CC BY
8
© САЛМИН В. В., ПЕРЕВЕРТОВ Т. А., МУРАДЯН Г. А., ГУДКОВА Е. С., ЭПОВА А. С., КУТЯКОВ В. А., ЛЫЧКОВСКАЯ Е. В., ЧЕКИШЕВА Т. Н.,
МАЛИНОВСКАЯ Н. А., МЕДВЕДЕВА Н. Н., МАКАРЕНКО Т. А., САЛМИНА А. Б.
УДК 618.1-089, 57.043, 57.044
DOI: 10.20333/25000136-2022-4-73-82
Молекулярные эффекты плазменной кислоты на ткани капсулы эндометриомы яичника
В. В. Салмин1, Т. А. Перевертов1, Г. А. Мурадян1, Е. С. Гудкова2, А. С. Эпова1, В. А. Кутяков1,3, Е. В. Лычковская1, Т. Н. Чекишева1, Н. А. Малиновская1, Н. Н. Медведева1, Т. А. Макаренко1, А. Б. Салмина1,4
1 Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого, Красноярск 660022, Российская Федерация
2 Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет, Санкт-Петербург 194100, Российская Федерация
3 Красноярское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы, Красноярск 660049, Российская Федерация
4 Научный центр неврологии, Москва 125367, Российская Федерация
Цель исследования. Изучить молекулярные эффекты при воздействии воды, обработанной плазмой искрового разряда на ткани стенки кисты эндометриомы яичника in vitro.
Материал и методы. Ткани капсулы эндометриоидной кисты яичника, полученные в ходе оперативного лечения женщин лапароскопическим доступом, инкубировались в различных режимах в плазменной кислоте, этаноле и физиологическом растворе при комнатной температуре. Плазменная кислота получалась путем обработки воды для инъекций плазмой искрового разряда до снижения pH < 2.0. После проведенного им-муногистохимического исследования препаратов проводился сравнительный анализ абляционного и апоптогенного действия методом TUNEL, проангиогенного действия (VEGFA), эндотелиальных прогениторных клеток (CD133), повреждения белков (NT) и ДНК (8-OHdG) и пролифе-ративной активности (Ki67) различных способов обработки с позиции потенциальной эффективности плазменной кислоты для склеротерапии эндометриомы яичника в сравнении со стандартным склерозантом - этанолом.
Результаты. В ходе исследования было продемонстрировано более выраженное абляционное и проапоптогенное действие плазменной кислоты на ткани капсулы эндометриомы яичника по сравнению с этанолом. Кроме того, было показано снижение фактора неоангиогенеза и повреждений белков активными формами азота (протективное действие) по сравнению с этанолом.
Заключение. Вода, обработанная плазмой искрового разряда, может рассматриваться как эффективная альтернатива этанола для склеротерапии эндометриомы яичника. Последовательное действие плазменной кислоты и этанола усиливает склерозирущее действие этанола. Ключевые слова: склеротерапия, эндометриома яичника, плазменная кислота, активные формы кислорода, активные формы азота, окислительный стресс.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. Для цитирования: Салмин ВВ, Перевертов ТА, Мурадян ГА, Гудкова ЕС, Эпова АС, Кутяков ВА, Лычковская ЕВ, Чекишева ТН, Малиновская НА. Медведева НН, Макаренко ТА, Салмина АБ. Молекулярные эффекты плазменной кислоты на ткани капсулы эндометриомы яичника. Сибирское медицинское обозрение. 2022;(4):73-82. DOI: 10.20333/25000136-2022-4-73-82
Molecular effects of plasma acid on the ovarian endometrioma capsule tissue
V. V. Salmin1, T. A. Perevertov1, G. A. Muradyan1, Ye. S. Gudkova2, A. S. Epova1, V. A. Kutyakov1,3, Ye.V. Lychkovskaya1, T. N. Chekisheva1, N. A. Malinovskaya1, N. N. Medvedeva1, T. A. Makarenko1, A. B. Salmina1,4
1 Prof. V. F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University, Krasnoyarsk 660022, Russian Federation
2 Saint Petersburg State Pediatric Medical University, Saint Petersburg 194100, Russian Federation
3 Krasnoyarsk Regional Bureau of Forensic Medicine, Krasnoyarsk 660049, Russian Federation
4 Scientific Center of Neurology, Moscow 125367, Russian Federation
The aim of the research. To study the molecular effects of water treated with spark-discharge plasma on tissues of the cyst wall of the ovarian endometrium in vitro.
Material and methods. Tissues of the ovarian endometrial cyst capsule obtained during the surgical treatment of women through laparoscopic access were incubated in various modes in plasma acid, ethanol and physiological solution at room temperature. Plasma acid was produced by treating water for injection with spark-discharge plasma to a decrease in pH<2.0. After the immunohistochemical study of the preparations, a comparative analysis of ablative and apoptogenic action via TUNEL was performed, as well as analysis of proangiogenic action (VEGFA), endothelial progenitor cells (CD133), protein damage (NT), DNA damage (8-OHdG) and proliferation activity (Ki67) of different treatment methods from the standpoint of potential plasma acid efficacy for sclerotherapy of ovarian endometrioma as compared to standard sclerosant: ethanol.
Results. The study has demonstrated a more pronounced ablation and pre-apoptogenic effect of plasma acid on tissues of the ovarian endometrium capsule than ethanol. In addition, a decrease in neoangiogenesis and protein damage from active forms of nitrogen (protective action) compared to ethanol was shown. Conclusion. Water treated with spark-discharge plasma can be considered an effective alternative to ethanol for ovarian endometrioma sclerotherapy. The sequential action of plasma acid and ethanol increases the sclerosing action of ethanol.
Key words: sclerotherapy, ovarian endometrium, plasma acid, active oxygen forms, active nitrogen forms, oxidative stress. Conflict of interest. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest associated with the publication of this article. Citation: Salmin VV, Perevertov TA, Muradyan GA, Gudkova YeS, Epova AS, Kutyakov VA, Lychkovskaya YeV, Chekisheva TN, Malinovskaya NA, Medvedeva NN, Makarenko TA, Salmina AB. Molecular effects of plasma acid on the ovarian endometrioma capsule tissue. Siberian Medical Review. 2022;(4):73-82. DOI: 10.20333/25000136-2022-4-73-82
Введение
Эндометриоз яичников занимает 2-е место по частоте эндометриоидных поражений женских половых органов и представлен кистами (эндометриомами) и поверхностными гетеротопиями. Эндометриомы яичников обладают выраженным токсическим действием на все структурные единицы яичника. В связи с тем, что морфологически эндометриоидные импланты в яичниках окружают плотные фиброзные сращения, которые не подвержены гормональному влиянию, консервативная терапия эндометриоза яичников не эффективна.
