 12341011 УА
3 113-13 СУ avr2TV/MI 1234567891011 НА
1a 131-13 СУ AVR2K /avr2MI IpiO I,II avr3aEM, avr1 356781011 СА
3 87-13 СУ avr2TV/MI, IpiO I,II; avrSm1(avr9) 1234567891011 УА
Изоляты, собранные в Пушкине в 2014 г.
2 7-14 Ч AVR2KN/avr2TV/MI 124561011 УА
2 53-14 Ч avr2TV/MI, IpiO I,II AvrSm1(Avr9) 125671011 УА
2 36-14 Ч AVR2/avr2 12345671011 УА
1b 43-14 Ч AVR2/avr2 12367 СА
2 82-14 Ч avr2TV/MI 12345671011 ВА
2 109-14 Ч avr2TV/MI 12345671011 УА
2 119-14 Ч avr2TV/MI 12345671011 УА
2 132-14 Ч AVR2K /avr2MI 12341011 УА
3 28-14 Ч AVR2K /avr2MI 1234567891011 ВА
3 Стандарт N161 Ч AVR2K /avr2MI; avr1; avr3a-EM; Pex-147-2; IpiOI,II; avrSm1(avr9). 1234567891011 УА
Монозооспоровые линии из изолятов, собранных в Пушкине в 2015 г.
3 18/1-1 - 18/1-5 Ч AVR2K/avr2 MI 1234567891011 СА-ВА
3 42/2-1 - 42/2-5 Ч AVR2K 12347891011 УА
3 42/3-1; 42/3-2 Ч AVR2K/avr2TV/MI 12347891011 УА-ВА
3 43/1-1 - 43/1-3 Ч AVR2K/avr2MI 12347891011 СА
3 53/1-1 Ч AVR2K/avr2MI 12345678911 УА
3 53/1-2 - 53/1-5 1234567891011 СА-ВА
1b 87/2-2 Ч AVR2K/avr2TV/MI avr3a EM, avr4 12378 УА
3 103-1 - 103-4 Ч AVR2K/avr2MI avr3a EM, avr4, IpiO 123467891011 СА-УА
3 107-1 Ч AVR2K 123478910 СА
3 107-2 12347891011 НА
2 117/2-1- 117/2-2 Ч -СУ AVR2K 12345791011 СА-УА
2 117/2-3 Ч 1235791011 СА
1b 109/1-1 Ч avr2MI, avr3a EM, avr4 123578 УА
2 109/1-2 12345791011 СА
3 120-1 - 120-5. Ч AVR2K 12347891011 СА-ВА
н.д. 11/1-1 - 11/1-5. Ч avr2TV/MI н.д. СА
3 11/2-1 Ч avr2TV/MI 134781011
3 11/2-2 1234781011
Изоляты из коммерческих посадок в регионах России
3 Лен. 17-14 У AVR2 34781011 н.д.
2 Лен. 28-14 Ч AVR2/avr2 125671011 н.д.
2 Лен. 32-14 Ч AVR2 12345671011 н.д.
1b Астр. 44-14 У AVR2/avr2 34711 н.д.
2 Астр. 45-14 У AVR2/avr2 34671011 н.д.
2 Тул. 71-14 У avr2 1245671011 н.д.
2 Тул. 72-14 СУ avr2 12345671011 н.д.
1b Моск. 29-15 Ч AVR2/avr2 12346 н.д.
3 Моск. 51-15 Ч AVR2/avr2 123467810 н.д.
2 Моск. 56-15 Ч avr2 12345671011 н.д.
2 Моск. 59-15 Ч AVR2 12345671011 н.д.
1a Яр. 65-15 Ч AVR2/avr2 31011 н.д.
1b Яр. 69-15 Ч avr2 2671011 н.д.
2 Сверд. 72-15 У avr2 1234671011 н.д.
1b Сверд. 81-15 У AVR2 234511 н.д.
3 Чув. 87-15 Ч AVR2/avr2 1234781011 н.д.
1Кластеры патотипов на основе генов вирулентности. 2Ч - чувствительный, СУ - слабоустойчивый, У - устойчивый. 3Аминокислотный полиморфизм в АУЕ2/ауг2 [3, 12]. 4Уровень агрессивности изолятов Р. infestans: НА - неагрессивный (расчетные потери урожая менее 5%); СА - слабоагрессивный (расчетные потери урожая от 5 до 15%); УА - умеренно агрессивный (расчетные потери урожая от 16 до 35%); ВА - высокоагрессивный (расчетные потери урожая более 35%) [1]; н.д. - нет данных.
