CC BY
67
Раздел - молекулярная медицина
Молекулярные и прогностические особенности глиобластом с отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A у молодых пациентов
Рыжова М.В., 1Абсалямова О.В., 1Голанов А.В., 1Пицхелаури Д.И., 2Снигирева Г.П., 3Воронина Е.И., 1Шишкина Л.В., 1Панина Т.Н., 1Шибаева И.В., 1Шугай С.В., 1Старовойтов Д.В., 1Баринов А.А., 1Сычева Р.В., 1Зубова И.В.
1ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко» Минздрава России, 125047, Москва, 4-я Тверская-Ямская, д.16 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский Научный Центр Рентгенорадиологии» МЗ РФ, 117997, Москва, ул. Профсоюзная, д. 86
ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, 630091, Сибирский федеральный округ, Новосибирская обл., г. Новосибирск, Красный проспект, д. 52 Сведения об авторах
Рыжова М.В. - д.м.н., заведующая патологоанатомическим отделением ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России
Абсалямова О.В. - к.м.н., заведующая дневным стационаром ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России
Голанов А.В. - проф., д.м.н., заведующий отделением радиологии и радиохирургии ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России
Пицхелаури Д.И. - проф., д.м.н., заведующий 7 нейрохирургическим отделением Снигирева Г.П. - д.б.н., заведующая лабораторией молекулярной биологии и цитогенетики ФГБУ «Российский Научный Центр Рентгенорадиологии» МЗ РФ
Воронина Е.И. - к.м.н., ассистент кафедры патологической анатомии ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России
Шишкина Л.В. - к.м.н., в.н.с. патологоанатомического отделения ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России
Панина Т.Н. - врач-патологоанатом патологоанатомического отделения ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России
Шибаева И.В. - медицинский лабораторный техник патологоанатомического отделения ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России
Шугай С.В. - врач-патологоанатом патологоанатомического отделения ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России
Старовойтов Д.В. - биолог патологоанатомического отделения ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России
Баринов А.А. - биолог патологоанатомического отделения ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России
Сычева Р.В. - к.б.н., биолог патологоанатомического отделения ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России
Зубова И.В. - фельдшер-лаборант патологоанатомического отделения ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России Контактное лицо
Рыжова Марина Владимировна, доктор медицинских наук, заведующая патологоанатомическим отделением ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России Адрес: 125047, 4-ая Тверская-Ямская ул., д.16, г. Москва, Россия, e-mail: mrizhova@nsi.ru ORCID:http://orcid.org/0000-0001 -7206-6365,
Снигирева Галина Петровна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией молекулярной биологии и цитогенетики ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России Адрес: 117997, ГСП-7, ул. Профсоюзная, д.86, г. Москва, Россия, e-mail: sni gal@mail.ru ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2584-802X
Резюме
Исследование посвящено изучению глиобластом у лиц молодого возраста в возрасте от 19 до 44 лет.
Цель исследования. Стратификация глиобластом у лиц молодого возраста с отсутствием мутаций (диким типом) генов ЮН/ВЕА¥/Н3¥3А.
Материалы и методы. Исследование проведено с помощью изучения структуры метилирования ДНК на уровне генома и иерархического кластерирования на серии из 91 опухоли, в геноме которых отсутствуют мутации генов ЮН/ВЕА¥/Н3¥3А. Результаты. Выявлено два молекулярных кластера, что будет иметь важное значение для дальнейшей стратификации пациентов в последующих клинических испытаниях и для изучения оптимальных альтернативных терапевтических режимов.
Заключение. Благодаря использованию сложных молекулярных методов и математического анализа, в работе показана гетерогенность глиобластом с отсутствием мутаций генов ЮН/ВЕА¥/Н3¥3А у молодых пациентов. Выявленные два молекулярных подтипа опухоли показали четкую взаимосвязь с биологическими параметрами и клиническим исходом и могут послужить предиктивным фактором ответа на стандартные протоколы лечения и возможной таргетной терапии. Однако, на сегодняшний день в условиях рутинной диагностики глиобластом по-прежнему целесообразным представляется исследование мутационного статуса генов ЮИ1/2, ВЯА¥, Н3¥3А, ТЕЯТ, ТР53, АТКХ и статуса метилирования гена ЫОЫТ.
Ключевые слова: глиобластома, мутации генов, метилирование генов, иерархическое кластерирование
Molecular and prognostic features of IDH/BRAF/H3F3A-wild type young adult glioblastomas
1 1 1 1 o 3»
Ryzhova M.V., Absalyamova O.V., Golanov A.V., Pitskhelauri D.I., Snigireva G.P., Voronina E.I., 1Shishkina L.V., 1Panina T.N., 1Shibaeva I.V., 1Shugay S.V., 1Starovoytov D.V., 1Barinov A.A., 1Sycheva R.V., 1Zubova IV.
1Federal State Autonomous Institution «N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, 125047, Moscow, The 4th Tverskaya-Yamskaya str., 16
2Federal state budgetary institution "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation (RSCRR), 117997 Moscow, Profsoyuznaya, 86
3 . .