Однако хирургическое лечение при эндометриоид-ных кистах (в отличие от других доброкачественных новообразований яичников) сопровождается высоким процентом рецидивов и потерей овариального резерва. Цистэктомия нередко сопровождается повреждением сосудов яичников, требующим либо лигирования, либо термического гемостаза.
С целью сохранения овариального резерва в последнее время были разработаны так называемые «щадящие» хирургические методики для лечения пациенток репродуктивного возраста с эндометриомами яичников. Вполне обнадеживающие результаты связывают с использованием аргоноплазменной системы, формирующей узкую зону коагуляционного некроза и тем самым обеспечивающей минимальное повреждающее влияние на фолликулярный запас [1]. Тем не менее, хирургическое вмешательство - это всегда травма для яичника, в зависимости от используемых технологий отличающаяся лишь тяжестью повреждающего воздействия. Одним из основных критериев при анализе эффективности лечения пациенток с эндометриоидными кистами яичников считается отсутствие рецидивов новообразований [2]. Частота рецидивиов после лапароскопического лечения эндометриом составляет от 2 до 43 %. Однако низкая сохранность овариального резерва обусловливает невысокую вероятность наступления беременности в 6-месячном интервале - не более 33 %.
В последние годы большое внимание уделяется аспи-рационной терапии эндометриом с их последующим склерозированием [3, 4]. Проводится комбинированная аспирация содержимого кисты с местной инъекцией в полость кисты склерозирующего агента, например, этанола, тетрациклина, метотрексата, перекиси водорода или раствора йода в этаноле. Отличительной особенностью метода является более высокая вероятность наступления беременности в течение 6 месяцев - до 57 %. В метаанализе [3], основанном на изучении ключевых мировых источников, частота рецидивов эндометриом после лечения методом склеротерапии варьирует от 7 до 62,5 %. Такой широкий разброс частоты рецидивов ставит вопрос об оптимизации метода путем детального изучения молекулярно-кле-точных механизмов склеротерапии и поиска оптимальных составов растворов и способов их применения.
В последние годы возрастает интерес к применению неравновесной плазмы в медицинской практике. Разработан ряд методик, использующих абляционные и коагуляционные эффекты аргоновой плазмы, в том числе и гинекологии [5, 6]. Использование вместо аргона
атмосферного воздуха включает обширный круг явлений, связанных с действием активных форм азота и кислорода на биологические ткани [7, 8, 9]. Плазмохи-мические процессы с участием атмосферных газов через газово-водный интерфейс приводят к формированию плазменной кислоты в тканях и на их поверхности [10] с недостаточно изученными биологическими механизмами действия. В состав плазменной кислоты входят такие стабильные продукты, как перекись водорода (С~1 мк-моль/л) и азотная кислота (С~1 ммоль/л), а также ряд нестабильных продуктов - пероксинитрит, супероксид анион радикал, азотистая кислота, моноксид азота и др. [11]. Ряд исследований, проведенных с атмосферной неравновесной плазмой, демонстрирует ее бактерицидное и гемостатическое действие, что интересно с точки зрения возможности использования плазменной кислоты с целью склерозирования тканей, в частности, при выполнении склеротерапии эндометриомы яичника.
Целью работы является изучение эффектов действия плазменной кислоты на стенки капсулы эндометриомы яичника и сравнение их с действием базового склеро-занта - этанола.
Материал и методы
При выполнении настоящего исследования использованы следующие методические подходы: было обследовано 10 пациенток с диагнозом «эндометриоидная киста яичника». Средний возраст больных составил 29,4 года. Все больные после предварительного обследования в плановом порядке были прооперированы в следующем объеме: лапароскопия, разделение спаек, энуклеация кисты яичника. В 5 случаях дополнительно производилось иссечение эндометриоидных инфильтратов наружного генитального эндометриоза, у 1 больной дополнительно выполнена миомэктомия. У всех 10 больных до операции было получено информированное согласие на оперативное вмешательство, забор ткани кисты яичника и участие в научном исследовании. Все исследования выполнялись в соответствии с решением локального этического комитета (Протокол № 8 от 26.11.2019) на базе Красноярской межрайонной клинической больницы № 4.
У 4 больных эндометриомы были двухсторонними, у 6 больных наблюдалось поражение только одного яичника. У 4 больных эндометриома яичника (яичников) сочеталась с глубоким инфильтративным ретро-церви-кальным эндометриозом, у 3 больных - с аденомиозом, в 3 случаях - с полипами эндометрия, у 1 больной - с полипом цервикального канала, что может свидетельствовать об общности патогенетических механизмов этих патологических состояний. У всех 10 больных во время операции был констатирован спаечный процесс органов малого таза 1-Ш степени тяжести, что потребовало проведения адгезиолизиса.
У всех обследуемых пациенток гистологически диагноз эндометриоидной кисты яичника и наружного ге-нитального эндометриоза (преимущественно с локализацией в подъяичниковой ямке на стороне поражения или билатерально - при двухсторонних эндометриомах) был подтвержден. При этом в преобладающем большинстве случаев в гистологических препаратах эндометриоидных
инфильтратов определялись фрагменты фиброзной ткани с очаговым расстройством кровообращения, лимфо-лейкоцитарной инфильтрацией, наличием желез с эндометриальной выстилкой. Это свидетельствует о наличии воспалительных и фиброзных изменений в очаге эндометриоидного поражения. Капсула эндо-метриоидной кисты во всех случаях была представлена тканью с эндометриальной цитогенной стромой с очаговыми диапедезными кровоизлияниями с очаговым расстройством кровообращения и очаговыми кровоизлияниями, с отложением на поверхности капсулы ге-мосидерина (гемосидерозом). В некоторых препаратах стенка капсулы кисты была с участками склероза и гиа-линоза, на отдельных участках - атрофичная (что может свидетельствовать о давности заболевания более 1 года).
