Научная статья на тему 'Молекулярные механизмы пептидной регуляции функций коры головного мозга при старении'

Молекулярные механизмы пептидной регуляции функций коры головного мозга при старении Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
334
93
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ТРИПЕПТИД / TRIPEPTIDE / ГОЛОВНОЙ МОЗГ / BRAIN / НЕЙРОПРОТЕКТОР / NEUROPROTECTOR / СТАРЕНИЕ / AGEING

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Линькова Н.С., Умнов Р.С., Гутоп Е.О.

Представлены данные о молекулярных мишенях нейропротекторного пептида пинеалона (Glu-Asp-Arg). Установлено, что этот пептид активирует процессы клеточного обновления (маркеры Ki67, р53) и функциональную активность нейронов (синтез серотонина, кальмодулина, виментина).

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Линькова Н.С., Умнов Р.С., Гутоп Е.О.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

MOLECULAR MECHANISMS OF PEPTIDE REGULATION OF BRAIN FUNCTION DURING AGEING

The data of molecular targets of peptide pinealon are presented (Glu-Asp-Arg). This peptide activates cell renovation (markers Ki67, p53) and functional activity of neurons (synthesis of serotonin, calmodulin, me-latonin).

Текст научной работы на тему «Молекулярные механизмы пептидной регуляции функций коры головного мозга при старении»

Материалы конференции

УДК 616.831.31-053.9:577.112.389.5

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПЕПТИДНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ СТАРЕНИИ

Н. С. Линькова, Р. С. Умнов, Е. О. Гутоп Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Санкт-Петербург, Россия

MOLECULAR MECHANISMS OF PEPTIDE REGULATION OF BRAIN FUNCTION DÜRING AGEING

N. S. Linkova, R. S. Umnov, E. O. Gutop Saint-Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, St. Petersburg, Russia

© Н. С. Линькова, Р. С. Умнов, Е. О. Гутоп, 2013 г.

Представлены данные о молекулярных мишенях нейропротекторного пептида пинеалона (Glu-Asp-Arg). Установлено, что этот пептид активирует процессы клеточного обновления (маркеры Ki67, р53) и функциональную активность нейронов (синтез серотонина, кальмодулина, виментина). Ключевые слова: трипептид, головной мозг, нейропротектор, старение.

The data of molecular targets of peptide pinealon are presented (Glu-Asp-Arg). This peptide activates cell renovation (markers Ki67, p53) and functional activity of neurons (synthesis of serotonin, calmodulin, melatonin).

Keywords: tripeptide, brain, neuroprotector, ageing.

Коррекция возрастных нарушений функциональной активности нейронов головного мозга является актуальной задачей неврологии и геронтологии [1].

Поиск новых эффективных средств лечения больных с мозговой дисфункцией особенно актуален, поскольку заболевания центральной нервной системы (ЦНС) часто встречаются у лиц пожилого и старческого возраста. Перспективной группой нейропротекторных средств являются пептидные биорегуляторы, обладающие высокой эффективностью и отсутствием побочных эффектов [2, 3]. К новому поколению нейропротекторных пептидных биорегуляторов относится трипептид пинеалон (Glu-Asp-Arg), способствующий нормализации функций коры головного мозга [4, 5]. Эффективность применения трипептида подтверждена данными комплексного исследования психоэмоционального и функционального состояния ЦНС у лиц пожилого возраста [6].

В другом исследовании проведена оценка влияния нейропротекторного трипептида на резервные возможности организма у спортсменов после воздействия высокой физической нагрузки. Спортивный стресс носит комплексный характер и включает в себя эмоциональное напряжение, физическое утомление, гипоксию и ацидоз. Известно, что систематическое избыточное накопление в организме продуктов перекисного окисления липидов стимулирует развитие в органах выраженных дистрофических и атрофических нарушений, уско-

ряя процессы старения. Установлено, что перораль-ное применение трипептида пинеалона у спортсменов способствовало улучшению показателей антиоксидантной системы.

