Молекулярные механизмы пептидной регуляции функций коры головного мозга при старении Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Материалы конференции

УДК 616.831.31-053.9:577.112.389.5

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПЕПТИДНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ СТАРЕНИИ

Н. С. Линькова, Р. С. Умнов, Е. О. Гутоп Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Санкт-Петербург, Россия

MOLECULAR MECHANISMS OF PEPTIDE REGULATION OF BRAIN FUNCTION DÜRING AGEING

N. S. Linkova, R. S. Umnov, E. O. Gutop Saint-Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, St. Petersburg, Russia

© Н. С. Линькова, Р. С. Умнов, Е. О. Гутоп, 2013 г.

Представлены данные о молекулярных мишенях нейропротекторного пептида пинеалона (Glu-Asp-Arg). Установлено, что этот пептид активирует процессы клеточного обновления (маркеры Ki67, р53) и функциональную активность нейронов (синтез серотонина, кальмодулина, виментина). Ключевые слова: трипептид, головной мозг, нейропротектор, старение.

The data of molecular targets of peptide pinealon are presented (Glu-Asp-Arg). This peptide activates cell renovation (markers Ki67, p53) and functional activity of neurons (synthesis of serotonin, calmodulin, melatonin).

Keywords: tripeptide, brain, neuroprotector, ageing.

Коррекция возрастных нарушений функциональной активности нейронов головного мозга является актуальной задачей неврологии и геронтологии [1].

Поиск новых эффективных средств лечения больных с мозговой дисфункцией особенно актуален, поскольку заболевания центральной нервной системы (ЦНС) часто встречаются у лиц пожилого и старческого возраста. Перспективной группой нейропротекторных средств являются пептидные биорегуляторы, обладающие высокой эффективностью и отсутствием побочных эффектов [2, 3]. К новому поколению нейропротекторных пептидных биорегуляторов относится трипептид пинеалон (Glu-Asp-Arg), способствующий нормализации функций коры головного мозга [4, 5]. Эффективность применения трипептида подтверждена данными комплексного исследования психоэмоционального и функционального состояния ЦНС у лиц пожилого возраста [6].

В другом исследовании проведена оценка влияния нейропротекторного трипептида на резервные возможности организма у спортсменов после воздействия высокой физической нагрузки. Спортивный стресс носит комплексный характер и включает в себя эмоциональное напряжение, физическое утомление, гипоксию и ацидоз. Известно, что систематическое избыточное накопление в организме продуктов перекисного окисления липидов стимулирует развитие в органах выраженных дистрофических и атрофических нарушений, уско-

ряя процессы старения. Установлено, что перораль-ное применение трипептида пинеалона у спортсменов способствовало улучшению показателей антиоксидантной системы.

Целью настоящего исследования явилось изучение молекулярных механизмов нейропротек-торной активности пептида пинеалона.

Материалы и методы исследования. В работе использовали первичные диссоциированные и ор-ганотипические культуры клеток коры головного мозга, полученные от крыс линии Вистар. Для создания диссоциированных культур использовали кору головного мозга молодых (3 мес) крыс. Куль-туральная среда содержала 15% фетальной бычьей сыворотки, 82,5% DMEM, 1,5% HEPES, L-глу-тамин и гентамицин. Выделение первичной культуры проводили на чашках Петри, обработанных раствором желатина («Биолот»). Последующее культивирование осуществляли во флаконах с обработанной поверхностью объемом 50 мл (JetBiofil, 25 см2, поставщик «Биолот»). Клетки выращивали в 5 мл культуральной среды на флакон и в 3 мл культуральной среды на чашку Петри диаметром 3,5 см. Первый пассаж расценивали как «молодые», а 14-й пассаж — как «старые» культуры в соответствии с рекомендацией Международной ассоциации исследований клеточных культур (США, Сан-Франциско, 2007). Культуры клеток разделяли на 3 группы: в 1-ю группу (контрольную) вводили физиологический раствор, во 2-ю группу — пептид Glu-Asp-Arg в концентрации 20 нг/мл.

Materials of conference

Для иммуноцитохимического исследования диссоциированных культур использовали первичные моноклональные антитела к серотонину (1 : 50, Dako) и вторичные антитела — биотинилированные антимышиные иммуноглобулины («Novocastra»).

Для создания органотипических культур кору головного мозга старых (24 мес) крыс разделяли на эксплантаты (фрагменты величиной около 1 мм3) и культивировали в чашках Петри в 3 мл питательной среды. Питательная среда содержала 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной телячьей сыворотки, 0,6% глюкозы, 0,5 ед./мл инсулина и 100 ед./мл гентамицина. Эксплантаты коры головного мозга и селезенки в течение 3 сут культивировали в инкубаторе при температуре 36,7 °С в условиях постоянного поступления 5% СО2. Культуры клеток коры головного мозга были разделены на 4 группы: контрольную — с введением физиологического раствора и три экспериментальные — с добавлением пептидов Т-33 (исследуемый пептид), АВ-0 (отрицательный контроль) и кор-тексина (положительный контроль). Пептиды добавляли в культуры в следующих концентрациях: кортексин — 20 нг/мл, Т-33, АВ-0 и тимоген — 0,05 нг/мл. Для изучения экспрессии сигнальных молекул органотипические культуры фиксировали охлажденным до -20 °С 96% этиловым спиртом и проводили пермеабилизацию клеток 0,5% Tritón X-100. Для иммуноцитохимического окрашивания клеток коры головного мозга использовали первичные моноклональные антитела к Ki67 (Novo-castra, 1 : 50), p53 (Novocastra, 1 : 50), кальмоду-лину (Dako, 1 : 50), серотонину (Dako, 1 : 50) и виментину (Dako, 1 : 50),