При анализе анамнеза больных до оперативного лечения было выявлено, что 8 пациенток до операции предъявляли жалобы на выраженную дисменорею, 4 -на бесплодие длительностью от 4 до 12 лет, 5 женщин -на периодические тянущие боли в гипогастрии, синдром хронических тазовых болей отмечен у 2 пациенток. Во всех 10 случаях менструации были регулярными с длительностью менструального цикла от 26 до 33 дней, продолжительностью месячных от 5 до 8 дней, в основном, умеренные, у одной больной - обильные со сгустками, приводящие к анемизации (снижение гемоглобина до 95 г/л), у 8 больных - резко болезненные (по поводу чего пациентки принимали НПВС). Из 10 больных имели беременность и роды лишь 2 пациентки, у 4 было бесплодие, 1 не жила половой жизнью, 3 в настоящий момент использовали различные методы контрацепции (2 женщины принимали КОК и 1 использовала барьерные методы). Из соматических заболеваний у 2 больных диагностирован хронический атрофический гастрит, у 2 женщин - синдром раздраженного толстого кишечника, у 1 больной - хронический цистит.
В 4-х случаях данное заболевание явилось рецидивом эндометриоидных кист, по поводу чего ранее эти больные уже были оперированы в следующем объеме: лапароскопия, энуклеация эндометриоидной кисты яичника, одна из больных была прооперирована ранее трижды по поводу эндометриоидных кист яичников. Все эти больные после первичной операции адъювант-ную медикаментозную (гормональную) терапию не получали. Одна пациентка получала неоднократные курсы противовоспалительной терапии.
На догоспитальном этапе у всех 10 больных диагноз эндометриоидной кисты был заподозрен на основании характерной ультразвуковой или рентгенологической картины при выполнении УЗИ и/или МРТ органов малого таза. По данным УЗИ, регистрировалось наличие в структуре яичника образования средней эхогенности с неровным контуром, в некоторых случаях с пристеночным компонентом повышенной эхогенности размерами от 1 до 3 мм, при ЭДК васкуляризация - 1 балл. По данным МРТ, в структуре яичника определялось кистозное образование с признаками повторных кровоизлияний с неравномерной фиброзной стенкой, средние размеры новообразования в яичнике составили 4,7 см.
У 8 из 10 обследуемых пациенток до операции был повышен уровень онкомаркера СА-125, который в среднем составлял 47,8 ЕД/мл (при норме до 35 ЕД/мл).
Во всех 10 случаях оперативное вмешательство было выполнено лапароскопическим доступом с использованием эндоскопического оборудования фирмы Karl Storz по традиционной методике («стриппинг» капсулы кисты) с последующим ушиванием яичника монокрилом (2/0). Сразу же после энуклеации в стерильных условиях капсула кисты нарезалась скальпелем на 5 отдельных фрагментов размерами 1х1 см, которые помещались в охлажденный до 40 °С физиологический раствор и транспортировались в течение 1 часа для процедуры инкубации и последующего анализа в лабораторию. Оставшаяся часть капсул эндометриом помещалась в раствор формалина и направлялась на гистологическое исследование.
Обработка тканей эндометриомы яичника, полученных от прооперированных пациенток (N=10), после предварительного взвешивания в режиме краткосрочной культуры (1 час) в плазменной кислоте и/или спирте осуществлялась по следующей методике. Были сформированы группы:
1) К-инкубация в физиологическом растворе 60 мин.;
2) С-инкубация в этаноле 95 % 60 мин.;
3) П-инкубация в плазменной кислоте 60 мин.;
4) СП- последовательная инкубация в этаноле 95 % 30 мин и плазменной кислоте 30 мин.;
5) ПС-последовательная инкубация в плазменной кислоте 30 мин и этаноле 95 % 30 мин. Обработка производилась при комнатной температуре 20 °С.
«Плазменная кислота» получалась предварительным облучением воды для инъекций искровым наносекунд-ным разрядом в емкости 50 мл с негерметичной крышкой. Искровой разряд с длиной разрядного промежутка 20 мм создавался униполярным наносекундным высоковольтным генератором импульсов с энергией импульса 0,1 Дж и напряжением 40 кВ. Оптимальный по скорости снижения pH воды режим соответствовал частоте следования импульсов 10-20 Гц. Разряд горел над поверхностью воды на расстоянии 20 мм. При выполнении 200000 имп. pH воды достигал значения 1,5. Свежеприготовленный раствор использовался для инкубации тканей.
Образцы ткани предварительно фиксировали в 10 % забуференном формалине. Затем проводили повторную вырезку фиксированного материала на станции вырезки гистологического материала и укладывали их в маркированные гистологические кассеты для дальнейшего гистологического процессинга. Вырезанные кусочки подвергали окончательной фиксации в 10% забуференном формалине в течение не менее 24 часов. После фиксации гистологические кассеты с образцами органов и тканей помещали в автоматизированный гистологический процессор Leica TP 1020, в котором ткани обезвоживались в абсолютизированном изопропиловом спирте и пропитывались парафиновой средой «Histomix». После уплотнения образцы тканей и органов заливали в блоки парафиновой средой «Histomix» на станции для заливки блоков в парафин Leica EG 1150H с охлаждающим модулем Leica EG 1150C. Из полученных парафиновых
блоков изготавливали парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм на роторном микротоме Leica RM 2235. Полученные парафиновые срезы расправляли в водяной бане Leica HI 1210, наклеивали на предметные стекла. Срезы для иммуногистохимического исследования наклеивали на стекла с полилизиновым покрытием.
Оценку экспрессии маркерных молекул (сосуди-сто-эндотелиальный фактор роста А (VEGFA), CD 133, 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин, 3-нитротирозин, Ki67) проводили согласно стандартным протоколам прямого и непрямого методов иммуногистохимии (иммунофлу-оресцентный вариант). Для этого препараты подвергали депарафинизации, далее для выявления внутриклеточных антигенов препарат подвергали пермеабилизации (постфиксации) 0,1 % тритоном Х-100 в течение 5 минут. Неспецифическая активность блокировалась при 30-минутной инкубации препаратов во влажной камере в условиях термостата с 20 мкл 10 % раствора BSA (бычий сывороточный альбумин) в PBS. Далее на препараты наносили по 20 мкл первичных антител в актуальном рабочем разведении (первичные мышиные антитела к VEGFA - ab1316, разведение 1:200, 8-гидрокси-2-дезок-сигуанозину - ab48508, разведение 1:200, 3-нитротиро-зину - ab110282, разведение 1:1000; первичные кроличьи антитела к Ki67 - ab15580, разведение 1:200, CD133 -ab 19898; все антитела производства Abcam, United Kingdom) в растворе для антител (PBS с 1 % BSA) и инкубировали их во влажной камере в холодильнике при 4 °С в течение 18 часов. После промывки в темноте на образцы наносили по 20 мкл вторичных антител в актуальном (1:1000) рабочем разведении (против мышиных первичных антител использовались вторичные козьи антитела с меткой Alexa Fluor488, ab150113; против кроличьих первичных антител использовались вторичные козьи антитела с меткой Alexa Fluor555, ab150078; все антитела производства Abcam, United Kingdom) в растворе для антител, осуществляли получасовую инкубацию при +37 °С во влажной камере. На всех этапах осуществляли 2-кратную промывку образцов инкубацией (2 минуты) с раствором PBS. Завершающим этапом было нанесение 20 мкл монтирующей жидкости (50 % глицерин в PBS) c DAPI (в концентрации 2 мкг/мл, для окрашивания ядер клеток), защищали срезы покровным стеклом, ми-кроскопировали при увеличении 175 на флуоресцентном микроскопе ZOE™ Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad, США).
