CC BY
225
МИКРОБИОЛОГИЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.33:579.252.55
А. Ю. Миронов, И. В. Крапивина, Д. Е. Мудрак, Д. В. Иванов
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К р-ЛАКТАМАМ ПАТОГЕНОВ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ
ГОУ ВПО Первый московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова
На основании данных локального микробиологического мониторинга изучены профили и механизмы резистентности к Р-лактамным антибиотикам изолятов грамотрицательных бактерий, патогенов ВБИ в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) и отделениях хирургического профиля стационара. В исследование включены 210 клинических изолятов патогенов ВБИ: Pseudomonas aeruginosa — 86 (40,9%), Acinetobacter baumannii — 45 (21,4%), Klebsiella pneumoniae — 52 (24,8%), Escherichia coli — 23 (11,0%), Enterobacter spp. — 4 (1,9%). Изучены профили антибиотикорезистентности методом серийных микроразведений и проведена детекция методом ПЦР и секвенирования наиболее распространенных и клинически значимых генов в-лактамаз грамотрицательных бактерий. Наибольшей активностью обладают карбапенемы и цефаперазон/сульбактам. Выявлены локальные особенности распространения генов, кодирующих в-лактамазы (ТЕМ, SHV, СТХ) у К. pneumoniae и Е. coli. Выявлены 11 изолятов P. aeruginosa, устойчивых к карбапенемам, у которых подтверждено наличие генетических детерминант, относящихся к VIM-группе, кодирующих металло-в-лактамазы. Приведенные данные позволяют оценить показатели резистентности к в-лактамным антибиотикам, основные механизмы устойчивости возбудителей ВБИ. Такие исследования являются уникальными для каждого ОРИТ, по их результатам следует формулировать основную концепцию этиотропной и эмпирической терапии.
Ключевые слова: ВБИ, антибиотикорезистентность, грамотрицательные бактерии
MironovA.Yu., KrapivinaI.V., MudrakD.Ye., IvanovD.V THE MOLECULAR MECHANISMS OF RESISTANCE TO B-LACTAMS OF PATHOGENS OF HOSPITAL-ACQUIRED INFECTIONS
The data of local microbiologic monitoring was used to study the profiles and mechanisms of resistance to в-lactams antibiotics of gram-negative isolates of bacteria, pathogens of hospital-acquired infections in hospital reanimation and surgical departments. The study included 210 clinical isolates of pathogens of hospital-acquired infections: Pseudomonas aeruginosa — 86 (40.9%), Acinetobacter baumannii — 45 (21.40%), Klebsiella pneumoniae — 52 (24.8%), Escherichia coli - 23 (11.0%), Enterobacter spp. — 4 (1.9%). The profiles of resistance to antibiotics were analyzed using the technique of serial micro-dilutions. The detection of the most common and clinically significant gens of в-lactamases of gram-negative bacteria was implemented using the PCR technique and sequence analysis. The most activity was detected among carbapenems and cephaperazone/sulbactam. The local characteristics of prevalence of gens coding в-lactamases (TEM, SHV, CTX) in K. pneumoniae and E.coli were established. The study detected 11 isolates of P. aeruginosa resistant to carbapenems and having genetic determinants of VIM-group and coding metal-в-lactamases. The discussed data permits to assess the indicators of resistance to в-lactams antibiotics and basic mechanisms of resistance of causative agents of hospital-acquired infections. The studies of this kind are unique for every type of hospital-acquired infection. The results can be used in the development of the concept of etiotropic and empiric therapy.
Key words: hospital-acquired infections, resistance to antibiotics, gram-negative bacterium
Введение. Широкое, часто бесконтрольное применение в клинической практике антибиотиков привело к значительным изменениям этиоструктуры и росту антибиотикорезистентности патогенов. Заболевания, вызванные полирезистентными штаммами, характеризуются длительным течением, чаще требуют госпитализации, при этом увеличивается продолжительность пребывания пациентов в ЛПУ и ухудшается прогноз. Негативные социальноэкономические последствия распространения антибиотикорезистентности побудили ВОЗ разработать "Глобальную стратегию ВОЗ по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам", в которой рекомендовано рассматривать данную проблему в качестве одного из приоритетов национальных систем здравоохранения. Расшифровка молекулярных механизмов резистентности необходима для создания новых препаратов и средств диагностики, а также для оптимизации режимов этиотропной терапии.