KYV^J
88И генотипирования обладает достаточной разрешающей способностью, хорошо различает штаммы патогена и выявляет их изменения по территории и годам наблюдений. Однако для целей мониторинга необходимо создать общепринятую классификацию восточноевропейских штаммов P infestans по 12 88И локусам, выделив ключевые дескрипторы/дискриминанты.
Молекулярный метод определения типа спаривания надежен и позволяет получить результаты намного быстрее и с меньшими затратами труда и средств, чем традиционный фитопато-логический метод.
К настоящему времени нам не удалось установить соответствие между генами вирулентности, выявленными с
помощью растений-дифференциаторов, и Avr генами. Скорее всего, дело в том, что исследованные нами Avr гены соответствуют лишь части генов вирулентности [20], в свою очередь, набор дифференциаторов неполон: он не распознает Avr гены патогена, соответствующие нескольким важнейшим Rpi генам, интро-грессированным в исследованные нами гибриды из 5. stoloniferum и других недостаточно изученных дикорастущих сородичей картофеля [2]. Фитопатоло-гические наблюдения не выявили связи между спектром генов вирулентности изолятов и их агрессивностью. Эта проблема требует дальнейших углубленных исследований [22].
Статья поступила в редакцию 23.05.2018
ЛИТЕРАТУРА
1. Кузнецова М. А., Козловский Б. Е., Бекетова М. П. и др. Фитопатологическая и молекулярная характеристика изолятов Phytophthora infestans, собранных с устойчивых и восприимчивых генотипов картофеля // Микология и фитопатология. 2016. Т. 50. С. 175-184.
2. Фадина О. А., Бекетова М. П., Соколова Е. А. и др. Упреждающая селекция: использование молекулярных маркеров при создании доноров устойчивости картофеля к фитофторозу на основе сложных межвидовых гибридов // Сельскохозяйственная биология. 2017. Т. 52. № 1. С. 84-94.
3. Чижик В.К., Соколова Е.А., Мартынов В.В. Применение метода SSCP для анализа генетического полиморфизма Phytophthora infestans // Эпидемии болезней растений: мониторинг, прогноз, контроль / под ред. С.С. Санина. Б. Вяземы: ВНИИФ. 2017. С. 280-287.
4. Armstrong M. R., Whisson S. C., Pritchard L. etc. An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm // Proceedings of National Academy of Sciences of USA. 2005. Vol. 102. Pp. 7766-7771.
5. Bradshaw J.E. Potato breeding at the Scottish Plant Breeding Station and the Scottish Crop Research Institute 1920-2008. // Potato Research. 2009. Vol. 52. Pp. 141-172. [Электронный ресурс]. URL: http://dx.doi.org/10.1007/s11540-009-9126-5 (дата обращения: 27.04.2018).
6. Brylinska M., Sobkowiak S., Stefanczyk E. etc. Evaluation of PCR markers for Phytophthora infestans mating type determination // European Journal of Plant Pathology. 2018. [Электронный ресурс]. URL: https://doi.org/10.1007/s10658-018-1445-4 (дата обращения: 27.04.2018).
7. Champouret N., Bouwmeester K., Rietman H. etc. Phytophthora infestans isolates lacking class I ipiO variants are virulent on Rpi-blb1 potato // Molecular Plant-Microbe. Interactions. 2009. Vol. 22. Pp. 1535-1545. doi: 10.1094/MPMI-22-12-1535.
