CC BY
21
УДК 547.458.88
DOI: 10.33184/bulletin-bsu-2022.1.9
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ /.-ТРИПТОФАНА С ЯБЛОЧНЫМ ПЕКТИНОМ
© Р. Х. Мударисова1*, А. А. Вакульская2, О. С. Куковинец2, С. В. Колесов1
1Уфимский институт химии УФИЦ РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 69.
2Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450017 г. Уфа, ул. Мингажева, 100.
Тел.: +7 (347) 235 55 60.
*ЕтаИ: mudarisova@anrb.ru
С привлечением методов УФ-, ИК-, ЯМР 13С -спектроскопии, поляриметрии, световой микроскопии и элементного анализа изучено комплексообразование яблочного пектина с Ь-трип-тофаном в водных растворах (рН 7.0). Определены стехиометрический состав образующегося комплекса и константы устойчивости при различных температурах. Рассчитаны стандартные термодинамические характеристики (ЛИ0; АО°; аА50) комплексообразования. Показано, что образование молекулярных комплексов состава 1:1 энтальпийно-энтропийно благоприятно. Установлено, что с ростом температуры устойчивость молекулярных комплексов уменьшается, что может быть связано с понижением прочности водородных связей. Определены термические характеристики комплексов. Обнаружено, что введение триптофана в полимерную матрицу приводит к заметному повышению термической устойчивости комплексного соединения и замедлению процесса его разложения в области температур до 500 оС.
Ключевые слова: полисахариды, пектин, Ь-триптофан, константы устойчивости, комплексообразование, термодинамические параметры.
Введение
Яблочный пектин (ПК) в числе других полисахаридов интенсивно исследуется в качестве полимерного носителя для получения лекарственных форм с коньюгированными физиологически активными соединениями [1-12]. Пектины в числе других полисахаридов рассматриваются в качестве объектов для иммобилизации незаменимых аминокислот - гистидина, валина, аланина, глицина, лизина, аргинина [13-22]. Работ, посвященных связыванию триптофана (Trp) с полисахаридами, значительно меньше [15; 23], что делает расширение круга полисахаридных носителей для этой цели актуальным.
В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение взаимодействия яблочного пектина с ¿-триптофаном и получение на их основе новых комплексных соединений для биомедицинского применения.
Экспериментальная часть
В экспериментах использовали яблочный пектин Unipectine XPP 240 (молекулярная масса 26 000 Da), степень этерификации 66%. L-триптофан марки «хч» использовали без дополнительной очистки. Спектры ЯМР 13C растворов соединений в D2O снимали на спектрометре Bruker Avance III (500 MHz). ИК-спектры соединений снимали на спектрометре Shimadzu IR-Prestige-21 в области 700-3 600 см-1 (вазелиновое масло). Величину удельного вращения соединений измеряли на поляриметре "Perkin-Elmer" (модель 141). Микроструктуру образцов определяли на электронном микро-
скопе AxioLab Pol. УФ-спектры водных растворов соединений снимали в кварцевых кюветах толщиной 1 см на спектрофотометре UV-VIS SPECORD M-40. рН растворов соединений определяли на pH-метре «АНИОН 4 100». Необходимую кислотность растворов образцов создавали растворами NaOH и НО. Термические свойства соединений определяли на приборе ТГА-ДСК ("Mettler Toledo") на воздухе при скорости нагревания 5 К/мин от 25 до 500 oC. Масса образцов составляла 5-8 мг, использовали тигли из оксида алюминия (объем 70 мкл).
Состав комплексов определяли спектрофо-тометрическим методом молярных отношений (рН 7.0) [24]. Концентрацию компонентов системы [пектин]:[триптофан] изменяли от 50:1 до 1:20. Концентрация триптофана составляла 2 10-5 моль/л, концентрация пектина изменялась от Г10"5 до 1 • 10-3 моль/л. Ионная сила составляла 0.1 моль/л, NaCl (х.ч.).