Novosibirsk State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, 630091, Siberian Federal District, Novosibirsk Region, Novosibirsk, Krasny Avenue, 52 Authors
Ryzhova M.V. - MD, Head of Department of Neuropathogy of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery
Absalyamova O.V. - Candidate of Medical Sciences, Head of Department of Ambulance of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery
Golanov A.V. - Prof., MD, Head of Department of Radiology and Radiosurgery of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery
Pitskhelauri D.I. - Prof., MD, Head of Department of Neurosurgery of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery
Snigireva G.P. - Head of Laboratory of Molecular Biology and Cytogenetic, Federal state budgetary institution "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Voronina E.I. - Candidate of Medical Sciences, Assistant of the Department of Pathological Anatomy of Novosibirsk State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Shishkina L.V. - Candidate of Medical Sciences, Senior Researcher of Department of Neuropathogy of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery Panina T.N. - Neuropathologist of Department of Neuropathogy of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery
Shibaeva I.V. Medical Laboratory Technician of Department of Neuropathogy of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery
Shugay S.V. - Neuropathologist of Department of Neuropathogy of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery
Starovoytov D.V. - Biologist of Department of Neuropathogy of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery
Barinov A.A. - Biologist of Department of Neuropathogy of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery
Sycheva R.V. - Biologist of Department of Neuropathogy of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery
Zubova I.V. - Medical Laboratory Technician of Department of Neuropathogy of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery
Summary
In this study, we have been focused on investigations of glioblastomas in young adults aged 19 to 44 years.
Objective. In the current study, we aimed to stratify an IDH/BRAF/H3F3A wild-type young adult glioblastoma cohort assessed through genome-wide molecular profiling.
Materials and methods. Using genome-wide DNA methylation and hierarchical clustering, we have investigated a representative cohort of homogeneously treated primary 91 glioblastomas. All tumors were considered wild-type young adult glioblastomas because they showed no mutations of IDH/BRAF/H3F3A genes.
Results. Two molecular clusters have been identified that will be essential for rational stratification of wild-type young adult glioblastomas in clinical trials and for guiding optimal targeted therapeutic regimes.
Conclusion. The study demonstrates the molecular heterogeneity of IDH/BRAF/H3F3A wild-type young adult glioblastomas, as detected by global DNA methylation analyses. The recognition of two molecular subgroups of wild-type young adult glioblastomas also revealed close correlations with biological parameters and clinical outcomes that may be predictive of response to standard treatment protocols and also could be useful for definition of molecular-based therapy. However, it should be recommended, in a routine diagnosis of glioblastomas, screen mutations of the IDH1/2, BRAF, H3F3A, TERT, TP53, ATRXby direct sequencing, and MGMT methylation status. Key words: glioblastoma, genes mutations, genes methylation, hierarchical clustering
Расшифровка генов IDH/BRAF/H3F3A
IDH1 - ген IDH1, официальное название isocitrate dehydrogenase 1, синонимы - isocitrate dehydrogenase, NADP(+)-specific, solubleperoxisomal isocitrate dehydrogenase; PICDisocitrate dehydrogenase, NADP(+)-dependent, cytosolic; IDPC; ICDC, локализация 2q34 BRAF - ген BRAF, официальное название V-RAF murine sarcoma viral oncogene homolog B1, локализация 7q34
H3F3A - ген H3F3A, официальное название H3 histone, family 3A, локализация 1q42.12 Введение
Глиобластома - наиболее часто встречающаяся первичная высокозлокачественная опухоль головного мозга [12]. К сожалению, несмотря на прилагаемые усилия по изучению биологии этой опухоли и ее лечению с использованием комплексного подхода, включающего максимально безопасное хирургическое удаление опухоли с последующими облучением и химиотерапией с темозоломидом, в большинстве случаев течение заболевания
быстро приводит к летальному исходу: свыше 95 % пациентов умирают в течение первых двух лет после хирургического лечения [12, 25]. Наиболее часто глиобластомы диагностируются у людей среднего и пожилого возраста, небольшой процент (приблизительно 15 - 20 % от всех глиобластом) возникают у детей младше 18 лет или развиваются у молодых пациентов в возрасте от 18 до 45 лет [12]. На сегодняшний день хорошо известно, что глиобластомы у лиц молодого возраста имеют лучший прогноз, хотя научные данные об этом явлении достаточно скудно представлены в мировой литературе, в то время как крупные серии глиобластом у пожилых людей хорошо изучены с помощью молекулярных методов [2, 4, 18, 25]. Молекулярная классификация глиобластом, основанная на данных экспрессионного профилирования генов, наглядно продемонстрировала, что глиобластомы представляют собой гетерогенную группу опухолей с делением на пронейральную, нейральную, классическую и мезенхимальную подгруппы [4, 16, 21, 22]. Дополнительно, при использовании оценки статуса метилирования генов на уровне всего генома, была выявлена подгруппа взрослых глиобластом с так называемым «CIMP-позитивным фенотипом» - «glioma-CpG island phenotype (G-CIMP)» - «глиома с островками Цитозин-фосфат-Гуанин фенотипом». Установлено, что данная подгруппа глиобластом более всего соответствует пронейральной экспрессионной подгруппе и четко связана с мутацией гена IDH1, чувствительностью опухолевых клеток к лечению темозоломидом и более благоприятным прогнозом [18]. Молекулярная биология глиобластом у детей интенсивно исследовалась в последние пять лет, что позволило выявить присущие детским глиобластомам особенности: точковые мутации в гистоне 3.3 (H3F3A) кодонов 27 (K27) и 34 (G34) и в гистоне 3.1 (HIST1H3B/C) кодон 27 (K27), которые возникают приблизительно в половине глиобластом детского возраста [8, 9, 10, 11, 19].