8. Chmielarz M., Sobkowiak S., Dezbski K. etc. Diversity of Phytophthora infestans from Poland // Plant Pathol. 2014. Vol. 63. Pp. 203-211. DOI: 10.1111/ppa.12076
9. Cooke D.E.L., Cano L.M., Raffaele S. etc. Genome analyses of an aggressive and invasive lineage of the Irish potato famine pathogen // PloS Pathog. 2012. 8(10): e1002940. doi:10.1371/journal.ppat.1002940
10. Du, J., Vleeshouwers, V. G. New strategies towards durable late blight resistance in potato // The Potato Genome. Springer, Cham. 2017. Pp. 161-169. doi.org/10.1007/978-3-319-66135-3_10
11. Fry W. E. Phytophthora infestans: New Tools (and Old Ones) Lead to New Understanding and Precision Management. Annu. Rev. Phytopathol. 2016. 54:22.1-22.19 . doi:10.1146/ annurev-phyto-080615-095951
12. Gilroy E. M., Breen S., Whisson S. C. etc. Presence/absence, differential expression and sequence polymorphisms between PiAVR2 and PiAVR2-like in Phytophthora infestans determine virulence on R2 plants // New Phytologist. 2011. Vol. 191. Pp. 763-776. doi: 10.1111/j.1469-8137.2011.03736.x.
13. Judelson H. S., Spielman L. J., Shattock R. C. Genetic mapping and non-Mendelian segregation of mating type loci in the oomycete, Phytophthora infestans // Genetics. 1995. Vol. 141. Pp. 503-512.
14. Kim H.-J., Lee H.-R., Jo K.-R., etc. Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes // Theoretical and Applied Genetics. 2012. Vol. 124. Pp. 923-935. doi: 10.1007/s00122-011-1757-7.
15. Li Y., Cooke D. E. L., Jacobsen E. etc. Efficient multiplex simple sequence repeat genotyping of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans // Journal of Microbiological Methods. 2013. Vol. 92. Pp. 316-322. doi: 10.1016/j.mimet.2012.11.021.
16. Malcolmson J.F., Black W. New R genes in Solanum demissum Lindl. and their complementary races of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary // Euphytica. 1966. Vol. 15. Pp. 199-203.
17. Sokolova E. A., Kuznetsova M. A., Ulanova T.I. etc. Pathogenecity of East European strains of Phytophthora infestans vs. resistance of colonized potato plants: the profiles of AVR genes vs. R gene pyramids // Schepers H.T.A.M. (ed.). PAGV-Special Report. Wageningen, DLO Foundation. 2017. No. 18. Pp. 259-267. [Электронный ресурс]. URL: www.wur.eu/AAVR (дата обращения: 27.04.2018).
18. Statsyuk N. V., Kuznetsova M. A., Kozlovskaya I. N. etc. Characteristics of the Phytophthora infestans population in Russia // PPO-Special Report, Wageningen, 2010. No 14. Pp. 247-254. [Электронный ресурс]. URL: www.wageningen.nl.UR/ppo (дата обращения: 27.04.2018).
19. van Poppel P. M. J. A., Guo J., van de Vondervoort P. J. I. etc. The Phytophthora infestans avirulence gene Avr4 encodes an RXLR-dEER effector // Molecular Plant-Microbe. Interactions. 2008. Vol. 21. Pp. 1460-1470. doi: 10.1094/MPMI-21-11-1460.
20. Vleeshouwers V. G. A. A., Raffaele S., Vossen J. H. etc. Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors // Annual Review of Phytopathology. 2011. Vol. 49. Pp. 507-531. doi: 10.1146/annurev-phyto-072910-095326.
21. Vossen J. H., Jo K. R., Vosman B. Mining the genus Solanum for increasing disease resistance // R. Tuberosa, ed., Genomics of Plant Genetic Resources. Springer Netherlands. 2014. Pp. 27-46. doi: 10.1007/978-94-007-7575-6.
22. Young, G. K., Cooke, L. R., Watson, S., Kirk, W. W., Perez, F. M., & Deahl, K. L. The role of aggressiveness and competition in the selection of Phytophthora infestans populations. Plant Pathology. 2018 () doi.org/10.1111/ppa.12856.
V12y
REFERENCES
1. Kuznetsova M.A., Kozlovskii B.E., Beketova M.P., et al. [Phytopathological and molecular characterization of Phytophthora infestans isolates collected from resistant and susceptible genotypes of potato]. In: Mikologiya ifitopatologiya [Mycology and Phytopathology], 2016, no. 50, pp. 175-184.
2. Fadina O.A., Beketova M.P., Sokolova E.A., et al. [Pre-emptive breeding: the use of molecular markers when creating a donor of the potato resistance to late blight based on complex interspecific hybrids]. In: Sel'skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural biology], 2017, no. 52, pp. 84-94.