Методика получения комплекса пектин-триптофан: яблочный пектин (5.5 осново-ммоль) растворяли в 20 мл H2O. Триптофан в количестве 5.5 ммоль растворяли в 20 мл H2O (рН 7.0). Триптофан по каплям добавляли в раствор полисахарида при перемешивании и температуре 25 оС. Реакционную смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 3 ч. Комплекс высаживали этиловым спиртом и дважды переосаждали из воды в спирт. Полученный комплекс отделяли на фильтре Шотта и промывали 3 раза этиловым спиртом и диэтило-вым эфиром, далее высушивали в вакуумном шкафу при температуре 60 оС. Содержание углерода,
водорода и азота в образцах определяли на анализаторе марки EUKO EA-3000. ПК-Trp: ИК-спектр, v, см-1: 3079 (СН-Ar), 3404 (N-H^), 1667 ( C=O в СОО-), 1147-1008 (С-О,С-С), 5, см-1: 1591 (N-H); УФ-спектр, Xmax, нм: 218, 278. Найдено, %: С 51.43; Н 4.91; N 7.29. Вычислено, %: С 53.68; Н 5.26; N 7.37. a20D, (Н2О): +44±1.
Результаты и их обсуждение
Взаимодействие ПК с Trp изучалось методами УФ-, ИК-, ЯМР 13С-спектроскопии, поляриметрии, световой микроскопии и элементного анализа. В электронном спектре Trp наблюдаются две полосы поглощения Х=222 и 280 нм (рис. 1). При добавлении к водному раствору триптофана раствора полисахарида наблюдаются гиперхромный эффект и гипсохромный сдвиг полосы поглощения (ПП) аминокислоты на 2-4 нм. При изучении влияния рН растворов на взаимодействие ПК с Trp установлено, что значительные спектральные изменения начинаются с рН > 4.0, а именно - наблюдаются увеличение интенсивности ПП Trp и ее сдвиг в область меньших длин волн (рис. 2). Данные изменения в спектрах могут быть объяснены образованием комплекса полисахарид-аминокислота.
218 222 27S 2SU
Рис. 1. Электронные спектры поглощения водных растворов: ПК (1); Тгр (2); ПК-Тгр (3).
С = 2-10-5 моль/л, 1=1.0, Т=25 °С, рН 7.0, вода.
В табл. 1 представлены термодинамические параметры образования молекулярных комплексов средней устойчивости. Процесс характеризуется параметрами ЛН°<0, ЛS°>0. Незначительное положительное значение изменения энтропии показывает преобладание электростатического взаимодействия триптофана с пектином за счет участия карбок-си-аниона [25]. Видимо, в случае комплексообразо-
Константы устойчивости и '
вания ПК с Тгр вклад вносят не только электростатические силы и водородные связи, но и гидрофобные взаимодействия, поскольку для них характерно отрицательное изменение энтропии. Отрицательные значения изменения энергии Гиббса свидетельствуют о самопроизвольной реакции комплексообра-зования между триптофаном и пектином.
0 2 - 6 3 10
рН
Рис. 2. Зависимость оптической плотности от рН для водных растворов: Тгр (1), ПК-Тгр (2) С = 2-10-5 моль/л, 1=1.0, Т=25 °С, I = 278 нм.
В ИК-спектре полимерного комплекса происходит уменьшение интенсивности и низкочастотный сдвиг ПП валентных колебаний ОН-групп в области 3 150-3 600 см-1 и исчезают 1111 валентных колебаний (С=О)-групп в области 1 710-1 740 см-1 пектина. Кроме того, происходит низкочастотный сдвиг 1111 валентных колебаний (-С-О-С) пираноз-ного кольца в области 1 019-1 144 см-1. Интенсивность 1111 валентных колебаний (^Н)-групп с максимумом 3 402 см-1 уменьшается, а уширение и уменьшение интенсивности ПП валентных колебаний (с=0)-групп при 1 662 см-1 и ПП (1 610-1 557 см-1) с максимумом при 1 583 см-1 деформационных колебаний (К-Н) Тгр указывают на участие ^Н-группы индольного кольца триптофана в связывании с полисахаридом.
Формирование комплексов пектина с аминокислотой подтверждают данные ЯМР 13С спектроскопии. В спектре ЯМР 13С наблюдается сдвиг сигналов всех атомов углеродов ароматического кольца на 0.03-0.25 м.д., а также для углеродного атома карбоксильной группы триптофана на 1.13 м.д. Наблюдается также изменение химических сдвигов углеродных атомов индоль-ного кольца на 0.43 и 0.11 м.д.