На сегодняшний день исследования глиобластом по большей части сфокусированы на опухолях у детей и у взрослых старше 50 лет, в то время как данные об особенностях молекулярной биологии глиобластом у пациентов в возрасте от 18 до 45 лет в научной
литературе представлены довольно скудно [25]. Известно, что глиобластомы у лиц молодого возраста ассоциируются с относительно благоприятным прогнозом по сравнению с опухолями у детей и пациентов пожилого возраста [2, 5, 18]. Однако группа глиобластом у лиц молодого возраста представляется тоже вполне гетерогенной: случаи глиобластом-долгожителей и пациентов с короткой общей выживаемостью регистрируются у лиц молодого возраста почти с равной частотой. Более того, исследования показывают, что значительная часть (приблизительно 40 - 50%) глиобластом у лиц молодого возраста часто связаны с взаимно исключающими мутациями генов IDH, BRAF и H3F3A, которые в свою очередь имеют важное прогностическое значение, и могут получать лечение с использованием таргетной терапии [8, 9, 10, 11,].
Целями нашей текущей работы были исследование и стратификация глиобластом у лиц молодого возраста с отсутствием мутаций (диким типом) генов IDH/BRAF/H3F3A (IDH/BRAF/H3F3A wild type (wt)) с использованием молекулярных методов изучения структуры метилирования ДНК на уровне генома. Мы надеемся, что полученные нами в этой работе новые данные послужат очередной ступенью на пути к улучшению понимания молекулярной основы развития глиобластом у молодых пациентов, что, в свою очередь, позволит стратифицировать пациентов и обеспечить их более точным и подходящим лечением согласно биологической структуре этого гетерогенного заболевания. Материалы и методы
Для включения пациентов в наше исследование мы использовали следующие критерии: впервые выявленная гистологически подтвержденная глиобластома без каких-либо указаний на предшествующую глиому, возраст пациентов от 19 до 44 лет, супратенториальная локализация опухоли именно в больших полушариях, тотальное или близко к тотальному удаление опухоли по данным послеоперационных КТ и МРТ и по данным протокола операции, наличие достаточного количества материала в парафиновом
блоке для проведения молекулярного исследования опухоли и доказанное секвенированием по Сэнгеру (Sanger) отсутствие мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A.
Образцы опухолевой ткани, полученные во время нейрохирургической операции, далее фиксировались в формалине и заливались в парафиновые блоки. Парафиновые блоки были доступны для исследования у 91 пациента в возрасте от 19 до 44 лет (средний возраст пациентов был 37 лет) с гистологическим диагнозом «глиобластома WHO grade IV». Все пациенты были первично оперированы в ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России в период с 2003 по 2005 годы. Информированное согласие было получено от всех пациентов или от их законных представителей. Ни у одного из этих пациентов не было никаких клинических или нейровизуализационных признаков предшествующей глиомы. Согласно данным нейровизуализации и согласно интраоперационной картине, все опухоли были супратенториальными и поражали исключительно большие полушария. Информация о полученном пациентами комплексном лечении по поводу глиобластом известна во всех случаях: первым этапом пациенты были оперированы, во всех случаях удалось добиться тотальной или близко к тотальной резекции опухоли, далее пациенты получили лучевую терапию в СОД 58 - 59.4 Грей на ложе удаленной опухоли и адъювантную химиотерапию с темозоломидом [1]. К моменту окончания этого исследования (декабрь 2017), было известно о 78 скончавшихся пациентах (86%).
Пациенты с частичным удалением опухоли или с проведенной биопсией (стереотаксической биопсией или открытой биопсией) в исследование не включались.
Гистологические препараты были повторно пересмотрены, гистологический диагноз «глиобластома WHO grade IV» основывался на текущей классификации ВОЗ опухолей ЦНС, которая определяет глиобластому как глиому высокой степени злокачественности преимущественно с астроцитарной дифференцировкой, ядерной атипией, клеточным полиморфизмом, митотической активностью, типично характеризующейся диффузным ростом, микроваскулярной пролиферацией и/или некрозами [12].
Для всех опухолей было выполнено прямое секвенирование по Сэнгеру (Sanger) и установлено, что все опухоли представляли собой глиобластомы дикого типа IDH/BRAF/H3F3A у лиц молодого возраста, так как не имели ни одной из мутаций генов IDH1/2, BRAF и генов, кодирующих гистон 3 (H3F3A, HIST1H3A, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST2H3C). Кроме того, был проведен мутационный анализ гена TP53 и промоторной области гена TERT также методом прямого секвенирования по Сэнгеру (Sanger); мутантный протеин ATRX оценивался иммуногистохимически по потере экспрессии антитела.
Молекулярный анализ 91 глиобластомы у лиц молодого возраста с отсутствием мутаций (диким типом) генов IDH/BRAF/H3F3A проводился на платформе Illumina HumanMethylation450 BeadChip (450k). Для анализа полученных результатов метилирования ДНК применялся сложный математический и статистический анализ с помощью иерархического кластерирования. Статус метилирования области промотора гена MGMT оценивался с использованием модели логистической регрессии MGMT_STP27 [18]. Мутационный анализ, анализ метилирования ДНК на уровне генома, оценка метилирования гена MGMT и иерархическое кластерирование были выполнены на базе отделения нейропатологии Университета Хайдельберга, Германия при поддержке prof. Andrey Korshunov.
Статистический анализ
Общая выживаемость оценивалась по методу Kaplan-Meier. Под «общей выживаемостью» подразумевался временной период от даты операции до даты смерти пациента от прогрессии заболевания или до даты последнего контакта с пациентом. Безрецидивная выживаемость не оценивалась, так как подавляющее большинство больных с глиобластомами рецидивируют в течение первого года после операции.
Для мультивариантного анализа использовался метод регрессии пропорциональных рисков Кокса. Оценочные коэффициенты риска представлены 95% доверительными
интервалами и значением p из теста Вальда. Тесты с p-значением ниже 0,05 считались
значимыми.