3. Chizhik V.K., Sokolova E.A., Martynov V.V. Primenenie metoda SSCP dlya analiza genetich-eskogo polimorfizma Phytophthora infestans [The application of the SSCP method for analysis of genetic polymorphisms in Phytophthora infestans]. In: Epidemii boleznei rastenii: monitoring, prognoz, kontrol / pod red. S.S. Sanina [Epidemics of plant diseases: monitoring, forecasting, and control / Edited by S.S. Sanin]. Bol'shiye Vyazemy, VNIIF Publ., 2017, pp. 280-287.
4. Armstrong M. R., Whisson S. C., Pritchard L. et al. An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm. In: Proceedings of National Academy of Sciences of USA, 2005, Vol. 102, pp. 7766-7771.
5. Bradshaw J.E. Potato breeding at the Scottish Plant Breeding Station and the Scottish Crop Research Institute 1920-2008. In: Potato Research, 2009, vol. 52, pp. 141-172.
6. Brylinska M., Sobkowiak S., Stefanczyk E. et al. Evaluation of PCR markers for Phytophthora infestans mating type determination. In: European Journal of Plant Pathology. 2018. Available at: https://doi.org/10.1007/s10658-018-1445-4 (accessed: 27.04.2018).
7. Champouret N., Bouwmeester K., Rietman H. et al. Phytophthora infestans isolates lacking class I ipiO variants are virulent on Rpi-blb1 potato. In: Molecular Plant-Microbe. Interactions, 2009, Vol. 22, pp. 1535-1545.
8. Chmielarz M., Sobkowiak S., Dezbski K. et al. Diversity of Phytophthora infestans from Poland. In: Plant Pathol., 2014, Vol. 63, pp. 203-211.
9. Cooke D.E.L., Cano L.M., Raffaele S. et al. Genome analyses of an aggressive and invasive lineage of the Irish potato famine pathogen. In: PloS Pathog., 2012, no. 8 (10): e1002940.
10. Du, J., Vleeshouwers, V. G. New strategies towards durable late blight resistance in potato. In: The Potato Genome. Springer, Cham., 2017, pp. 161-169.
11. Fry W. E. Phytophthora infestans: New Tools (and Old Ones) Lead to New Understanding and Precision Management. In: Annu. Rev. Phytopathol., 2016, 54:22.1-22.19.
12. Gilroy E. M., Breen S., Whisson S. C. et al. Presence/absence, differential expression and sequence polymorphisms between PiAVR2 and PiAVR2-like in Phytophthora infestans determine virulence on R2 plants. In: New Phytologist, 2011, vol. 191, pp. 763-776.
13. Judelson H.S., Spielman L.J., Shattock R.C. Genetic mapping and non-Mendelian segregation of mating type loci in the oomycete, Phytophthora infestans. In: Genetics, 1995, vol. 141, pp. 503-512.
14. Kim H.-J., Lee H.-R., Jo K.-R., et al. Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes. In: Theoretical and Applied Genetics, 2012, vol. 124, pp. 923-935.
15. Li Y., Cooke D. E. L., Jacobsen E. et al. Efficient multiplex simple sequence repeat genotyp-ing of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans. In: Journal of Microbiological Methods, 2013, vol. 92, pp. 316-322.
16. Malcolmson J.F., Black W. New R genes in Solanum demissum Lindl. and their complementary races of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. In: Euphytica, 1966, vol. 15, pp. 199-203.
17. Sokolova E. A., Kuznetsova M. A., Ulanova T.I. et al. Pathogenecity of East European strains of Phytophthora infestans vs. resistance of colonized potato plants: the profiles of AVR genes
V12V
vs. R gene pyramids. In: Schepers H.T.A.M. (ed.). PAGV-Special Report. Wageningen, DLO Foundation, 2017, no 18, pp. 259-267.
18. Statsyuk N.V., Kuznetsova M.A., Kozlovskaya I.N. et al. Characteristics of the Phytoph-thora infestans population in Russia. In: PPO-Special Report, Wageningen, 2010, no 14, pp. 247-254.
19. van Poppel P.M.J.A., Guo J., van de Vondervoort P.J.I. et al. The Phytophthora infestans avirulence gene Avr4 encodes an RXLR-dEER effector. In: Molecular Plant-Microbe Interactions, 2008, vol. 21, pp. 1460-1470.