Для корреспонденции:
Миронов Андрей Юрьевич, д-р мед. наук, проф. каф. микробиологии Адрес: 119991, Москва, ул. М. Трубецкая, 8, стр. 2 Телефон: 629-75-79 E-mail: [email protected]
Особую актуальность проблема антибиотикорезистентности приобретает при лечении внутрибольничных инфекций (ВБИ), распространение которых стремительно возрастает по мере совершенствования медицинских технологий, существенно расширяющих круг критических состояний, поддающихся эффективной терапии. Интенсивный селективный прессинг антибиотиков обусловливает быструю эволюцию и распространение новых механизмов резистентности в ЛПУ, прежде всего в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ).
Антибактериальная терапия ВБИ основана в большинстве случаев на эмпирическом подходе, особенно до получения результатов микробиологических исследований. При этом необходимы знания о приоритетных патогенах определенных нозологических форм инфекционных осложнений, спектре природной активности антибиотиков и приобретенной резистентности в данном регионе и ЛПУ.
В этиоструктуре ВБИ ведущая роль принадлежит грамотри-цательным бактериям, в частности энтеробактериям и НГОБ. Для этих бактерий характерны множественные, сложные механизмы резистентности к антибиотикам, формирование в процессе лечения множественной лекарственной устойчивости, что усложняет выбор рациональной антибиотикотерапии.
39
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 1, 2012
Таблица 1
Праймеры, использованные для детекции генов Р-лактамаз класса А у клинических изолятов энтеробактерий
Мишень Праймер Последовательность праймера (5’—3’) Размер продукта, пн Позиция в гене № в GeneBank
ТЕМ TEM-F AAACGCTGGTGAAAGTA 774 280—295 AY628199
TEM-R TAATCAGTGAGGCACCTATCTC 1032—1053
SHV SHV-F TTATCTCCCTGTTAGCCACC 731 193—212 AY223863
SHV-R TGCTTTGTTATTCGGGCCAA 903—922
CTX-M CTX-M-F ATGTGCAGTACCAGTAAGGTGATGGC 538 210—235 Y14156
CTX-M-R GCGATATCGTTGGTGGTGCC 729—748
CTX-M1group СТХ-М1Л AAATCACTGCGTCAGTTCACGC 864 604—625 AJ416340
СТХ-М1^ CAAACCGTTGGTGACGAT 1450—1467
CTX-M2group CTX-M2-F ATGATGACTCAGAGCATTCG 869 1—20 АВ176535
CTX-M2-R CCGTGGGTTACGATTTTCGC 850—869
CTX-M8group CTX-M8-F ATGATGAGACATCGCGTTAA 870 274—293 AF189721
CTX-M8-R TCCGTCGGTGACGATTTTCGCG 1122—1143
CTX-M9group CTX-M9-F ATGGTGACAAAGAGAGTGC 869 6336—6354 AF174129
CTX-M9-R CCTTCGGCGATGATTCTCGC 7185—7204
CTX-M25group CTX-M25-F ATGATGAGAAAAAGCGTAAG 869 2321—2340 AF518567
CTX-M25-R CCGTCGGTGACAATTCTGGC 3170—3189
Традиционно основу лечения ВБИ, вызванных данными патогенами, составляли Р-лактамные антибиотики, прежде всего це-фалоспорины III поколения. Их эффективность в последние годы резко снизилась из-за распространения среди данных патогенов Р-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) класса А. Альтернативу цефалоспоринам III поколения составляют цефалоспорины IV поколения, кабапенемы и ингибиторзащищенные Р-лакгамы, применение которых в клинике постоянно расширяется. В ответ на изменения в стратегии и тактике применения антибиотиков в разных регионах происходят изменения в распространении отдельных групп и классов Р-лактамаз, смена лидирующих групп. К важным тенденциям относится рост частоты выделения Р-лактамаз класса С и появление кабапенемаз, прежде всего относящихся к классу В — металло-Р-лактамаз (МБЛ).
Своевременное выявление изменений в распространении Р-лактамаз имеет важное теоретическое и практическое значение, поскольку позволяет корректировать рекомендации по антибактериальной терапии ВБИ, разрабатывать экспресс-методы молекулярной детекции антибактериальной резистентности, дает важную инфомацию для создания новых препаратов, преодолевающих резистентность.