Результаты
В исследование были включены пациенты с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A, поэтому первым этапом было проведено секвенирование по Сэнгеру (Sanger), не выявившее ни в одном случае мутаций вышеописанных генов. Кроме того, был проведен мутационный анализ гена TP53 и промоторной области гена TERT также методом прямого секвенирования по Сэнгеру (Sanger); мутации гена TP53 выявлены в 18 опухолях, мутации гена TERTp в 80 опухолях. Мутантный протеин ATRX оценивался иммуногистохимически по потере экспрессии антитела; потери экспрессии не было выявлено ни в одном случае, таким образом, мутаций гена ATRX среди 91 глиобластомы не выявлено.
Далее извлеченная из парафиновых блоков ДНК была анализирована на платформе Illumina HumanMethylation450 BeadChip (450k) для определения статуса метилирования структуры ДНК на уровне генома с последующим разделением на кластеры.
Иерархическая кластеризация выявила две подгруппы/два кластера (Рисунок 1). Кроме того, следует отметить наличие в каждом кластере двух подкластеров, что, безусловно, может послужить основой для продолжения изучения структуры метилирования ДНК на уровне генома. Данные о двух молекулярных кластерах были сопоставлены с уже имеющими данными об экспрессионном профилировании глиобластом [18] и по близости совпадения по молекулярным событиям и по аналогии, кластеры названы соответственно «MES» «мезенхимальный кластер» и «RTK» «Receptor Tyrosine Kinase кластер». Сравнительный анализ эпигенетических профилей не выявил разницы в общем уровне метилирования между двумя подгруппами.
Рисунок 1. Кластерный анализ 91 глиобластомы у лиц молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A. Анализ выявил два кластера, кластеры названы «MES» «мезенхимальный кластер» и «RTK» «Receptor Tyrosine Kinase кластер».
При сложном математическом и статистическом анализе к кластеру «MES» отнесено 38 глиобластом, в кластер «RTK» попали, соответственно, 53 глиобластомы. Для удобства кластеры маркированы цветом: «MES» красным цветом и «RTK» синим цветом, соответственно. Цветовая шкала структуры метилирования ДНК: красный цвет -метилированный участок ДНК, синий цвет - неметилированный участок ДНК. Метилированный контроль - M.Sssl-DNA (M.SssI-treated DNA), неметилированный контроль - WGA-DNA (Whole-Genome Amplified DNA). Кластерирование выполнено на основе анализа 450 тысяч CpG-островков, расположенных на чипе Illumina Infinium Human-Methylation450 BeadChip.
При сопоставлении с клиническим данными, цитогенетическими аберрациями и
мутационным статусом кластеры «MES» и «RTK» показывали совсем мало значимых
различий, за исключением амплификации гена ЕОЕЯ, добавки 19д, метилированного гена ЫОЫТ и более благоприятных показателей общей выживаемости в группе ЯТК (данные суммированы в Таблице 1).
Таблица 1. Клиническая и молекулярная характеристика 91 глиобластомы у лиц молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций генов ЮИ/ВКА¥/И3¥3А
Характеристики Все Глиобластомы Глиобластомы
глиобластомы подгруппы MES подгруппы ЯТК
(п = 91) (n = 38) (п = 53)
Средний возраст 37 37 38
Возрастной ранг 19 - 44 19 - 44 19 - 44
Пол 54/37 21/17 27/26
мужской уб. женский 59%/41% 55%/45% 51%/49%
Средняя 17 месяцев 12 месяцев* 22 месяца
общая выживаемость *p < 0.01
Мутация гена ТР 53 20% 22% 18%
Амплификация гена ЕО¥Я 57% 34%* *p < 0.01 72%
Гомозиготная делеция 63% 60% 66%
CDKN2A/В
Добавка 7 93% 91% 94%
Потеря 10д 93% 91% 95%
Добавка 19д 37% 24%* *p < 0.01 51%
Мутация гена ТЕЯТр 88% 82% 90%
Метилированный ЫОЫТ 45% 36%* 53%
*p < 0.01
Некоторые характерные для глиобластом цитогенетические аберрации (потеря 10q и добавка хромосомы 7) были обнаружены нами со сходной частотой в обоих молекулярных вариантах глиобластом у лиц молодого возраста, но гомозиготные делеции генов CDKN2A/B и добавка 19q преобладали в молекулярном варианте RTK. Более того, в молекулярном варианте RTK значительно чаще выявлялась по сравнению с молекулярным вариантом MES амплификация гена EGFR (72% vs. 34; p < 0.01). Мутации гена TP53 встречались нечасто, были обнаружены только в 20% и не показывали различий по частоте распределения по подгруппам, в то время как мутации гена TERTp (преимущественно в варианте C228T) были обнаружены в 88% исследованных опухолей, с одинаковой частотой распределяясь среди молекулярных вариантов MES и RTK. Метилирование промотора MGMT было выявлено в 41 из 91 (45%) глиобластом у лиц молодого возраста с диким типом генов IDH/BRAF/H3F3A с небольшим преобладанием в молекулярном варианте RTK.
Катамнестические данные были получены для всех пациентов (91 пациент): подавляющее большинство пациентов имели локальный рецидив в течение первого года поле операции, случаев диссеминации или метастазирования опухолей не отмечалось. За период наблюдения, составивший 72 месяца, 78 пациентов скончались (средняя общая выживаемость составила 17 месяцев; интервал от 5 до 72 месяцев).