Целью настоящего исследования явилось изучение молекулярных механизмов нейропротек-торной активности пептида пинеалона.

Материалы и методы исследования. В работе использовали первичные диссоциированные и ор-ганотипические культуры клеток коры головного мозга, полученные от крыс линии Вистар. Для создания диссоциированных культур использовали кору головного мозга молодых (3 мес) крыс. Куль-туральная среда содержала 15% фетальной бычьей сыворотки, 82,5% DMEM, 1,5% HEPES, L-глу-тамин и гентамицин. Выделение первичной культуры проводили на чашках Петри, обработанных раствором желатина («Биолот»). Последующее культивирование осуществляли во флаконах с обработанной поверхностью объемом 50 мл (JetBiofil, 25 см2, поставщик «Биолот»). Клетки выращивали в 5 мл культуральной среды на флакон и в 3 мл культуральной среды на чашку Петри диаметром 3,5 см. Первый пассаж расценивали как «молодые», а 14-й пассаж — как «старые» культуры в соответствии с рекомендацией Международной ассоциации исследований клеточных культур (США, Сан-Франциско, 2007). Культуры клеток разделяли на 3 группы: в 1-ю группу (контрольную) вводили физиологический раствор, во 2-ю группу — пептид Glu-Asp-Arg в концентрации 20 нг/мл.

Materials of conference

Для иммуноцитохимического исследования диссоциированных культур использовали первичные моноклональные антитела к серотонину (1 : 50, Dako) и вторичные антитела — биотинилированные антимышиные иммуноглобулины («Novocastra»).

Для создания органотипических культур кору головного мозга старых (24 мес) крыс разделяли на эксплантаты (фрагменты величиной около 1 мм3) и культивировали в чашках Петри в 3 мл питательной среды. Питательная среда содержала 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной телячьей сыворотки, 0,6% глюкозы, 0,5 ед./мл инсулина и 100 ед./мл гентамицина. Эксплантаты коры головного мозга и селезенки в течение 3 сут культивировали в инкубаторе при температуре 36,7 °С в условиях постоянного поступления 5% СО2. Культуры клеток коры головного мозга были разделены на 4 группы: контрольную — с введением физиологического раствора и три экспериментальные — с добавлением пептидов Т-33 (исследуемый пептид), АВ-0 (отрицательный контроль) и кор-тексина (положительный контроль). Пептиды добавляли в культуры в следующих концентрациях: кортексин — 20 нг/мл, Т-33, АВ-0 и тимоген — 0,05 нг/мл. Для изучения экспрессии сигнальных молекул органотипические культуры фиксировали охлажденным до -20 °С 96% этиловым спиртом и проводили пермеабилизацию клеток 0,5% Tritón X-100. Для иммуноцитохимического окрашивания клеток коры головного мозга использовали первичные моноклональные антитела к Ki67 (Novo-castra, 1 : 50), p53 (Novocastra, 1 : 50), кальмоду-лину (Dako, 1 : 50), серотонину (Dako, 1 : 50) и виментину (Dako, 1 : 50),

Визуализацию иммуноцитохимической реакции в диссоциированных и органотипических культурах выполняли с применением пероксида-зы хрена и диаминобензидина («EnVision Detection System», Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse). Оценку результатов иммуноцитохимического окра-

шивания проводили морфометрическим методом на микроскопе Nikon Eclipse E400 с помощью цифровой камеры Nikon DXM1200 и программного обеспечения «Vidеotest Morphology 5.2». В дом случае анализировали 5 полей зрения при х200. Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитив-ными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Статистическую обработку экспериментальных данных выполняли в программе Statistica 7.0. Для сравнения и оценки межгрупповых различий использовали непараметрический U-критерий Манна—Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.

В опытах на диссоциированных культурах клеток коры головного мозга 14-го пассажа под действием пинеалона площадь экспрессии серотонина возрастала с 1,42 до 2,34 у. е. в культурах 3-го пассажа экспрессия серотонина под действием пинеалона не изменялась.