Материалы и методы. Исследован биологический материал (отделяемое раневых поверхностей, патологическое отделяемое дренажей при абдоминальных инфекциях, трахеобронхиальный аспират, кровь) от 174 больных с подозрением на ВБИ и 9 смывов с объектов окружающей среды из хирургических отделений и ОРИТ ДГКБ № 9 им. Г. Н. Сперанского Москвы в 2003—2005 гг. Выделено 429 клинических изолятов, в том числе грамотрицательных бактерий — 49%, грамположительных бактерий — 41%), грибов рода Candida — 10%. Изучены 210 клинических изолятов приоритетных грамотрицательных патогенов ВБИ, из них: Pseudomonas aeruginosa — 86 (40,9% штаммов, Acinetobacter baumannii — 45 (21,4%) штаммов, Klebsiella pneumoniae — 52 (24,8%) штамма, Escherichia coli — 23 (11,0%) штамма, Enterobacter spp. — 4 (1,9%) штамма.
Идентификацию выделенных культур и определение чувствительности к антибактериальным препаратам проводили с помощью автоматических анализаторов Vitek 32 и АТВ Expression ("BioMerieux", Франция). Для дальнейшего изучения штаммов грамотрицательных бактерий, подозрительных по фенотипу на продукцию БЛРС и МБЛ, оценивали их антибиотикочувствительность методом серийных микроразведений в ионосбалансированном бульоне Мюллера—Хинтона ("BectonDickinson", США) в соответствии с критериями CLSI [13, 14]. Чувствительность энтеробактерий определяли к ампициллину, ампициллину/сульбактаму, цефокситину, цефотаксиму,
цефтазидиму, цефтазидиму с добавлением клавулановой кислоты в концентрации 4 мкг/мл, цефоперазону, цефоперазону/суль-бактаму, цефепиму, имипенему, меропенему. Чувствительность НГОБ определяли к цефтазидиму, цефоперазону, цефоперазону/ сульбактаму, цефепиму, имипенему, меропенему. Устойчивые к имипенему и/или меропенему штаммы P. aeruginosa являлись подозрительными на продукцию МБЛ. Продукцию МБЛ класса В данными штаммами P. aeruginosa изучали в подтверждающем тесте —"метод двойных дисков" (double-disk approximation test) с ингибитором МБЛ —ЭДТА [8]. Для контроля качества постановки теста на чувствительность к антибиотикам использовали референтные штаммы Е. coli АТСС 25922, Е. coli АТСС 700603 и P. aeruginosa АТСС 27853.
Штаммы энтеробактерий с подтверженным БЛРС-фено-типом исследовали методом ПЦР для детекции наиболее распространенных и клинически значимых генов Р-лактамаз молекулярного класса А (ТЕМ, SHV, СТХ), а изоляты Р. aeruginosa с выявленным синергизмом карбапенема и ЭДТА — для детекции генов МБЛ молекулярного класса B (VIM, IMP, SPM, GIM) [1, 7, 12]. ПЦР проводили в ПЦР-пробирках на 0,6 мл ("QSP", СШа) в объеме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили 1xTaq ДНК-полимеразный буфер, 1 ЕД Taq ДНК-полимераза (" СибЭн-зим", Россия), 200 мкмоль дезоксинуклеотидов трифосфатов по 15 пмоль прямого и обратного праймера (табл. 1 и 2) и 5 мкл раствора матрицы ДНК. Амплификацию выполняли в ампли-фикаторе Терцик ("ДНК-Технология", Россия) по стандартному протоколу [6].
Минисеквенирование Р-лактамаз ТЕМ-типа проводили в ПЦР-пробирках на 0,6 мл в объеме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили 66 мМ трис-HCl (рН 9,0, "Sigma", США); 25 мМ магния хлорида ("Sigma", США); 16 мМ аммония сернокислого ("Sigma", США); 0,1% раствор желатина; 0,05% раствор твина-20 ("Sigma", США); 5% глицерин; раствор дезокси-нуклеотидтрифосфатов (НТФ) (НПО "Вектор", Новосибирск), концентрация каждого дНТФ 250 мкМ; 1 ед. Taq-полимеразы (НПФ "Литех", (лМосква); по 20 пмоль прямого и обратного праймера (TEM-fw и TEM-rev) и 5 мкл раствора матрицы ДНК. Амплификацию выполняли в амплификаторе РТС-240 DNA Engine Tetrad2 ("MJ Research Bio-Rad", США) по следующему протоколу: денатурация в течение 2 мин при 94oC, затем 35 циклов амплификации (30 с — денатурация при 94oC, 10 с — отжиг праймеров при 55oC, 20 с — элонгация при 72oC). Анализ продуктов амплификации проводили в 2%-агарозном геле.