Таблица 1
намические характеристики
Комплекс Т, К ЛН°, кДж/моль AS", Дж/моль-К AG°, кДж/моль
273 3.9
ПК-Trp 298 3.8 -8.2±1.0 9.5±1.0 -21.0±1.0
313 3.2
А Б
Рис. 3. Микроструктура ПК- Trp (А), Tip (Б), ПК (В).
В
Можно предположить, что взаимодействие ПК с Тгр протекает за счет азота индольного фрагмента триптофана с карбонильной группой пектина и карбокси-аниона аминокислоты с гидроксильными группами полисахарида с образованием следующего перспективного звена модифицированного биополимера:
Выводы
„о-С оос-сн-сн2
Чн_|/1-о4-
он
Выделенный комплекс ПК-Тгр представляет собой светло-желтый порошок, хорошо растворимый в воде, но нерастворимый в ацетоне, спиртах, эфире. У комплекса значительно уменьшается удельный угол вращения а20с (+44±1) в сравнении с углом вращения самого полисахарида (+180±2). Имеет место заметное изменение в структуре поверхности частиц комплекса (рис. 3).
Кривые термического анализа представлены на рис. 4. На кривой ТГ образцов можно выделить 2 стадии, которые характеризуют разложение продуктов в исследованной области температур. Видно, что введение Тгр в полимерную матрицу приводит к заметному повышению термической устойчивости полисахарида и замедлению процесса его разложения в области температур до 500 °С.
Рис. 4. Кривые ТГ порошков ПК (1), Trp (2), Trp-ПК (3).
Таким образом, комплексы яблочного пектина с триптофаном имеют мольный состав 1:1 за счет взаимодействия карбонильных и гидрокси-групп полимерной матрицы с карбоксильной группой и гетероароматическим азотом аминокислоты. Процесс комплексообразования протекает самопроизвольно, является энтальпийно-энтропийно благоприятным, сопровождается структурированием поверхности полученного материала и повышением его термической устойчивости.
Анализы выполнены на оборудовании ЦКП «Химия» УфИХ РАН и РЦКП «Агидель» УФИЦ РАН. Статья подготовлена в рамках выполнения программы ФНИ государственных академий на 2013-2020 гг. Гос. задание «Развитие фундаментальных основ управления структурой полимеров и кинетикой процесса в каталитической полимеризации, направленной модификации синтетических и биогенных полимеров и получение полимерных систем для биомедицинских приложений» №AAAA-A20-120012090024-5.
ЛИТЕРАТУРА
1. Sriamornsak P. Chemistry of pectin and its pharmaceutical uses: A review // Silpakorn University International Journal. 2003. Vol. 3. Pp. 206-228.
2. Thakur B. R., Singh R. K., Handa A. K. Chemistry and uses of pectin-a review // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 1997. Vol. 37. Pp. 47-73.
3. Noreena A., Nazlic Z., Akrama J., Rasulb I., Manshaa A., Yaqoobc N., Iqbald R., Tabasuma S., Zubera M., Ziaa K. Pectins functionalized biomaterials; a new viable approach for biomedical applications: A review // International Journal of Biological Macromolecules. 2017. Vol. 101. Pp. 254-272.
4. Кайшева Н. Ш., Кайшев А. Ш. Фармакохимические основы применения пектинов и альгинатов. Пятигорск: РИА-КМВ, 2016. 260 с.
5. Куковинец О. С., Мударисова Р. Х., Абдуллин М. И., Са-гитова А. Ф. Особенности комплексообразования яблочного пектина, модифицированного никотиновой кислотой с ионами меди (II) // Вестник Башкирского университета. 2015. Т. 20. №4. С. 1201-1205.
6. Хотимченко Ю. С., Одинцова М. В., Ковалев В. В. Поли-сорбовит. Томск: изд-во НТЛ, 2001. 132 с.
7. Маркин П. А., Попов С. В., Никитина И. Р., Оводова Р. Г., Оводов Ю. С. Противовоспалительная активность пектинов и их галактуронанового кора // Химия растительного сырья. 2010. №1. С. 21-26.