Были использованы следующие метки: DAPI (синяя), 8-OHdG (зеленая), Ki67 (красная), 3-NT (зеленая), VEGFA (зеленая), СD133 (красная), а также в методе TUNEL - PI (красная), FITC (зеленая). Микрофотографирование на флуоресцентном микроскопе производилось в 5 различных полях. Каждое поле с помощью макроса в программе ImageJ разбивалось на 9 фреймов, после чего производилась ручная сортировка с выбраковкой пустых полей за пределами ткани. Далее производилось автоматическое распознавание и подсчет меток с помощью плагина в программе ImageJ [12].
Статистическая обработка полученных данных по анализу экспрессии молекул осуществлялась методом
непараметрической статистики - сравнение нескольких независимых групп (Краскела-Уоллиса) с последующим использованием модуля «сравнения средних рангов для всех групп» для попарного сравнения в пакете Statsoft Statistica 12.0.
Результаты и обсуждение
В образцах ткани эндометриоидных кист, полученных от женщин, изолированное применение in vitro воды, обработанной плазмой - плазменной кислоты, вызывает снижение количества DAPI-позитивных клеток, этот эффект сохраняется при применении in vitro спирта и воды (только в последовательности «спирт -вода», но не наоборот) (рис. 1). Известно, что снижение количества DAPI-позитивных клеток может быть связано с их утратой из образца, например вследствие гибели и отслоения, с другой стороны, редуцирование связывания DAPI c нуклеиновыми кислотами может быть вызвано пониженной проницаемостью мембраны для этого красителя [13].
Оценка количества ядер в ткани стенки кисты эндометриомы яичника методом TUNEL (рис. 2) показала, что спирт не влияет на количество ядерного материала в образцах, тогда как комбинированное со спиртом или изолированное действие плазменной кислоты, имеет своим результатом достоверное снижение этого количества, вероятно, в результате развития некроза или аноикиса (отслоения клеток) приводящих к абляции. Сопоставление обоих методов позволяет сделать вывод о более существенном абляционном действии плазменной кислоты на клетки стенки кисты по сравнению с этанолом. Такой механизм предпочтительнее, поскольку потенциальной мишенью абляции со стороны склерозирующего раствора должны быть эпителиальная выстилка кисты [1], капилляры и сосуды при сохранении внеклеточного матрикса соединительной ткани.
Рисунок 1. Количество окрашенных DAPIядер в стенке капсулы эндометриомы яичника на один фрейм при различных режимах обработки плазменной кислотой и этанолом.
Figure 1. Number of DAPI-colored nuclei in the wall of the ovarian endometrioma capsule per frame under different treatment regimens of plasma acid and ethanol.
Рисунок 2. Количество окрашенных ядер по методу TUNEL (Pi-пропидиум-йодид положительных ядер) одном фрейме при различных режимах обработки плазменной кислотой и этанолом образцов ткани стенки кисты при эндометриозе яичника.
Figure 2. The number of TUNEL (Pi-propidium-iodium-iodide of positive nuclei) colored nuclei per frame under different treatment modes of plasma acid and ethanol tissue samples of cyst wall at ovarian.
Как видно из рис. 3, этанол не демонстрирует значимого проапоптогенного действия, в то время как обработка плазмой незначительно сдвигает медианное значение, увеличивает межквартильный интервал и повышает максимальное число клеток с признаками специфичной для апоптоза фрагментации ДНК. Таким образом, можно сделать вывод, что этанол вызывает абляционное действие, а плазменная кислота - абляционное и проапоптогенное. Сочетанное действие плазменной кислоты и спирта СП усиливает проапоптоген-ный эффект.
В образцах ткани эндометриоидных кист обработка спиртом (С) приводит к значимому снижению уровня экспрессии 3-нитротирозина (NT) - маркера повреждения белков под действием активных форм азота [14] и 8-гидрокси-2-деоксигуанозина (8-OHdG) - маркера окислительного повреждения ДНК под действием активных форм кислорода [15], при этом возрастает экспрессия в клетках CD133 (маркера стволовых клеток). При действии плазменной кислоты (П) клетки экспрес-сируют меньше NT, CD133 и VEGFA, что требует дополнительного исследования, так как CD133 известен своими проангиогенными свойствами и стимуляцией экспрессии VEGF в стволовых клетках опухолей [16].
При последовательной обработке спиртом и затем плазменной кислотой (СП) значимое снижение демонстрируется только для числа Ю67-иммунопозитивных клеток (маркирует уровень пролиферативной активности). Обратная последовательность обработки (ПС) приводит к значимому снижению экспрессии VEGF и, парадоксальным образом, к росту экспрессии CD133. Вероятнее всего, изменение экспрессии CD133 во всех группах при краткосрочной инбкубации in vitro не связано с изменением его функциональной активности,
Рисунок 3. Количество окрашенных ядер по методу TUNEL (FITC-положительных ядер) в одном фрейме при различных режимах обработки плазменной кислотой и этанолом образцов ткани стенки кисты при эндоме-триозе яичника.
Figure 3. The number of TUNEL (FITC) colored nuclei in one frame under different treatment modes of plasma acid and ethanol tissue samples of cyst wall in ovarian endometriosis.
а отражает в большей степени состояние клеточного стресса, обусловленного гипоксией [17]. В таком случае, из всех тестируемых растворов именно плазменная кислота обладает наибольшим стресс-протективным эффектом на клетки по сравнению с действием спирта или его комбинации с раствором, обработанным холодной плазмой.