Для дефосфорилирования 5’-концевых фосфатных групп dNTP продукты амплификации гена ТЕМ инкубировали с 0,5 ед. фосфатазы арктических креветок ("Promega", США) в течение
40
МИКРОБИОЛОГИЯ
Таблица 2
Праймеры, использованные для ПЦР-детекции генов карбапенемаз молекулярного подкласса B1 — VIM, IMP, SPM и GIM
Ген-мишень Праймер Последовательность нуклеотидов (5’ 3’) Размерность ампликона, пн Позиция в гене № в GeneBank Т отжига, oC
VIM VIM-F ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG 781 2969—2989 EF614235 56
VIM-R CTACTCAACGACTGAGCG 3733—3750
IMP IMP-F ACCGCAGCAGAGTCTTTGCC 566 1251—1270 EF375699 56
IMP-R ACAACCAGTTTTGCCTTACC 1797—1817
SPM SPM-F GCGTTTTGTTTGTTGCTC 800 2335—2352 AY3412491 56
SPM-R TTGGGGATGTGAGACTAC 3118—3135
GIM G1M-F AGAACCTTGACCGAACGCAG 56
GIM-R ACTCATGACTCCTCACGAGG
30 мин при 37oC с последующей инактивацией фермента прогреванием в течение 10 мин при 85oC.
Реакцию термоциклического минисеквенирования проводили в реакционной смеси: 66 мМ трис-HCl рН 9,0; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 2,5 мМ MgCl2; по 0,2 мМ необходимых dNTP и/или ddNTP; по 40 пмоль каждого праймера (табл. 3) и 2 ед. TermiPol DNA Polymerase ("Solis Biodyne", Эстония), используя в качестве матрицы амплифицированные фрагменты гена ТЕМ. Наработку продуктов минисеквенирования осуществляли по профилю: 94oC — 20 с, 49oC — 20 с, 72oC — 20 с, 70 циклов, в амплификато-ре DNA Engine Tetrad™ ("MJ Research", США). Очистку продуктов минисеквенирования проводили с помощью SpectroCLEAN Kit ("Sequenom", США) согласно инструкции фирмы-производителя. Аликвоту образца (0,2—1 мкл), полученного после процедуры очистки, наносили на высушенную на мишени AnchorChip (400 мкм, "Bruker Daltonics", Германия) матрицу, приготовленную из насыщенного раствора 3-гидроксипиколиновой кислоты ("Fluka", Германия) в 50% ацетонитриле ("Merck", Германия) с добавлением 10 г/л цитрата аммония двухосновного ("Fluka", Германия) и высушивали на воздухе. Все использованные растворители, включая воду ("Merck", Германия), были только аналитической чистоты или специальные для масс-спектрометрии. Масс-спектрометрический анализ осуществляли с помощью MALDI ToF масс-спектрометра Microflex ("Вrukеr Daltonics", Германия), оснащенного азотным лазером (X = 337 нм) с частотой импульсов до 20 Гц. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы "Вшkеr Daltonics" (Германия): flexControl 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11).
Секвенирование Р-лактамаз SHV-типа проводили в ПЦР-пробирках 0,6 мл в объеме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили 66 мМ трис-HCl (рН 9,0, "Sigma", США); 25 мМ магния хлорида ("Sigma", США); 16 мМ аммония серно-кислого ("Sigma", США); 0,1% раствор желатина; 0,05% раствор твина-20 ("Sigma", США); 5% глицерин; раствор дезоксинуклеотидтри-
Таблица 3
Праймеры, использованные для секвенирования генов Р-лактамаз ТЕМ-типа
Олигонуклеотид Последовательность
TEM-fw ATAAAATTCTTGAAGACGAAA
TEM-Rew GACAGTTACCAATGCTTAATCA
238TemF1 ATTGCTGATAAATCTGGA
238TemF2 TGCTGATAAATCTGGAGCC
238TemF3 CTGATAAATCTGGAACC
238TemR1 GATACCGCGAGATCCACGCT
238TemR2 ATACCGCGAGACCCACGCT
TEM164f ATCATGTAACCCGCCTTGAT
TEM164f1 ATGTAACCCGCCTTGATA
TEM164r TCAGCTCCGGTTCCCAA
TEM104f CTCAGAATGACTTGGTT
фосфатов (НТФ) (НПО "Вектор", Новосибирск), концентрация каждого дНТФ 250 мкМ; 1 ед. Taq-полимеразы (НПФ "Литех", Москва), по 10 пмоль прямого и обратного праймера и 5 мкл раствора матрицы ДНК. Амплификацию проводили в амплификато-ре РТС-240 DNA Engine Tetrad2 ("Mj Research Bio-Rad", США) по следующему протоколу: денатурация в течение 2 мин при 94oC, затем 35 циклов амплификации (30 с — денатурация при 94oC, 10 с — отжиг праймеров при 60oC, 20 с — элонгация при 72oC).