Наше исследование глиобластом у лиц молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A позволило выявить несколько интересных закономерностей: молекулярная подгруппа RTK имеет более высокие показатели общей выживаемости по сравнению с молекулярной подгруппой MES (Рисунок 2); одновариантный анализ общей выживаемости различных клинических и молекулярных параметров в 91 глиобластоме у лиц молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A выявил, что лишь метилирование MGMT было значительно связано с
относительно благоприятным прогнозом (Рисунок 3), в то время как влияние других параметров на общую выживаемость было недостоверно.
Г1
\\
1
О 50
Время, месяцы
Рисунок 2. Анализ общей выживаемости у лиц молодого возраста с глиобластомами с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A в зависимости от подгруппы - MES глиобластомы показаны красным цветом и RTK глиобластомы показаны синим цветом соответственно (p < 0.01).
О 50
Время, месяцы
Рисунок 3. Анализ общей выживаемости у лиц молодого возраста с глиобластомами с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A в зависимости от статуса метилирования гена ЫОЫТ: красным цветом показаны глиобластомы с метилированным MGMT (metMGMT) и синим цветом показаны глиобластомы с неметилированным MGMT (unmetMGMT) соответственно ф < 0.01).
Мультивариантный анализ выявил, что статус метилирования гена ЫОЫТ и молекулярный вариант являются независимыми достоверно значимыми прогностическими маркерами относительно благоприятного клинического исхода при глиобластомах у лиц молодого возраста (р < 0.01; Таблица 2), подчеркивая прогностическое влияние предлагаемых нами молекулярных групп по сравнению с другими переменными.
Таблица 2. Результаты одновариантного и мультивариантного анализа выживаемости 91 глиобластомы у лиц молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A
Характеристики Одновариантный анализ Индекс рисков HR P Мультивариантный анализ Индекс рисков HR P
Возраст: < 40 years vs. > 40 years 0.45 0.51 1.24 0.42
Пол: мужской vs. женский 0.42 0.51 0.93 0.81
EGFR амплификация: наличие vs. отсутствие 1.92 0.12 0.91 0.76
Гомозиготная делеция CDKN2A: наличие vs. отсутствие 1.18 0.27 0.93 0.81
Мутация гена TP53: наличие vs. отсутствие 2.05 0.09 1.64 0.19
Добавка 19q: наличие vs. отсутствие 0.61 0.43 1.06 0.63
Мутация гена TERTp: наличие vs. отсутствие 1.83 0.18 0.92 0.77
MGMT: метилирован vs. немитилирован 0.21 < 0.01 0.34 < 0.01
Молекурный подтип: 10.18 < 0.01 2.88 < 0.01
Глиобластома MES vs.
Глиобластома RTK
Некоторые переменные варианты также показывали свою прогностическую значимость для молекулярных подгрупп в глиобластомах у лиц молодого возраста: так, для молекулярного варианта MES только метилирование MGMT было независимым прогностическим маркером благоприятного прогноза MGMT (Рисунок 4 и Таблица 3).
Рисунок 4. Анализ общей выживаемости у лиц молодого возраста с глиобластомами с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A подгруппы MES в зависимости от статуса метилирования гена MGMT: красным цветом показаны глиобластомы с метилированным MGMT (metMGMT) и синим цветом глиобластомы с неметилированным MGMT (unmetMGMT) соответственно (p < 0.01).
Рисунок 5. Анализ общей выживаемости у лиц молодого возраста с глиобластомами с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A подгруппы RTK в зависимости от статуса метилирования гена MGMT: красным цветом показаны глиобластомы с метилированным MGMT и синим цветом глиобластомы с неметилированным MGMT соответственно (p = 0.29).
Таблица 3. Результаты одновариантного и мультивариантного анализа выживаемости 38 глиобластом подгруппы MES у лиц молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A
Характеристики Одновариантный анализ Индекс рисков HR P Мультивариантный анализ Индекс рисков HR P
Возраст: < 40 years vs. > 40 years 1.07 0.67 1.19 0.66
Пол: мужской vs. женский 1.01 0.96 1.05 0.91
EGFR амплификация: наличие vs. отсутствие 0.57 0.44 0.61 0.36
Гомозиготная делеция CDKN2A: 0.51 0.47 0.73 0.34
наличие vs. отсутствие
Мутация гена ТР53: 1.16 0.31 1.77 0.24
наличие vs. отсутствие
Добавка 19q: наличие vs. отсутствие 0.98 0.94 0.91 0.85
Мутация гена TERTp: 1.92 0.13 0.77 0.55
наличие vs. отсутствие
ЫОЫТ: метилирован vs. 0.23 < 0.01 0.27 < 0.01
немитилирован
Удивительно, но ни статус метилирования гена MGMT, ни другие клинико-молекулярные параметры не были связаны с клиническим исходом в молекулярном варианте RTK в глиобластомах у лиц молодого возраста (Рисунок 5 и Таблица 4).