Примечательно, что такие эффекты тестируемых растворов демонстрируют обратную зависимость с изменением экспрессии белка Ki-67, маркирующего активно пролиферирующие клетки (рис. 4): плазменная кислота изолированно или с последующей обработкой образца спиртом проявляет очевидную тенденцию к увеличению числа Ki-67-иммунопозитивных клеток. Известно, что увеличение экспрессии Ki67 характеризует подготовку клеток к митозу [18]. В то же время, некоторые работы говорят о том, что Ki67 может быть обнаружен в неделящихся клетках, в частности, в клетках, находящихся в состоянии ареста клеточного цикла вследствие повреждения ДНК [19], кроме того, повышенная экспрессия Ki67 необходима для процессов конденсации гетерохроматина при аресте клеточного цикла [20]. С учетом того, что этот белок имеет период полужизни в клетках менее 1 часа [19], логично предположить, что увеличение количества Ю67-иммунопозитивных клеток может быть вызвано накоплением этого белка в клетках, вышедших из клеточного цикла в результате аккумуляции окислительных повреждений молекулы ДНК, однако при последующей активации системы репарации ДНК этот белок должен деградировать в клетках. Интересно, что аккумуляция Ki67 может быть зарегистрирована и в клетках в состоянии апоптоза [21], однако это не объясняет изменение числа TUNEL-положительных клеток (рис. 3) и не может быть принято в качестве
Рисунок 4. Экспрессия меток при обработке стенки эндометриодной капсулы этанолом и плазменной кислотой. Figure 4. Expression of labels in the treatment of the endometrial capsule wall with ethanol and plasma acid.
механизма изменения уровня экспрессии Ю-67 при изолированном действии плазменной кислоты. Таким образом, наиболее вероятным механизмом действия плазменной кислоты (изолированно и в комбинации со спиртом) на ткань является окислительное повреждение молекул ДНК вследствие эффектов активных форм кислорода, арест клеточного цикла и индукция апоптоза (только при совместном действии с этанолом), предположительно, в силу накопления в клетках нерепарабельных
повреждений ДНК, индукция некроза или отслоения поверхностно расположенных клеток, на фоне торможения стресс-индуцируемой экспрессии СБ133 (по сравнению с изолированным действием спирта или его применением до аппликации плазменной кислоты). Для действия спирта характерно отсутствие аккумуляции маркеров окислительного повреждения белков и ДНК, незначительное проявление стимулирующего действия спирта на процессы клеточной гибели (апоптоз, некроз)
на фоне проявления увеличения экспрессии VEGFA как маркера процессов индукции ангиогенеза. Таким образом, применение плазменной кислоты изолированно или до аппликации этанола должно способствовать более выраженному склерозирующему эффекту без последующей реализации в ткани яичника феномена ангиоге-неза или стресс-индуцируемого повреждения.
Заключение
Проведенные исследования продемонстрировали широкий спектр нетепловых механизмов действия водных растворов, обработанных неравновесной плазмой, на ткани эндометриодной капсулы, имеющих более выраженное действие по сравнению со стандартным для склеротерапии действием этанола. Результаты иммуно-гистохимических исследований показали, что водные растворы, обработанные неравновесной плазмой, обладают более выраженным апоптогенным и некрозоген-ным эффектами по сравнению с растворами этанола, однако наиболее эффективным является последовательная сочетанная обработка. Для действия воды, обработанной плазмой, характерны окислительное повреждение молекул ДНК вследствие эффектов активных форм кислорода, арест клеточного цикла и индукция апоптоза, предположительно, в силу накопления в клетках нерепа-рабельных повреждений ДНК, индукция некроза или отслоения поверхностно расположенных клеток, а также снижение экспрессии VEGF, что потенциально препятствует неоангиогенезу. Для действия спирта характерно отсутствие аккумуляции маркеров окислительного повреждения белков и ДНК, незначительное проявление стимулирующего действия спирта на процессы клеточной гибели (апоптоз, некроз) на фоне проявления спиртом его потенциально проангиогенного эффекта. Указанные факторы могут служить причиной возникающих в практике рецидивов после проведения склеротерапии этанолом. Применение плазменной кислоты является более предпочтительным и патогенетически оправданным по качеству достигаемого склерозирования.
Благодарности
Работа была выполнена с использованием ресурсной базы ЦКП МКТ КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенец-кого.
Финансирование: Работа выполнена при поддержке гранта ККФПНиНТД (договор № 1/20 от 15.05.2020 г.).
Литература /References
1. Давыдов А, Липатов Д, Камруков А, Ханин А, Пекшев А, Чакветадзе Л, Усачева О. Использование импульсного высокоинтенсивного оптического облучения и экзогенного монооксида азота в комплексном лечении больных гнойным воспалением придатков матки. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии, 2007;6(1):14-17. [Davydov A, Lipatov D, Kamrukov A, Hanin A, Pekshev A, Chakvetadze L, Usacheva O. The use of pulsed high-intensity optical radiation and exogenous nitrogen monoxide in the complex treatment of patients with purulent inflammation of the uterine appendages Questions of Gynecology , Obstetrics and Perinatology.2007;6(1):14-17. (In Russian)]
2. Давыдов А, Стрижаков А, Пекшев А, Кучухидзе С, Клиндухов И. Возможности и перспективы плазменной эндохирургии с генерацией монооксида азота при операциях на матке и ее придатках. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2002;1(2):57-60. [Davydov A, Strijakov A, Pekshev A, Kuchukhidze S, Klindukov I. Possibilities and prospects of plasma endosurgery with the generation of nitrogen monoxide during operations on the uterus and its appendages. Questions of Gynecology, Obstetrics andPerinatology.2002;1(2):57-60. (In Russian)]
3. Давыдов А, Стрижаков А, Чакветадзе Л, Шехтер А, Пекшев А, Клиндухов И. Клинико-морфологический анализ влияния на ткани матки и яичников плазматро-нов нового поколения при лапароскопических операциях. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2007;6(5):5-10. [Davydov A, Strijakov A, Chakvetadze L, Shekhter A, Pekshev A, Klindudov I. Clinical and morphological analysis of the effect of new generation plasmatrons on the tissues of the uterus and ovaries during laparoscopic operations. Questions of Gynecology, Obstetrics and Perinatology. 2007;6(5):5-10. (In Russian)]
4. Давыдов А, Чабан О. Эндометриоидные кисты (эндометриомы) яичников: риск озлокачествления, его причины и методы профилактики. Онкогинеколо-гия.2012;(2):39-48. [ Davydov A, Chaban O. Endometrioid cysts (endometriomas) of the ovaries: the risk of malignancy, its causes and methods of prevention. Onkoginekologia. 2012;(2):39-48. (In Russian)]