8. Куковинец О. С., Мударисова Р. Х., Володина В. П., Тарасова А. В., Мокина А. З., Абдуллин М. И. Комплексообра-зование яблочного пектина с некоторыми азот- и кислородсодержащими органическими фармакофорами // Химия природных соединений. 2014. №1. С. 48-51.
O
9. Минзанова С. Т., Чекунков Е. В., Милюков В. А., Миронова Л. Г., Хабибуллина А. В., Архипова Д. М., Самигул-лина А. И., Губайдуллин А. Т., Миронов В. Ф. Получение, состав и физико-химические свойства комплексов пектина с ибупрофеном // Доклады РАН. Химия. Науки о материалах. 2020. Т. 491. С. 49-54.
10. Василенко Ю. К., Москаленко С. В., Кайшева Н. Ш. Получение и изучение физико-химических и гепатопротек-торных свойств пектиновых веществ // Хим.-фарм. журн. 1997. №6. C. 28-29.
11. Сагитова А. Ф., Мударисова Р. Х., Куковинец О. С., Ах-метшина Л. И. Межмолекулярные взаимодействия в системе «Яблочный пектин-Ь-гистидин» // Вестник Башкирского университета. 2018. Т. 23. №2. С. 323-328.
12. Минзанова С. Т., Миронов В. Ф., Выштакалюк А. Б., Це-паева О. В., Миронова Л. Г., Рыжкина И. С., Муртази-на Л. И., Губайдуллин А. Т. Комплексы пектинового полисахарида с ацетилсалициловой кислотой // ДАН. 2013. Т. 452. №2. С. 177-180.
13. Ляпина Л. А., Оберган Т. Ю., Григорьева Н. Е., Майстрен-ко Е. С., Калугина М. Д. Сравнительные исследования анти-коагулянтных соединений гепарина с аминокислотами - ала-нином, валином и глицином // Междунар. ж-л прикладных и фундаментальных исследований. 2015. №11. С. 412-415.
14. Aree T., Arunchai R., Koonrugsa N., Intasiri A. Fluorometric and theoretical studies on inclusion complexes of b-cyclodextrin and D-, L-phenylalanine // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2012. Vol. 96. Рр. 736-743.
15. Wang Y., Han Q., Wang Yi., Qin D., Luo Q., Zhang H. Self-assembly, rheological properties and antioxidant activities of chitosan grafted with tryptophan and phenylalanine // Colloids and Surfaces A. 2020. Vol. 597. Рр. 1-7.
16. Park J. S., Han T. H., Lee K. Y., Han S. S., Hwang J. J., Moon D. H., Kim S. Y., Cho Y. W. N-acetyl histidine-conjugated glycol chitosan self-assembled nanoparticles for intracytoplasmic delivery of drugs: Endocytosis, exocytosis and drug release // Journal of Controlled Release. 2006. Vol. 115. Pp. 37-45.
17. George D., Maheswari P. U., Begum K. M. M. S. Chitosan-cellulose hydrogel conjugated with L-histidine and zinc oxide nanoparticles for sustained drug delivery: Kinetics and in-vitro biological studies // Carbohydr. Polym. 2020. Vol. 236. Рр. 116101.
18. Sang W., Tang Z., He M. Y., Hua Y. P., Xu Q. Preparation, characterization and application of the novel chitosan derivative modified with phenylalanine // Fibers and Polymers. 2015. Vol. 16. Pp. 991-996.
19. Ляпина Л. А., Оберган Т. Ю., Пасторова В. Е. Противо-свертывающие эффекты комплексного соединения аргинина с высокомолекулярным гепарином // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2009. Т. 147. №3. С. 300-303.
20. Ульянов А. М., Ляпина Л. А., Пасторова В. Е., Смолина Т. Ю. Антидиабетогенные и противосвертывающие свойства соединений гепарина с глутаминовой кислотой // Изв. РАН. Сер. Биол. 2004. №3. C. 340-344.