Таблица 4. Результаты одновариантного и мультивариантного анализа выживаемости 53 глиобластом подгруппы RTK у лиц молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций
генов IDH/BRAF/H3F3A
Характеристики Одновариантный анализ Индекс рисков HR P Мультивариантный анализ Индекс рисков HR P
Возраст: < 40 years vs. > 40 years 1.31 0.61 1.89 0.22
Пол: мужской vs. женский 1.01 0.98 0.65 0.29
EGFR амплификация: наличие vs. отсутствие 0.88 0.18 1.28 0.59
Гомозиготная делеция CDKN2A: 0.61 0.42 0.54 0.24
наличие vs. отсутствие
Мутация гена ТР53: 4.88 0.01 3.62 0.02
наличие vs. отсутствие
Добавка 19q: наличие vs. отсутствие 0.81 0.64 1.07 0.84
Мутация гена TERTp: 1.84 0.18 1.83 0.24
наличие vs. отсутствие
MGMT: метилирован vs. 0.52 0.29 0.43 0.12
неметилирован
Обсуждение
Изменение нынешней парадигмы лечения злокачественных глиом потребует лучшего понимания ключевых молекулярных механизмов, контролирующих эти потенциально летальные опухоли. Тем не менее, глиобластомы в возрасте от 18 до 45 лет в настоящее время изучены недостаточно полно, потому что все молекулярные исследования и усилия исследователей были сосредоточены на глиобластомах у детей или пожилых пациентов [8, 9, 10, 11, 19, 25]. С другой стороны, в предыдущих работах сообщалось, что значительная часть (около 40 - 50%) глиобластом у лиц молодого возраста часто ассоциируется с взаимоисключающими мутациями генов IDH/BRAF/H3F3A, которые, в свою очередь, имеют важное прогностическое значение [8, 9, 10, 11, 18, 19]. В отличие от хорошо известных и достаточно изученных подгрупп глиобластом с известными ключевыми повторяющими мутациями, ставшими в последнее время основным содержанием и направлением исследовательских усилий, молекулярные особенности глиобластом у лиц молодого возраста, не имеющих вышеописанных мутаций, еще только предстоит определить.
В текущей работе мы исследовали однородную серию из 91 глиобластомы у лиц
молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A. Пациенты
получили одинаковое комплексное лечение по протоколу с максимально безопасным радикальным удалением опухоли, лучевой терапией и химиотерапией с темозоломидом в качестве первой линий терапии [1]. Глиобластомы нашей серии с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A изучались с помощью анализа мутаций и метилирования ДНК на уровне генома. Подобный комплексный подход успешно применялся ранее, например, для идентификации молекулярных маркеров для клинической стратификации глиобластом у детей [18, 19]. Применяя этот подход здесь, и изучая опухоли на платформе Illumina HumanMethylation450 BeadChip (450k), позволяющей определить метилирование структуры ДНК на уровне генома, мы выявили наличие 2 молекулярных/эпигенетических подгрупп в глиобластомах у лиц молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A. Кроме того, в каждом кластере было отмечено наличие двух подкластеров, что, безусловно, является поводом для дальнейшего изучения структуры метилирования ДНК на уровне генома у этой группы пациентов. Два данных кластера оставались стабильными даже при использовании различных комбинаций дифференцированно метилированных CpG (Цитозин-фосфат-Гуанин) участков, что подтверждает гипотезу о том, что полученные данные о структуре метилирования ДНК являются надежным критерием для того, чтобы отличить молекулярные подгруппы глиобластом у лиц молодого возраста с отсутствием мутаций (диким типом) генов IDH/BRAF/H3F3A.
На основе полученных нами результатов исследования и проведенного сравнительного анализа данных по метилированию структуры ДНК на уровне генома и ранее проведенного экспрессионного профилирования генов [18] четко вырисовывается, что метиломные кластеры достаточно близко совпадают с экспрессионными профилями опухолей. Таким образом, первый метиломный кластер глиобластом у лиц молодого возраста с диким типом генов IDH/BRAF/H3 имеет поразительное сходство с «мезенхимальным» (MES) молекулярным вариантом глиобластом, второй метиломный
кластер с «классическим/RTK» (Receptor Tyrosine Kinase)» вариантом. Также следует отметить, что сравнительный анализ эпигенетических профилей не выявил разницы в общем уровне метилирования между двумя подгруппами, то есть обе группы показывали преимущественно гипометилированный фенотип.
С начала 2000 годов известно о стратификации глиобластом на основе экспрессии генов: были выделены проневральная, нейральная, классическая и мезенхимальная экспрессионные группы [4, 16, 21, 22, 24]. При анализе многочисленных публикаций становится более или менее понятно, что проневральная группа представляет собой группу глиобластом у сорокалетних людей, характеризуется отсутствием цитогенетических аберраций, мутациями генов TP53 и IDH1, гиперметилированным генотипом, ассоциацией с биологическим процессом нейрогенеза и хорошей выживаемостью. Нейральная и классическая группы показывают высокий процент амплификации гена EGFR, в то время как мезенхимальная группа связана с процессами пролиферации и ангиогенеза, характеризуется добавкой хромосомы 7, амплификацией гена EGFR, потерей хромосомы 10, делецией гена PTEN, мутацией гена NF1 и неблагоприятными показателями общей выживаемости, что вполне согласуется с нашими данными с единственным противоречием, что по данным Verhaak et al. [22] мезенхимальная группа развивается у пациентов более старшего возраста, в то время как мы обнаружили наличие мезенхимального экспрессионного профиля в глиобластомах у лиц молодого возраста и ранее в детских глиобластомах [18].
В нашем исследовании медиана общей выживаемости в серии из 91 глиобластомы у лиц молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A составила всего 17 месяцев, что вполне сопоставимо с общей выживаемостью глиобластом у пациентов старше 50 лет. Среди молекулярных характеристик только метилирование гена MGMT и молекулярные варианты опухоли были обнаружены как прогностически значимые в глиобластомах у лиц молодого возраста. Напротив, мутация гена TERTp и амплификация гена EGFR, которые выявлялись в качестве клинически значимых молекулярных маркеров в
предыдущих исследованиях, не были связаны с общей выживаемостью глиобластом у лиц молодого возраста, что может быть связано с возрастными различиями в биологии и прогностической значимости опухолей [20, 25]. Мутации гена ATRX (точнее, мутантный протеин) не были выявлены ни в одном случае из 91 опухоли, что согласуется с известным постулатом о том, что мутации гена ATRX возникают в IDH-мутантных опухолях астроцитарной дифференцировки [7].