Анализ продуктов амплификации выполняли в 2% агарозном геле. Для дефосфорилирования 5’-концевых фосфатных групп dNTP продукта амплификации гена SHV инкубировали с 0,5 ед. фосфатазы арктических креветок ("Promega", США) в течение 30 мин при 37oC с последующей инактивацией фермента прогреванием в течение 10 мин при 85oC. Реакцию термоциклического сек-венирования проводили в реакционной смеси: 66 мМ трис-HCl рН 9,0; 16,6 мМ (NH4)2So@4; 2,5 мМ MgC^; по 0,2 мМ необходимых ddNTP; по 3 пмоль каждого праймера (табл. 4) и 2 ед. TermiPol DNA Polymerase ("Solis Biodyne", Эстония), используя в качестве матрицы амплифицированные фрагменты гена SHV. Наработку продуктов минисеквенирования осуществляли по профилю: 94oC — 30 с, 55oC — 20 с, 60oC — 4 мин, 25 циклов, в амплификаторе DNA Engine Tetrad™ ("MJ Research", США). Нуклеотидную последовательность гена SHV определяли с использованием прибора ABI Prism® 3100 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США; "Hitachi" Япония) в соответствии с прилагаемыми инструкциями.
Полноразмерную последовательность SHV-гена получали путем склеивания нуклеотидных фрагментов A, B, C и D с использованием программного продукта "Vector NTI® Suite v. 9" ("Informax Inc", США). Для статистической обработки результатов применяли компьютерные программы WHONET 5.0. и Excel ("Microsoft", США).
Результаты и обсуждение. Грамотрицательные бактерии лидируют в развитии ВБИ у больных в ОРИТ ДГКБ N° 9 (рис. 1). Среди всех микробов их доля составляет 49%. Приоритетными патогенами среди грамотрицательных бактерий являются Pseudomonas aeruginosa, A. baumannii, Е. соН, K. pneumoniae, Enterobacter spp. (рис. 2).
Наибольшая частота случаев ВБИ регистрируется в ожоговых ОРИТ — 64%, реже в общехирургических ОРИТ (28—31%) [16]. Специфика изученных нозологических форм указывает на преобладание больных с диагнозом "ожоговая травма".
Исследования показали, что P. aeruginosa является приоритетным патогеном ВБИ среди грамотрицательных бактерий. Штаммы P. aeruginosa обладают множеством механизмов резистентно-
Таблица 4
Праймеры, использованные для секвенирования генов Р-лактамаз SHV-типа
Олигонуклеотид По следовательно сть
SHV_intF TTGACCGCTGGGAAACGGAA
SHV_intR CGGCGAGTAGTCCACCAGA
SHV-F GTATTATCTCCCTGTTAGCC
SHV-R GCAGCACGGAGCGGATCAACG
41
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 1, 2012
Грибы 10 %
Грамположительные микроорганизмы 41 %
Грамотрицательные микроорганизмы 49 %
Рис. 1. Частота выделения патогенов ВБИ в ДГКБ № 9 в 2003— 2005 гг.
сти к антимикробным препаратам [5]. Поэтому особенностью P. aeruginosa является непредсказуемость фенотипа, что значительно затрудняет выбор оптимальной антибактериальной терапии. По некоторым данным, активность Р-лактамных антибиотиков (не учитывая карбапенемов) убывает в следующем порядке: це-фепим, цефалоспорины III поколения (цефтазидим, цефоперазон) [3]. Наши данные подтверждают это. Антибактериальная активность обоих препаратов (имипенем и меропенем) была одинаковой (65,1% чувствительных штаммов). Карбапенемы обладают наибольшей активностью среди всех Р-лактамных антибиотиков в отношении штаммов P. aeruginosa, так как имеют небольшую молекулярную массу, легко диффундируют через клеточную стенку бактерии за счет наличия в их молекуле двух противоположных электрических зарядов и обладают улучшенными фармакодинамическими и фармакокинетическими свойствами [3]. Из цефалоспоринов III и IV поколений самым активным препаратом являлся ингибиторзащищенный цефоперазон — цефоперазон/ сульбактам (66,4% чувствительных штаммов). К цефтазидиму чувствительны 51,2% штаммов P. aeruginosa, а к цефоперазону всего лишь 43%. Относительно неплохую активность показал це-фепим (58,1% чувствительных штаммов).