В органотипических культурах клеток коры головного мозга старых крыс пептид пинеалон увеличивал площадь экспрессии Ki67 и серотонина соответственно в 1,7 и 2,2 раза и не влиял на экспрессию р53, кальмодулина и виментина. Под действием кортексина площадь экспрессии маркеров Ki67 и серотонина соответственно возрастала в 1,6 и 1,7 раза по сравнению с контролем, тогда как для р53, кальмодулина и виментина данный показатель достоверно не изменялся (табл.). Пептид АВ-0 способствовал увеличению синтеза кальмодули-на в 2,2 раза по сравнению с контрольной группой, не оказывая влияния на экспрессию остальных изученных сигнальных молекул. Таким образом, пинеалон оказывает более сильный стимулирующий эффект на экспрессию сигнальных молекул в культуре клеток коры головного мозга старых животных по сравнению с кортексином.

Таблица

Влияние пептидов на экспрессию сигнальных молекул в органотипической культуре клеток

коры головного мозга старых крыс

Иммуноцитохимический маркер Группа

Контроль Т-33 кортексин АВ-0

Ki67 0,0081 ± 0,0010 0,0140 ± 0,0004* 0,0013 ± 0,0003* 0,0064 ± 0,0006*

p53 0,0015 ± 0,0003 0,0017 ± 0,0004 0,0012 ± 0,0003 0,0021 ± 0,0004

Кальмодулин 0,0010 ± 0,0005 0,0110 ± 0,0010 0,0013 ± 0,0004 0,0022 ± 0,0003*

Серотонин 0,0011 ± 0,0002 0,0024 ± 0,0003* 0,0019 ± 0,0003* 0,0014 ± 0,0004

Виментин 0,0020 ± 0,0004 0,0140 ± 0,0004 0,0010 ± 0,0003* 0,0025 ± 0,0010

*р < 0,05 — по сравнению с соответствующим показателем в контроле.

Материалы конференции

Заключение. В основе нейропротекторного действия трипептида пинеалона лежит его способность активировать экспрессию сигнальных молекул — маркеров клеточного обновления (Ю67, р53) и функциональной активности клеток коры головного мозга (кальмодулина, серотонина, ви-

ментина) в культурах клеток коры головного мозга при их старении. Вероятно, эти молекулы являются мишенями действия пинеалона, через них он реализует нейропротекторные эффекты, наблюдаемые у людей старшего возраста и спортсменов, подверженных высоким физическим нагрузкам.

Литература

1. Рыжак Г. А., Малинин В. В., Платонова Т. Н. Кортексин и регуляция функций головного мозга. — СПб.: ИКФ «Фолиант». — 2003. — 208 с.

2. Anisimov V. N., Khavinson V. Kh. Peptide bioregulation of aging: results and prospects // Biogerontology. — 2010. — № 11. — P. 139-149.

3. Khavinson V. Kh., Malinin V. V. Gerontological aspects of genome peptide regulation. — Basel (Switzerland): Karger AG. — 2005. — 104 p.

4. Хавинсон В. Х., Григорьев Е. И., Малинин В. В., Рыжак Г. А. Пептид, стимулирующий регенерацию нейронов центральной нервной системы, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения. — Патент РФ № 2301678 от 27.06.2007.

5. Хавинсон В. Х., Линькова Н. С., Трофимов A. B., Полякова В. О., Севостьянова Н. Н., Кветной И. М. Морфофункциональные основы пептидной регуляции старения // Успехи современной биологии. — 2011. — Т. 131. — № 2. — С. 115-121.

6. Балашова С. Н., Жернаков Г. Л., Дудков А. В. Применение пептидных биорегуляторов у лиц пожилого возраста с нарушениями психоэмоционального состояния // Успехи геронтологии. — 2008. — Т. 21. — № 3. — С. 448-452.

Контактная информация:

197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3. Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии;

miayy@yandex.ru, Линькова Наталья Сергеевна

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.