С другой стороны, молекулярные кластеры глиобластом у лиц молодого возраста также различались по биологии и прогнозу. Опухоли, классифицируемые как RTK кластер, имели больший процент амплификаций гена EGFR с преобладанием метилированного гена MGMT и относительно благоприятными показателями общей выживаемости: 3-летняя общая выживаемость была близка к 20%, а 40% пациентов выжили в течение более чем 2 лет, в то время как MES кластер представлял собой биологически более агрессивный молекулярный вариант глиобластом у лиц молодого возраста, вполне сопоставимый в глиобластомами у пациентов старше 50 лет. Известно, что экспрессия мезенхимальных генов связана с радиорезистентностью глиобластом, плохим прогнозом и объясняется функциональной активацией генов, отвечающих за инвазивный рост опухолей и производство внеклеточного матрикса [24].
Более того, мы обнаружили, что для молекулярных вариантов у лиц молодого возраста имели прогностическое значение различные молекулярные характеристики. Например, метилирование гена MGMT было определено как независимый прогностический маркер для MES кластера, в то время как показатели общей выживаемости кластера RTK в нашем исследовании не зависели от статуса метилирования гена MGMT, что полностью опровергает данные, полученные Brennan et al. о том, что метилирование гена MGMT может являться предиктивным маркером ответа на лечение только в классическом/RTK кластере глиобластом [4]. Тем более удивительным представляется то, что текущая классификация ВОЗ опухолей ЦНС не рекомендует исследование статуса метилирования гена MGMT [12].
Результаты нашего исследования и других работ последних лет подчеркивают важную роль метилирования гена MGMT для дальнейшей стратификации молекулярной группы MES в клинических испытаниях [20, 25]. Двухлетняя выживаемость глиобластом кластера MES с неметилированным геном MGMT по данным нашей работы равна нулю, что подразумевает низкую эффективность химиотерапии на основе темозоломида и, следовательно, необходимость в альтернативной стратегии лечения, возможно, с добавлением генетических модификаторов или ингибиторов по мере их появления. Напротив, клиническое поведение глиобластом кластера RTK, получивших лечение согласно стандартным протоколам с темозоломидом, не зависит от метилирования гена MGMT, а лежащие в основе патогенеза опухоли и ответа на лечение биологические механизмы все еще неясны. Пациенты с глиобластомами кластера RTK не могут быть стратифицированы на основании статуса метилирования гена MGMT, возможно, что использование ингибиторов RTK/MAPK/mTOR (receptor tyrosine kinase RTK/mammalian target of rapamycin mTOR): препаратов второго поколения - ингибиторов RTK, ингибиторов класса I PI3K, ингибиторов mTOR киназы (TORKinibs) и двойных ингибиторов PI3(K)/mTOR (phosphatidyloinositide 3-kinases PI3(K)//mammalian target of rapamycin mTOR), могло бы послужить более рациональной альтернативой или дополнением к химиотерапии темозоломидом для этой молекулярной группы глиобластом у лиц молодого возраста [3, 6, 13, 14, 15, 17, 21]. В свою очередь, пациенты с чрезвычайно редко встречающимися глибластомами кластера RTK с мутацией гена TP53 и имеющие крайне неблагоприятный прогноз, могли бы также лечиться альтернативными режимами с применением соединений, которые изменяют конформацию гена ТР53 от мутантной до дикой (реактивация p53), либо воздействуют на клетки с мутантным геном ТР53 с помощью синтетических летальных механизмов [23].
В заключение хотелось бы подчеркнуть, что наше исследование демонстрирует молекулярную гетерогенность глиобластом у лиц молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A, выявленную с помощью изучения структуры
метилирования ДНК на уровне генома и проанализированную сложными математическими и статистическими методами. Выявление двух молекулярных кластеров в глиобластомах у лиц молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A также выявило тесную корреляцию с биологическими параметрами и клиническими результатами, которые могут иметь прогностическую значимость для ответа на стандартные протоколы лечения, а также могут быть полезны для определения необходимости и тактики молекулярной терапии. Практическое прогностическое и надежное предиктивное значение исследования глиобластом у лиц молодого возраста с диким типом и отсутствием мутаций генов IDH/BRAF/H3F3A с помощью изучения структуры метилирования ДНК на уровне генома будет иметь важное значение для дальнейшей стратификации пациентов в последующих клинических испытаниях и для изучения оптимальных альтернативных терапевтических режимов. Эти данные подчеркивают важность изучения биологии глиобластом для поиска новых терапевтических модальностей для этих агрессивных, устойчивых к лечению опухолей. Однако следует отметить, что на сегодняшний день в условиях рутинной диагностики глиобластом по прежнему целесообразным представляется исследование мутационного статуса генов IDH1/2, BRAF, H3F3A, TERT, TP53, ATRX и статуса метилирования гена MGMT.
Участие авторов
Концепция и дизайн исследования: М.В.Р., О.В.А., А.В.Г., Д.И.П., Г.П.С., Е.И.В. Сбор и обработка материала: все авторы
Статистическая обработка данных: М.В.Р., О.В.А., А.В.Г., Д.И.П., Г.П.С., Е.И.В. Написание текста: все авторы Редактирование: все авторы Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Авторы сердечно благодарят prof. Andrey Korshunov (Heidelberg, Germany) за оказанные неоценимые помощь, дружескую поддержку и ценные советы, а также за возможность проведения на базе отделения нейропатологии Хайдельберга исследований злокачественных опухолей головного мозга у детей и взрослых в рамках научного сотрудничества между ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии» Минздрава России и Университетом Хайдельберга.