Визуализацию иммуноцитохимической реакции в диссоциированных и органотипических культурах выполняли с применением пероксида-зы хрена и диаминобензидина («EnVision Detection System», Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse). Оценку результатов иммуноцитохимического окра-

шивания проводили морфометрическим методом на микроскопе Nikon Eclipse E400 с помощью цифровой камеры Nikon DXM1200 и программного обеспечения «Vidеotest Morphology 5.2». В дом случае анализировали 5 полей зрения при х200. Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитив-ными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Статистическую обработку экспериментальных данных выполняли в программе Statistica 7.0. Для сравнения и оценки межгрупповых различий использовали непараметрический U-критерий Манна—Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.

В опытах на диссоциированных культурах клеток коры головного мозга 14-го пассажа под действием пинеалона площадь экспрессии серотонина возрастала с 1,42 до 2,34 у. е. в культурах 3-го пассажа экспрессия серотонина под действием пинеалона не изменялась.

В органотипических культурах клеток коры головного мозга старых крыс пептид пинеалон увеличивал площадь экспрессии Ki67 и серотонина соответственно в 1,7 и 2,2 раза и не влиял на экспрессию р53, кальмодулина и виментина. Под действием кортексина площадь экспрессии маркеров Ki67 и серотонина соответственно возрастала в 1,6 и 1,7 раза по сравнению с контролем, тогда как для р53, кальмодулина и виментина данный показатель достоверно не изменялся (табл.). Пептид АВ-0 способствовал увеличению синтеза кальмодули-на в 2,2 раза по сравнению с контрольной группой, не оказывая влияния на экспрессию остальных изученных сигнальных молекул. Таким образом, пинеалон оказывает более сильный стимулирующий эффект на экспрессию сигнальных молекул в культуре клеток коры головного мозга старых животных по сравнению с кортексином.

Таблица

Влияние пептидов на экспрессию сигнальных молекул в органотипической культуре клеток

коры головного мозга старых крыс

Иммуноцитохимический маркер Группа

Контроль Т-33 кортексин АВ-0

Ki67 0,0081 ± 0,0010 0,0140 ± 0,0004* 0,0013 ± 0,0003* 0,0064 ± 0,0006*

p53 0,0015 ± 0,0003 0,0017 ± 0,0004 0,0012 ± 0,0003 0,0021 ± 0,0004

Кальмодулин 0,0010 ± 0,0005 0,0110 ± 0,0010 0,0013 ± 0,0004 0,0022 ± 0,0003*

Серотонин 0,0011 ± 0,0002 0,0024 ± 0,0003* 0,0019 ± 0,0003* 0,0014 ± 0,0004

Виментин 0,0020 ± 0,0004 0,0140 ± 0,0004 0,0010 ± 0,0003* 0,0025 ± 0,0010

*р < 0,05 — по сравнению с соответствующим показателем в контроле.

Материалы конференции

Заключение. В основе нейропротекторного действия трипептида пинеалона лежит его способность активировать экспрессию сигнальных молекул — маркеров клеточного обновления (Ю67, р53) и функциональной активности клеток коры головного мозга (кальмодулина, серотонина, ви-

ментина) в культурах клеток коры головного мозга при их старении. Вероятно, эти молекулы являются мишенями действия пинеалона, через них он реализует нейропротекторные эффекты, наблюдаемые у людей старшего возраста и спортсменов, подверженных высоким физическим нагрузкам.

Литература

1. Рыжак Г. А., Малинин В. В., Платонова Т. Н. Кортексин и регуляция функций головного мозга. — СПб.: ИКФ «Фолиант». — 2003. — 208 с.

2. Anisimov V. N., Khavinson V. Kh. Peptide bioregulation of aging: results and prospects // Biogerontology. — 2010. — № 11. — P. 139-149.

3. Khavinson V. Kh., Malinin V. V. Gerontological aspects of genome peptide regulation. — Basel (Switzerland): Karger AG. — 2005. — 104 p.

4. Хавинсон В. Х., Григорьев Е. И., Малинин В. В., Рыжак Г. А. Пептид, стимулирующий регенерацию нейронов центральной нервной системы, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения. — Патент РФ № 2301678 от 27.06.2007.

5. Хавинсон В. Х., Линькова Н. С., Трофимов A. B., Полякова В. О., Севостьянова Н. Н., Кветной И. М. Морфофункциональные основы пептидной регуляции старения // Успехи современной биологии. — 2011. — Т. 131. — № 2. — С. 115-121.

6. Балашова С. Н., Жернаков Г. Л., Дудков А. В. Применение пептидных биорегуляторов у лиц пожилого возраста с нарушениями психоэмоционального состояния // Успехи геронтологии. — 2008. — Т. 21. — № 3. — С. 448-452.

Контактная информация:

197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3. Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии;

[email protected], Линькова Наталья Сергеевна