5. Давыдов АИ, Кучухидзе С, Шехтер А, Ханин А, Пекшев А, Панкратов В. Клиническая оценка интрао-перационного применения воздушно-плазменного потока, обогащенного монооксидом азота, при операциях на матке и ее придатках. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2004;3(4):12-17. [Davydov AI, Kuchukhidze S, Shekhter A, Khanin A, Pecshev A, Pankratov V. Clinical evaluation of intraoperative use of air-plasma flow enriched with nitrogen monoxide in operations on the uterus and its appendages. Questions Gynecology, Obstetrics and Perinatology. 2004;3(4):12-17. (In Russian)]
6. Давыдов АИ, Мусаев РД-о. Оценка овариального резерва после эндохирургических вмешательств на яичниках с использованием высоких энергий. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2011;10(3):56-63. [Davydov AI, Musaev RD-o. Assessment of ovarian reserve after endosurgical interventions on the ovaries using high energies. Questions of Gynecology, Obstetrics and Perinatolog. 2011;10(3):56-63. (In Russian)]
7. Давыдов АИ, Стрижаков АН, Чабан ОВ. Эндо-метриома или эндометриоидная киста? Как сохранить ткани яичника и избежать риска злокачественной трансформации. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2012;11(4):79-91. [Davydov AI, Strijakov AN, Chaban OV. Endometrioma or endometrioid cyst? How to preserve ovarian tissue and avoid the risk of malignant transformation Questions of Gynecology, Obstetrics and Per-inatology. 2012;11(4):79-91 (In Russian)]
8. Давыдов АИ, Чабан ОВ. Возможности и перспективы применения плазменной хирургии нового поколения при операциях на яичниках. Вопросы гинекологии,
акушерства и перинатологии. 2012;11(2):51-57. [Davydov AI, Chaban OV. Opportunities and prospects for the use of new generation plasma surgery in ovarian surgery. Questions of Gynecology, Obstetrics and Perinatology. 2012;11(2):51-57. (In Russian)]
9. Давыдов АИ, Шахламова МН, Чабан ОВ, Пиро-гова МН. Высокие хирургические энергии в оперативной гинекологии. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии.2013;12(5):75-85. [Davydov AI, Shahlamo-va MN, Chaban OV, Pirokova MN. High surgical energies in operative gynecology. Questions of Gynecology, Obstetrics and Perinatology. 2013;12(5):75-85. (In Russian)]
10. Мусаев РД.-о., Чабан ОВ, Давыдов АИ. Функциональное состояние яичников после различных методов хирургического вмешательства у больных с эндометри-оидными кистами. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2011;10(5):5-11. [Musaev RD-o, Chaban OV, Davydov AI. The functional state of the ovaries after various methods of surgical intervention in patients with endometrioid cysts. Questions of Gynecology, Obstetrics and Perinatology. 2011;10(5):5-11. (In Russian)]
11. Стрижаков АН, Давыдов АИ, Игнатко ИВ, Чур-ганова АА, Ли АБ. Оценка комплексного применения аргоноплазменной хирургии и фибринового криопре-ципитата на функциональное состояние яичников у пациенток с эндометриоидными кистами. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2016;15(6):5-11. [Strijakov AN, Davydov AI, Ignatko IV, Churganova AA, Li AB. Assessment of the complex application of argon plasma surgery and fibrin cryoprecipitate on the functional state of the ovaries in patients with endometrioid cysts. Questions of Gynecology, Obstetrics and Perinatology. 2016;15(6):5-11. (In Russian)] DOI: 10.20953/1726-1678-2016-6-5-11
12. Чабан ОВ. Влияние плазменной и электрохирургической энергий на овариальный резерв у больных с эндометриоидными кистами яичников. Первый моск. гос. мед. ун-т. им. ИМ Сеченова. 2014. [Chaban OV. Effect of plasma and electrosurgical energies on ovarian reserve in patients with endometrioid ovarian cysts. First Moscow. gos. med. uni. IM Sechenova. 2014]
13. Bafort C, Beebeejaun Y, Tomassetti C, Bosteels J, Duffy J. Laparoscopic surgery for endometriosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2020; 10. pp CD011031. DOI: 10.1002/14651858.CD011031.pub2
14. Grund KE, Storek D, Farin G. Endoscopic argon plasma coagulation (APC) first clinical experiences in flexible endoscopy. Endoscopic Surgery and Allied Technologies. 1994;2(1):42-46.
15. Калиматова Д. Эндометриомы. Проблемы овари-ального резерва. Акушерство и гинекология Санкт-Петербурга. 2019;(2): 1-30. [Kalimatova D. Problems of the ovarian reserve. Obstetrics and gynecology of St. Petersburg. 2019;(2):1-30. (In Russian)]
16. Соломатина АА, Хамзин ИЗ, Тюменцева МЮ. Влияние современных методов гемостаза на овари-альный резерв при органосохраняющих операциях на яичниках. Акушерство и гинекология: Новости. Мнения. Обучения. 2018;4(22):45-51. [Solomatina AA, Hamz-in IZ, Tyumentseva MU. The influence of modern methods
of hemostasis on the ovarian reserve during organ-preserving operations on the ovaries. Obstetrics and gynaecology: News. Opinions. Training. 2018;4(22):45-51 (In Russian)] DOI: 10.24411/2303-9698-2018-14005
17. Muzii L, Achilli C, Bergamini V, Candiani M, Gara-vaglia E, Lazzeri L, Lecce F, Maiorana A, Maneschi F, Mara-na R. Comparison between the stripping technique and the combined excisional/ablative technique for the treatment of bilateral ovarian endometriomas: a multicentre RCT. Human Reproduction. 2016;31(2):339-344. DOI: 10.1093/humrep/ dev313
18. Давыдов АИ, Чакветадзе Л, Клиндухов ИА, Бахтияров КР, Воронои СВ. Оценка морфологической структуры миометрия и миомы матки после контактного воздействия воздушно-плазменного потока. Материалы I Всероссийской конференции Проблемы женского здоровья и пути их разрешения. 2007:17-18. [Davydov AI, Chakvetadze L, Klingduv IA, Bakhtiyarov KR, Voronoi SV. Assessment of the morphological structure of myometrium and uterine fibroids after contact exposure to air-plasma flow, In the book: Materials of the 1st All-Russian Conference Problems of Women's Health and Ways of Their Solution. 2007;17-18. (In Russian)]
19. Давыдов АИ, Белоцерковцева ЛД. Диагностика и лечение доброкачественных заболевании шеики матки. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2012;11(6):74-81. [Davydov AI, Belotskivtsetseva LD. Diagnostics and treatment of benign diseases of the cervix of the uterus. Questions of Gynaecology, Obstetrics and Perinatology. 2012;11(6):74-81. (In Russian)]
20. Оловянникова Р, Макаренко Т, Лычковская Е, Гудкова Е, Мурадян Г, Медведева Н, Чекишева Т, Берд-ников С, Семичев Е, Малиновская Н. Химические механизмы действия холодной плазмы на клетки. Фундаментальная и клиническая медицина. 2020;5(4):104-116. [Olovyannikova R, Makarenko T, Lychkovskaya E, Gudko-va E, Muradyan G, Medvedeva N, Chekisheva T, Berdni-kov S, Semichev E, Malinovskaya N. Chemical mechanisms of cold plasma action on cells. Fundamental and Clinical Medicine. 2020;5(4):104-116. DOI: 10.23946/2500-07642020-5-4-104-115. (In Russian)]
21. Achkasov E, Esipov A, Pekshev A, Musailov V. Use of an Exogenous Nitric Oxide Generator for Treatment of Peritonitis. Biomedical Engineering.2018;52(1):64-67. DOI: 10.1007/s10527-018-9783-2