Наибольшей активностью в отношении штаммов A. bau mannii обладают карбапенемы (100%)) и цефоперазон/сульбактам (95,6%).
К. pneumoniae является одним из ведущих возбудителей ВБИ. Он вызывает от 2 до 20% всех ВБИ [15]. Из всех механизмов антибиотикорезистентности для К. pneumoniae самым важным является продукция БЛРС, которые разрушают все b-лактамные антибиотики, за исключением цефамицинов (цефокситин) и карбапенемов. В РФ 39% клебсиелл продуцируют БЛРС, хотя в отдельных ЛПУ частота выделения продуцентов возрастает до 79% [9]. По данным многоцентрового исследования "Micromax", проведенного в ОРИТ ЛПУ Москвы в 1999 г, частота продукции БЛРС у Klebsiella spp., составляла от 0 до 93%, у Е. coli — от 8 до 48% [4]. Штаммы К. pneumoniae отличались высокой резистентностью к ампициллину — 97,7%, ингибиторзащищенному ампициллину — ампициллину/сульбактаму — 84,1%, цефалоспо-ринам III—IV поколения (к цефоперазону — 86,4%, цефотакси-му — 72,7%, цефтазидиму — 43,2%, цефепиму — 40,9%). При очень низкой активности цефоперазона цефоперазон/сульбактам, напротив, показал высокую активность — 75% чувствительных
11%
11%
Ц 2% Щ 2%
5%
S.saprophyticus S.maltophiliae Candida spp.
Enterobacter spp.
S.epidermidis
C.albicans^^^6% K.pneumoniae A.baumannii E.coli S.aureus P.aeruginosa Enterococcus spp.
8%
10%
10%
15%
15%
18%
Рис. 2. Видовой состав патогенов ВБИ в ОРИТ ДГКБ № 9 в 2003—2005 гг.
БЛРС+ 61,5 %
БЛРС -
38,5 %
Рис. 3. Продуценты и непродуценты БЛРС среди клинических изолятов Klebsiella spp.
к нему штаммов К. pneumoniae. Низкая активность цефалоспо-ринов III—IV поколения позволяет предположить наличие среди клинических изолятов клебсиелл продуцентов БЛРС. Среди 52 штаммов 48 (92%) имели сниженную чувствительность (МПК > 2 мкг/мл) хотя бы к одному из цефалоспоринов III поколения.
С помощью фенотипического теста для подтверждения продукции БЛРС показано, что 41 из 52 (79%) исследуемых штаммов клебсиелл является потенциальными продуцентом БЛРС. Кроме продукции БЛРС, важным механизмом, обусловливающим резистентность к цефалоспоринам, является гиперпродукция хромосомных Р-лактамаз класса С. Признаком продукции Р-лактамаз класса С является устойчивость к цефокситину. Устойчивость к цефокситину выявлена у 18 (34,6%) штаммов K. pneumoniae.
Штаммы Е. coli отличались высокой резистентностью к ампициллину —94,7%, ингибиторзащищенному ампициллину — ам-пициллину/сульбактаму —36,8% резистентных и 47,4% умеренно резистентных штаммов — и цефалоспоринам III поколения (це-фотаксиму — 52,6%; цефоперазону — 73,7% устойчивых штаммов). Активность цефтазидима и цефепима была выше и составила 57,9 и 78,9% чувствительных штаммов Е. coli соответственно. При использовании фенотипического теста для подтверждения продукции БЛРС выявлено 18 (78%) штаммов Е. coli, потенциально продуцирующих ферменты данного типа. Устойчивость к цефокситину выявлена у 7 (30,4%) из всех изученных штаммов Е. coli. Все штаммы Е. coli чувствительны к карбапенемам.
ПЦР-детекцию генов, кодирующих продукцию БЛРС, проводили у 79 штаммов грамотрицательных бактерий с подтвержденным БЛРС-фенотипом (К. pneumoniae — 52, Е. coli — 23 и Enterobacter spp. — 4). Наличие генов наиболее распространенных групп Р-лактамаз (ТЕМ, SHV, СТХ) подтверждено у 54 штаммов (68,4%).