20. Vleeshouwers V.G.A.A., Raffaele S., Vossen J. H. et al. Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors. In: Annual Review of Phytopathology, 2011, vol. 49, pp. 507-531.
21. Vossen J.H., Jo K.R., Vosman B. Mining the genus Solanum for increasing disease resistance. In: Tuberosa R., ed. Genomics of Plant Genetic Resources. Springer Netherlands, 2014, pp. 27-46.
22. Young G.K., Cooke L.R., Watson S., Kirk W.W., Perez F.M., Deahl K.L. The role of aggressiveness and competition in the selection of Phytophthora infestans populations. In: Plant Pathology, 2018.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 16-04-00098). Фитопато-логическая оценка изолятов Phytophthora infestans выполнена в рамках Государственного задания 0598-2015-0018.
ACKNOWLEDЕGMENTS
The work was supported by the Russian Foundation for Basic Research (Project 16-04-00098). Phytopathological evaluation of Phytophthora infestans is performed within the framework of State Task No. 0598-2015-0018.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ
Соколова Екатерина Андеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии; e-mail: katesokol83@mail.ru
Кузнецова Мария Алексевена - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, заведующий отделом болезней картофеля Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии; e-mail: kuznetsova@vniif.ru
Рогожин Александр Николаевич - кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии; e-mail: rogozhin@vniif.ru
Демидова Валентина Николаевна - кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела болезней картофеля Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии; e-mail: devalya82@mail.ru
Уланова Тамара Ивановна - технолог отдела болезней картофеля Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии; e-mail: tamra53@mail.ru
Сметанина Татьяна Ивановна - технолог отдела болезней картофеля Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии; e-mail: tanechka.smetanina.58@mail.ru
Рогозина Елена Вячеславовна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела генетических ресурсов картофеля Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова; e-mail: rogozinaelena@gmail.com
Хавкин Эмиль Ефимович - доктор биологических наук, заведующий лабораторией Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии; e-mail: emil.khavkin@gmail.com
Ekaterina A. Sokolova - PhD in Biological Sciences, Senior Researcher, Institute of Agricultural
Biotechnology;
e-mail: katesokol83@mail.ru
Maria A. Kuznetsova - PhD in Biological Sciences, Leading Researcher, Head of Department, Institute of Phytopathology; e-mail: kuznetsova@vniif.ru
Alexander N. Rogozhin - PhD in Agricultural Sciences, Senior Researcher, Institute of Phytopathology;
e-mail: rogozhin@vniif.ru
Valentina N. Demidova - PhD in Biological Sciences, Researcher, Institute of Phytopathology; e-mail: devalya82@mail.ru
Tamaral. Ulanova - Technologist, Institute of Phytopathology; e-mail: tamra53@mail.ru
Tatiana I. Smetanina - Technologist, Institute of Phytopathology; e-mail: tanechka.smetanina.58@mail.ru
Elena V. Rogozina - Doctor of Biological Sciences, Leading Researcher, N.I. Vavilov Institute of Plant Genetic Resources (VIR); e-mail: rogozinaelena@gmail.com
Emil E. Khavkin - Doctor of Biological Sciences, Head of Laboratory, Institute of Agricultural Biotechnology;
e-mail: emil.khavkin@gmail.com
Соколова Е.А., Кузнецова М.А., Рогожин А.Н., Демидова В.Н., Уланова Т.И., Сметанина Т.И., Рогозина Е.В., Хавкин Э.Е. Молекулярные методы исследования и мониторинга возбудителя фитофтороза картофеля РНу^рЫНот infestans // Вестник Московского государственного областного университета. Серия: Естественные науки. 2018. № 3. С. 110-124. DOI: 10.18384/2310-7189-2018-3-110-124
Sokolova E., Kuznetsova M., Rogozhin A., Demidova V., Ulanova T., Smetanina T., Rogozina E., Khavkin E. Molecular Methods of Research and Monitoring of Late Blight Pathogen Phy-tophthora infestans. In: Bulletin of the Moscow State Regional University, Series: Natural Sciences, 2018, no. 3, pp. 110-124. DOI: 10.18384/2310-7189-2018-3-110-124
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
ПРАВИЛЬНАЯ ССЫЛКА НА СТАТЬЮ
FOR CITATION