22. Schönebeck R. kINPen MED. Comprehensive Clinical Plasma Medicine. 2018;Springer:485-494.
23. Пискарев И. Воздействие плазмы искрового разряда на воду, физиологический раствор и раствор Хенк-са. Химия высоких энергий. 2018;52(4):331-337. [Piskarev I. Effect of spark discharge plasma on water, saline and Hanks solution. High Energy Chemistry. 2018;52(4):331-337 (In Russian)]DOI: 10.1134/S0023119318040125
24. Пискарев И. Кислотный эффект частиц плазмы и ее импульсного ультрафиолетового излучения. Химия высоких энергий. 2016;50(4):311-311. [Piskarev I. Acid effect of plasma particles and its pulsed ultraviolet radiation. High-energy Chemistry. 2016;50(4):311-311 (In Russian)] DOI: 10.7868/S002311931604015X
25. Пискарев И, Иванова И, Трофимова С, Ичет-кина А, Бурхина О. Образование пероксинитрита под действием излучения плазмы искрового разряда. Химия высоких энергий. 2014;48(3):253-253. [Piskarev I, Ivanova I, Trofimova S, Ichetkina A, Burkhina O. Peroxynite formation under the action of radiation of spark discharge plasma. High Energychemistry.2014;48(3):253-253. (In Russian)] DOI: 10.7868/S0023119714030132
26. Пискарев ИМ, Иванова И, Трофимова С, Аристова НА. Образование активных частиц при искровом электрическом разряде и их возможное использование. Химия высоких энергий. 2012;46(5):406-406. [Piskarev IM, Ivanova I, Trofimova S, Aristova NA. Formation of peroxyni-trite under the action of spark discharge plasma radiation. High Energy Chemistry. 2012;46(5):406-406. (In Russian)]
27. Иванова И, Трофимова С, Пискарев И, Ичетки-на А, Бурхина О, Сысоева В. Влияние излучения плазмы искрового разряда на модификацию белков и липидов. Фундаментальные исследования. 2013;3(1):572-575. [Ivanova I, Trofimova S, Piscarev I, Ichetkina A, Burkhina O, Sysoyeva V. Influence of radiation of spark discharge plasma on modification of proteins and lipids. Basic Research. 2013;3(1):572-575. (In Russian)]
28. Салмин ВВ, Салмина АБ, Моргун АВ. Плагин для программы imagej для подсчета флуоресцентных меток на микрофотографиях. [Salmin VV, Salmina AB, Morgun AV. Plug-in for the program imagej for counting fluorescent marks on micrographs] RU 2020612777.
29. Gellersen B, Brosens JJ. Cyclic Decidualization of the Human Endometrium in Reproductive Health and Failure. Endocrine Reviews, 2014;35(6):851-905. DOI: 10.1210/ er.2014-1045
30. Kajihara T, Tanaka K, Oguro T, Tochigi H, Prechap-anich J, Uchino S, Itakura A, Sucurovic S, Murakami K, Brosens JJ, Ishihara O. Androgens modulate the morphological characteristics of human endometrial stromal cells decidual-ized in vitro. Reproductive Sciences. 2014;21(3):372-80. DOI: 10.1177/1933719113497280.
31. Okada H, Tsuzuki T, Murata H. Decidualization of the human endometrium. Reproductive medicine and biology. 2018;17(3):220-227. DOI: 10.1002/rmb2.12088.
32. Sena CM, Leandro A, Azul L, Sei^a R, Perry G. Vascular Oxidative Stress: Impact and Therapeutic Approaches. Frontiers in Physiology. 2018;9( 1668): 1-11. DOI: 10.3389/ fphys.2018.01668.
33. Choijamts B, Jimi S, Kondo T, Naganuma Y, Mat-sumoto T, Kuroki M, Iwasaki H, Emoto M. CD133+ Cancer Stem Cell-like Cells Dine Carcinosarcoma (Malignant Mixed Mullerian Tumor). STEM CELLS. 2011; 29(10):1485-1495. DOI: 10.1002/stem.711.
34. Friel A.M, Zhang L, Curley M.D, Therrien VA, Sergent PA, Belden SE, Borger DR, Mohapatra G, Zukerberg LR, Foster R, Rueda BR. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133 positive and negative endo-metrial cancer cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 2010;8(1):147. DOI: 10.1186/1477-7827-8-147.
35. Sun Y, Yoshida T, Okabe M, Zhou K, Wang F, Soko C, Saito S, Nikaido T. Isolation of Stem-Like Cancer Cells in Primary Endometrial Cancer Using Cell Surface
Markers CD133 and CXCR4. Translational Oncology. 2017;10(6):976-987. DOI: 10.1016/j.tranon.2017.07.007.
36. Sharkey AM, Day K, McPherson A, Malik S, Licence D, Smith SK, Charnock-Jones DS. Vascular endothelial growth factor expression in human endometrium is regulated by hypoxia.The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2000;85(1):402-9. DOI: 10.1210/jcem.85.1.6229.
37. Li Z. CD133: a stem cell biomarker and beyond. Experimental hematology and oncology. 2013;2( 1): 17-17. DOI: 10.1186/2162-3619-2-17.
38. Ren QZ, Qian ZH, Jia SH, Xu ZZ. Vascular endothe-lial growth factor expression up-regulated by endometri-al ischemia in secretory phase plays an important role in endometriosis. Fertility and Sterility. 2011;95(8):2687-9. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2011.05.001.