Гены, кодирующие Р-лактамазы ТЕМ-1-групп, обнаружены у 48 изолятов энтеробактерий: у 34 (65,4% от числа всех клебсиелл) штаммов К. pneumoniae, у 12 (52,2% от числа всех кишечных палочек) штаммов Е. coli, у 2 (50% от числа всех энтеробак-теров) штаммов Enterobacter spp.
Гены, кодирующие Р-лактамазы SHV-групп, обнаружены у 38 изолятов энтеробактерий. Из них 31 штамм продуцирует Р-лактамазы SHV-1-типа (29 штаммов К. pneumoniae и 2 штамма Enterobacter spp.) и 7 штаммов — БЛРС (у K. pneumoniae: SHV-
%
Рис. 4. Частота встречаемости генов наиболее распространенных Р-лактамаз среди клинических изолятов К. pneumoniae, выделенных при ВБИ.
42
МИКРОБИОЛОГИЯ
БЛРС+
52,2%
БЛРС -47,8 %
Рис. 5. Продуценты и непродуценты БЛРС среди клинических изолятов Е. соН.
11 — 4 штамма, SHV-12 — 1 штамм, SHV-5 — 1 штамм; у Е. coli SHV-2a — 1 штамм).
Гены, кодирующие Р-лактамазы СТХ-групп, обнаружены у 44 изолятов энтеробактерий. Осуществляли детекцию подгрупп ферментов типа СТХ: СТХ-М1 обнаружены у 28 (53,8% от числа всех клебсиелл) штаммов К. pneumoniae, 11 (47,8% от числа всех кишечных палочек) штаммов Е. coli, 2 (50% от числа всех энтеробактеров) штаммов Enterobacter spp. Гены ферментов подгруппы СТХ-М9 выявлены у 3 (5,8% от числа всех клебсиелл) штаммов К. pneumoniae.
Гены всех трех основных групп Р-лактамаз обнаружены у энтеробактерий как в изолированном виде, так и в различных сочетаниях. Большинство исследованных штаммов, выделенных из патологического материала при ВБИ, содержат гены, кодирующие продукцию одновременно Р-лактамаз широкого и расширенного спектра действия. Представительство Р-лактамаз распределилось следующим образом.
Из 52 штаммов К. pneumoniae гены, кодирующие Р-лактамазы широкого спектра действия, выявлены у 37 (71,2%) изолятов. Гены, кодирующие продукцию БЛРС, обнаружены у 32 штаммов, что составляет 61,5%) (рис. 3). У 29 штаммов одновременно обнаружены гены, кодирующие Р-лактамазы широкого спектра и БЛРС. Распределение генов Р-лактамаз у клебсиелл представлено на рис. 4.
Из 23 штаммов Е. coli гены, кодирующие продукцию Р-лактамаз широкого спектра действия, выявлены у 12 (52,2%) штаммов. Гены, кодирующие продукцию БЛРС, обнаружены у 12 штаммов, что составляет 52,2% (рис. 5). У 6 штаммов одновременно обнаружены гены, кодирующие b-лактамазы широкого спектра и БЛРС. Распределение генов БЛРС у Е. coli представлено на рис. 6.
Из 4 штаммов Enterobacter sрр. гены, кодирующие продукцию Р-лактамаз широкого спектра действия, выявлены у 3 (75%) штаммов. Гены, кодирующие продукцию БЛРС, обнаружены у 2 штаммов, что составляет 50%. У 2 штаммов одновременно обнаружены гены, кодирующие и Р-лактамазы широкого спектра, и БЛРС. Гены БЛРС у энтеробактеров представлены ферментами СТХ-М1-группы.
Отобраны изоляты P. aeruginosa со сниженной активностью и устойчивые к карбапенемам (имипенему и/или меропенему). Штаммов P. aeruginosa, подозрительных на продукцию МБЛ, оказалось 23 (26,7%). С данными изолятами проведен подтверждающий фенотипический тест на выявление у них продукции МБЛ класса В. Тестирование выполнено методом "двойных дисков": диски с имипенемом, меропенемом и ингибитором МБЛ класса В — ЭДТА [8]. Из 86 штаммов P. aeruginosa у 11 (12,8%) фенотипически доказана выработка МБЛ класса В.
Молекулярную детекцию МБЛ класса B (VIM-, IMP-, SPM-и GIM-групп) проводили методом ПЦР У всех 11 штаммов P. aeruginosa с доказанным фенотипом выявлено наличие генов МБЛ группы VIM.