21. Fromm J. R., Hileman R. E., Caldwell E. E. O., Weilerand J. M., Linhardt R. J. Differences in the Interaction of Heparin with Arginine and Lysine and the Importance of these Basic Amino Acids in the Binding of Heparin to Acidic Fibro-blast Growth Factor // Archives of biochemistry and biophisics. 1995. Vol. 323. No. 2. Pр. 279-287.
22. Остахов С. С., Плечев В. В., Юнусов В. М., Ижбуль-дин Р. И., Султанбаев М. В., Кислицын А. Н., Куппее-ва Г. Х. Фотолюминесценция как метод изучения взаимодействия гепарина с деэндотелизированной поверхностью артерии // Башкирский химический журнал. 2012. Т. 19. №3. С. 139-143.
23. Lu M., Tjerneld F. Interaction between tryptophan residues and hydrophobically modified dextran. Effect on partitioning of peptides and proteins in aqueous two phase systems // Journal of Chromatography A. 1997. Vol. 766. Pр. 99-108.
24. Булатов М. И., Калинкин И. П. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа. Л.: Химия, 1986. 432 с.
25. Ross P. D., Subramanian S. Thermodynamics of protein association reactions: Forces contributing to stability // Biochemistry. 1981. Vol. 20. Pр. 3096.
Поступила в редакцию 01.07.2021 г. После доработки - 03.03.2022 г.
ISSN 1998-4812
BeciHHK EamKHpcKoro yHHBepcHTeTa. 2022. T. 27. №1
55
DOI: 10.33184/bulletin-bsu-2022.1.9
MOLECULAR COMPLEXES OF L-TRIPTOFAN WITH APPLE PECTIN
© R. Kh. Mudarisova1*, A. A. Vakulskaya2, O. S. Kukovinets2, S. V. Kolesov1
'Ufa Institute of Chemistry, Ufa Federal Research Center of RAS 71 Oktyabrya Avenue, 450054 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
2Bashkir State University 100 Mingazhev Street, 450017 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
Phone: +7 (347) 235 55 60.
*Email: mudarisova@anrb.ru
Using the methods of UV-, IR-, 13C NMR-spectroscopy, polarimetry, light microscopy, and elemental analysis, the complexation of apple pectin with L-tryptophan in aqueous solutions (pH 7.0) was studied. The stoichiometric composition of the complex formed and the stability constants at different temperatures were determined. The standard thermodynamic characteristics of complexation (AH0; AG°; AS°) were calculated. It is shown that the formation of molecular complexes of 1:1 composition is enthalpy-entropy favorable. It was found that a small negative value aAH° and a positive value AS° accompanying the binding of tryptophan with pectin are apparently due to contributions both from the electron-donor interaction of the carboxyl group of pectin with the indole system of tryptophan and from the formation of hydrogen bonds between the hydroxyl group of the polysaccharide and the carboxyl group of the amino acids. It was found that with an increase in temperature, the stability of molecular complexes decreases; this phenomenon may be associated with a decrease in the strength of hydrogen bonds. The thermal characteristics of the complexes were determined. It was found that the introduction of tryptophan into the polymer matrix leads to a noticeable increase in the thermal stability of the complex compound and slows down the process of its decomposition in the temperature range up to 500 °C.
Keywords: polysaccharides, pectin, L-tryptophan, stability constants, complex formation, thermodynamic parameters.
Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.
REFERENCES
1. Sriamornsak P. Silpakorn University International Journal. 2003. Vol. 3. Pp. 206-228.
2. Thakur B. R., Singh R. K., Handa A. K. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 1997. Vol. 37. Pp. 47-73.
3. Noreena A., Nazlic Z., Akrama J., Rasulb I., Manshaa A., Yaqoobc N., Iqbald R., Tabasuma S., Zubera M., Ziaa K. International Journal of Biological Macromolecules. 2017. Vol. 101. Pp. 254-272.
4. Kaisheva N. Sh., Kaishev A. Sh. Farmakokhimicheskie osnovy primeneniya pektinov i al'ginatov [Pharmacochemical foundations for the use of pectins and alginates]. Pyatigorsk: RIA-KMV, 2016.
5. Kukovinets O. S., Mudarisova R. Kh., Abdullin M. I., Sagitova A. F. Vestnik Bashkirskogo universiteta. 2015. Vol. 20. No. 4. Pp. 1201-1205.