Список литературы
1. Абсалямова О.В., Кобяков Г.Л., Рыжова М.В. и др. Результаты применения современных режимов химиотерапии первой линии в комплексном лечении пациентов с глиобластомой. Вопросы нейрохирургии имени Н.Н. Бурденко. 2016. Т. 80. № 6. С. 514.
2. Рыжова М.В., Шишкина Л.В., Желудкова О.Г. и др. Сравнительная характеристика генетических аберраций в глиобластомах у детей и взрослых. Вопросы нейрохирургии имени Н.Н. Бурденко. 2014. Т. 78. № 2. P. 3-11.
3. Abounader R. Interactions between PTEN and receptor tyrosine kinase pathways and their implications for glioma therapy. Expert Rev Anticancer Ther. 2009. V. 9. No. 2. P. 235-245.
4. Brennan C.W., Verhaak R.G., McKenna A., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 2013. V. 155. No. 2. P. 462-477.
5. Cantero D., Rodriguez de Lope A., Moreno de la Presa R., et al. Molecular Study of Long-Term Survivors of Glioblastoma by Gene-Targeted Next-Generation Sequencing. J Neuropathol Exp Neurol. 2018. V. 77. No. 8. P. 710-716.
6. Fan Q.W., Weiss W.A. Targeting the RTK-PBK-mTOR axis in malignant glioma: overcoming resistance. Curr Top Microbiol Immunol. 2010. V. 347. P. 279-296.
7. Hong E.K., Choi S.H., Shin D.J., et al. Radiogenomics correlation between MR imaging features and major genetic profiles in glioblastoma. Eur Radiol. 2018. V. 28. No. 10. P. 43504361.
8. Korshunov A., Ryzhova M., Hovestadt V., et al. Integrated analysis of pediatric glioblastoma reveals a subset of biologically favorable tumors with associated molecular prognostic markers. Acta Neuropathol. 2015. V. 129. No. 5. P. 669-678.
9. Korshunov A., Capper D., Reuss D., et al. Histologically distinct neuroepithelial tumors with histone 3 G34 mutation are molecularly similar and comprise a single nosologic entity. Acta Neuropathol. 2016. V. 131. No. 1. P. 137-146.
10. Korshunov A., Chavez L., Sharma T., et al. Epithelioid glioblastomas stratify into established diagnostic subsets upon integrated molecular analysis. Brain Pathol. 2018. V. 28. No. 5. P. 656-662.
11. Korshunov A., Schrimpf D., Ryzhova M., et al. H3-/IDH-wild type pediatric glioblastoma is comprised of molecularly and prognostically distinct subtypes with associated oncogenic drivers. Acta Neuropathol. 2017. V. 134. No. 3. P. 507-516.
12. Louis D.N., Ohgaki H., Wiestler O.D., Cavenee W.K. WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System. Revised 4th edition. IARC: Lyon. 2016.
13. Mathew L.K., Skuli N., Mucaj V., et al. miR-218 opposes a critical RTK-HIF pathway in mesenchymal glioblastoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014. V. 111. No. 1. P. 291-296.
14. McKay M.M., Morrison D.K. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene. 2007. V. 26. No. 22. P. 3113-3121.
15. Mellinghoff I.K., Schultz N., Mischel P.S., Cloughesy T.F. Will kinase inhibitors make it as glioblastoma drugs? Curr Top Microbiol Immunol. 2012. V. 355. P. 135-169.
16. Phillips H.S., Kharbanda S., Chen R., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 2006. V. 9. No. 3. P. 157-173.
17. Qazi M.A., Vora P., Venugopal C., et al. Co-targeting ephrin receptor tyrosine kinases A2 and A3 in cancer stem cells reduces growth of recurrent glioblastoma. Cancer Res. 2018. V. 78. No. 17. P. 5023-5037.
18. Sturm D., Witt H., Hovestadt V., et al. Hotspot mutations in H3F3A and IDH1 define distinct epigenetic and biological subgroups of glioblastoma. Cancer Cell. 2012. V. 22. No. 4. P. 425437.
19. Schwartzentruber J., Korshunov A., Liu X.Y., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 2012. V. 482. No. 7384. P. 226-231.
20. Shu C., Wang Q., Yan X., Wang J. The TERT promoter mutation status and MGMT promoter methylation status, combined with dichotomized MRI-derived and clinical features, predict adult primary glioblastoma survival. Cancer Med. 2018. V. 7. No. 8. P. 3704-3712.
21. Shen.R., Mo Q., Schultz N., et al. Integrative subtype discovery in glioblastoma using iCluster. PLoS One. 2012. V. 7. No. 4. e35236.
22. Verhaak R.G., Hoadley K.A., Purdom E., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 2010. V. 17. No. 1. P. 98-110.
23. Wang Z., Sun Y. Targeting p53 for Novel Anticancer Therapy. Transl Oncol. 2010.V. 3. No. 1. P. 1-12.
24. Xu X, Bao Z., Liu Y., et al. PBX3/MEK/ERK1/2/LIN28/let-7b positive feedback loop enhances mesenchymal phenotype to promote glioblastoma migration and invasion. J Exp Clin Cancer Res. 2018. V. 37. No. 1. P. 158.
25. Zhao Y.H., Wang Z.F., Cao C.J., et al. The Clinical Significance of O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase Promoter Methylation Status in Adult Patients With Glioblastoma: A Metaanalysis. Front Neurol. 2018. V. 9. P. 127.