Выводы. 1. Приоритетными патогенами ВБИ в ОРИТ ДГКБ № 9 среди грамотрицательных бактерий являются A. baumannii, Е. coli, K. pneumoniae, Enterobacter spp.
2. Среди изученных антибактериальных препаратов карба-пенемы обладают наибольшей активностью по отношению ко всем видам изученных микроорганизмов. Высокую активность наблюдали у цефоперазона/сульбактама, цефепима, амикацина, ципрофлоксацина.
3. Фенотипический скрининг выявил 12,8% штаммов P. aeruginosa, подозрительных на выработку МБЛ класса B, 79% штаммов K. pneumoniae и 78% штаммов Е. соН, подозрительных на продукцию БЛРС.
4. Генотипирование показало наличие у 12,8% клинических изолятов Р. aeruginosa МБЛ VIM-группы.
%
Рис. 6. Частота встречаемости генов наиболее распространенных Р-лактамаз среди клинических изолятов Е. coli, выделенных при ВБИ.
5. Среди клинических изолятов K. pneumoniae у 61,5% штаммов подтверждено наличие генов БЛРС. Наиболее часто встречалась комбинация генов, кодирующих БЛРС типа SHV-1, ТЕМ-1 и БЛРС подгруппы СТХ-М1 в 23,1% случаев.
6. Среди клинических изолятов Е. coli у 52,2% штаммов подтверждено наличие генов БЛРС. Наиболее часто у Е. coli встречаются Р-лактамаза широкого спектра ТЕМ-1-типа и ее комбинация с БЛРС СТХ-М1.
7. На фоне общей негативной тенденции к росту антибиотикорезистентности уровень резистентности может в значительной степени различаться между разными ЛПУ и географическими регионами [1—3, 7, 10, 11].
8. Профили чувствительности к антибактериальным препаратами и генетические основы антибиотикорезистентности являются уникальными для данного ЛПУ. Они позволяют оценить уровень и прогноз резистентности к Р-лактамным антибиотикам, выявить основные механизмы устойчивости патогенов ВБИ, сформулировать рекомендации по рациональной антибиотикотерапии. * 1 11
ЛИТЕРАТУРА
1. Березин А. Г., Ромашов О. М., Яковлев С. В. // Антибиотики и химиотер. — 2003. — Т 48, № 7. — С. 5—11.
2. Гельфанд Б. Р., Белоцерковский Б. З., Попов Т. В., Карабак В. И. // Инфекции в хир. — 2003. — Т. 1, № 4. — С. 2—10.
3. Решедько Г. К., РябковаЕ. Л. // Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер. — 2008. — Т. 10, № 2. — С. 35.
4. Сидоренко С. В., Страчунский Л. С., Ахмедова Л. И. // Антибиотики и химиотер. — 1999. — № 11. — С. 7—13.
5. Сидоренко С. В. // Клин. фармакол. и тер. — 2003. — Т. 12, № 2. — С. 1—8.
6. Сидоренко С. В., Березин А. Г., Иванов Д. В. // Антибиотики и химиотер. — 2004. — Т. 49, № 3. — С. 6—15.
7. Сидоренко С. В., Резван С. П., Еремина Л. В. и др. // Антибио-
тики и химиотер. — 2005. — Т. 50, № 2—3. — С. 33—41.
8. Сидоренко С. В., ТишковВ. И., Иванов Д. В. // Клин. фармакол. и тер. — 2005. — Т. 14, № 2. — С. 1—5.
9. Страчунский Л. С. // Consilium medicum. — 2002. — Экстра-выпуск. — С. 6—9.
10. Эйдельштейн М. В., Страчунский Л. С. // Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер. — 2005. — Т. 7, № 4. — С. 323—336.
11. Яковлев В. П., Яковлев С. В. // Антибиотики и химиотер. — 2004. — Т. 49, № 10. — С. 3—11.
12. Livermore D. М. // Clin. Microbiol. Rev. — 1995. — Vol. 8. — P. 557—584.
13. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard M7-A5, 5-th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards. — Wayne, 2000.
14. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Approved standard M2-A7, 7-th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards. — Wayne, 2000.
15. Podschun R., Ullmann U. // Clin. Microbiol. Rev. — 1998. — Vol. 11, № 4. — P. 589—603.
16. SinghN., Yu V. // Chest. — 2000. — Vol. 117, № 5. — P. 1496—1499.
Поступила 31.03.11
43