6. Khotimchenko Yu. S., Odintsova M. V., Kovalev V. V. Polisorbovit [Polysorbovit]. Tomsk: izd-vo NTL, 2001.
7. Markin P. A., Popov S. V., Nikitina I. R., Ovodova R. G., Ovodov Yu. S. Khimiya rastitel'nogo syr'ya. 2010. No. 1. Pp. 21-26.
8. Kukovinets O. S., Mudarisova R. Kh., Volodina V. P., Tarasova A. V., Mokina A. Z., Abdullin M. I. Khimiya prirodnykh soedinenii. 2014. No. 1. Pp. 48-51.
9. Minzanova S. T., Chekunkov E. V., Milyukov V. A., Mironova L. G., Khabibullina A. V., Arkhipova D. M., Samigullina A. I., Gubaidullin A. T., Mironov V. F. Doklady RAN. Khimiya. Nauki o materialakh. 2020. Vol. 491. Pp. 49-54.
10. Vasilenko Yu. K., Moskalenko S. V., Kaisheva N. Sh. Khim.-farm. zhurn. 1997. No. 6. Pp. 28-29.
11. Sagitova A. F., Mudarisova R. Kh., Kukovinets O. S., Akhmetshina L. I. Vestnik Bashkirskogo universiteta. 2018. Vol. 23. No. 2. Pp. 323-328.
12. Minzanova S. T., Mironov V. F., Vyshtakalyuk A. B., Tsepaeva O. V., Mironova L. G., Ryzhkina I. S., Murtazina L. I., Gubaidullin A. T. DAN. 2013. Vol. 452. No. 2. Pp. 177-180.
13. Lyapina L. A., Obergan T. Yu., Grigor'eva N. E., Maistrenko E. S., Kalugina M. D. Mezhdunar. zh-l prikladnykh i fundamental'nykh issledovanii. 2015. No. 11. Pp. 412-415.
14. Aree T., Arunchai R., Koonrugsa N., Intasiri A. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2012. Vol. 96. Pp. 736-743.
15. Wang Y., Han Q., Wang Yi., Qin D., Luo Q., Zhang H. Colloids and Surfaces A. 2020. Vol. 597. Pp. 1-7.
16. Park J. S., Han T. H., Lee K. Y., Han S. S., Hwang J. J., Moon D. H., Kim S. Y., Cho Y. W. Journal of Controlled Release. 2006. Vol. 115. Pp. 37-45.
17. George D., Maheswari P. U., Begum K. M. M. S. Carbohydr. Polym. 2020. Vol. 236. Pp. 116101.
18. Sang W., Tang Z., He M. Y., Hua Y. P., Xu Q. Fibers and Polymers. 2015. Vol. 16. Pp. 991-996.
19. Lyapina L. A., Obergan T. Yu., Pastorova V. E. Byul. eksperim. biologii i meditsiny. 2009. Vol. 147. No. 3. Pp. 300-303.
20. Ul'yanov A. M., Lyapina L. A., Pastorova V. E., Smolina T. Yu. Izv. RAN. Ser. Biol. 2004. No. 3. Pp. 340-344.
21. Fromm J. R., Hileman R. E., Caldwell E. E. O., Weile-rand J. M., Linhardt R. J. Archives of biochemistry and biophisics. 1995. Vol. 323. No. 2. Pp. 279-287.
22. Ostakhov S. S., Plechev V. V., Yunusov V. M., Izhbul'din R. I., Sultanbaev M. V., Kislitsyn A. N., Kuppeeva G. Kh. Bashkirskii khimicheskii zhurnal. 2012. Vol. 19. No. 3. Pp. 139-143.
23. Lu M., Tjerneld F. Journal of Chromatography A. 1997. Vol. 766. Pp. 99-108.
24. Bulatov M. I., Kalinkin I. P. Prakticheskoe rukovodstvo po fotometricheskim metodam analiza [Practical guide to photometric methods of analysis]. Leningrad: Khimiya, 1986.
25. Ross P. D., Subramanian S. Biochemistry. 1981. Vol. 20. Pp. 3096.
Received 01.07.2021. Revised 03.03.2021.