39. Guo D, Wang Q, Li C, Wang Y, Chen X. VEGF stimulated the angiogenesis by promoting the mitochondrial functions. Oncotarget. 2017;8(44):77020-77027. DOI: 10.18632/ oncotarget.20331.
40. Valavanidis A, Vlachogianni T, Fiotakis C. 8-hy-droxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical bio-marker of oxidative stress and carcinogenesis. Journal of Environmental Science and Health. 2009;27(2): 120-39. DOI: 10.1080/10590500902885684.
41. Leon J, Sakumi K, Castillo E, Sheng Z, Oka S, Na-kabeppu Y. 8-Oxoguanine accumulation in mitochondrial DNA causes mitochondrial dysfunction and impairs neu-ritogenesis in cultured adult mouse cortical neurons under oxidative conditions. Scientific Reports. 2016;6(1):22086. DOI: 10.1038/srep22086.
42. Kao SH, Huang HC, Hsieh RH, Chen SC, Tsai MC, Tzeng CR. Oxidative damage and mitochondrial DNA mutations with endometriosis. Annals of the New York Academy of Sciences. 2005;1042(1):186-194.
43. Campolo N, Issoglio Federico M, Estrin Dario A, Bartesaghi S, Radi R. 3-Nitrotyrosine and related derivatives in proteins: precursors, radical intermediates and impact in function. Essays in Biochemistry. 2020;64(1):111-133. DOI: 10.1042/ebc20190052.
Сведения об авторах
Салмин Владимир Валерьевич, д-р физ.-мат. наук, доцент, заведующий кафедрой медицинской и биологической физики, Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого; адрес: Российская Федерация, 660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; тел.: +7(913)8326812; e-mail: vsalmin@gmail.com, http://orcid.org/0000-0003-mi-9025
Перевертов Тимофей Андреевич, студент, Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого; адрес: Российская Федерация, 660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; тел.:+7(950)9901001; e-mail: dmchernov26@mail.ru, http://orcid.org/0000-0001-6280-9233
Мурадян Гоар Аматуновна, лаборант лаборатории медицинской кибернетики и управления в здравоохранении, Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого; адрес: Российская Федерация, 660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; тел.: +7(965)905486;, e-mail muradyan.goar1@ gmail.com, http://orcid.org/0000-0002-5656-4636
Гудкова Елизавета Сергеевна, врач-ординатор по специальности «рентгенология», Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет; адрес: Российская Федерация, 194100, г. Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2; тел.: +7(913)5634813; e-mail miss.gudcova@mail.ru, http://orcid.org/0000-0002-7540-4144
Эпова Анна Сергеевна, аспирант кафедры оперативной гинекологии ИПО, Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясе-нецкого; адрес: Российская Федерация, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; тел.: +7(913)4406070; e-mail annaepova23@mail.ru, http://orcid.org/
Кутяков Виктор Андреевич, к. б. н., эксперт, Красноярское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы; адрес: Российская Федерация, 660049, Красноярск, пр. Мира, 35; доцент кафедры биологической химии с курсами медицинской,
фармацевтической и токсикологической химии, Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого; адрес: Российская Федерация, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; тел.: +7(923)5794625; e-mail victor-koutjakov@yandex.ru, http://orcid.org/0000-0001-7814-4176
Лычковская Елена Викторовна, старший преподаватель кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии. Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого; адрес: Российская Федерация, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; тел.: +7(962)0697447; e-mail lychk-elena@mail.ru, http://orcid.org/0000-0002-4017-1125
Чекишева Татьяна Николаевна, ассистент кафедры анатомии человека, Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясе-нецкого; адрес: Российская Федерация, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; тел.: +7(950)4326530; e-mail: maksi726@mail.ru, http://orcid.org/0000-0001-6905-980X
Малиновская Наталия Александровна, д. м. н., заведующий кафедрой биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого; адрес: Российская Федерация, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; тел.: +7(983)3637925; e-mail malinovskaya-na@mail.ru, http://orcid.org/0000-0002-0033-3804
Медведева Надежда Николаевна, д. м. н., проф., заведующий кафедрой анатомии человека, Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого; адрес: Российская Федерация, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; тел.: +7(923)2766388, e-mail: medvenad@mail.ru, http://orcid.org/0000-0002-7757-6628
Макаренко Татьяна Александровна, д. м. н., доцент, заведующий кафедрой оперативной гинекологии ИПО, Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого; адрес: Российская Федерация 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; тел.: +7(904)8954799; e-mail makarenko7777@ yandex.ru, http://orcid.org/0000-0002-2899-8103
Салмина Алла Борисовна, д. м. н., профессор, главный научный сотрудник, руководитель лаборатории экспериментальной нейроцитологии, отдел исследования мозга. Научный центр неврологии; адрес: Российская Федерация, 125367, г. Москва, Волоколамское шоссе, 80; Главный научный сотрудник научно-исследовательского института молекулярной медицины и патобиохимии, Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого; адрес: Российская Федерация, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; тел.: 7(913)1920624; e-mail allasalmina@mail.ru, http://orcid.org/0000-0003-4012-6348
Author information
Vladimir V. Salmin, Dr. of Phys.-Math. Sci., Associate Professor, Head of the Department of Medical and Biological Physics, Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Address: 1, Partizana Zheleznyak Str., Krasnoyarsk, Russian Federation 660022; Phone: +7 (913) 8326812, e-mail vsalmin@gmail.com, http://orcid.org/0000-0003-4441-9025
Timofey A. Perevertov, student. Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Address: 1, Partizana Zheleznyak Str., Krasnoyarsk, Russian Federation 660022; Phone: +7 (950) 990100; e-mail dmchernov26@mail.ru, http://orcid.org/0000-0001-6280-9233
Goar A. Muradyan, Laboratory Assistant, Laboratory of Medical Cybernetics and Healthcare Management, Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Address: 1, Partizana Zheleznyak Str., Krasnoyarsk, Russian Federation660022; Phone: +7 (965) 9054864; e-mail muradyan.goar1@gmail.com, http://orcid.org/0000- 0002-5656-4636
Elizaveta S. Gudkova, resident physician with a degree in radiology, St. Petersburg State Pediatric Medical University; Address: 2, Litovskaya Str., St. Petersburg, Russian Federation194100; Phone +7 (913) 5634813; e-mail miss.gudcova@mail.ru, http://orcid. org/0000-0002-7540-4144
Anna S. Epova, postgraduate student of the Department of Operative Gynecology, IPO, Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Address: 1, Partizana Zheleznyak Str., Krasnoyarsk, Russian Federation 660022; Phone:+7 (913) 4406070; e-mail annaepova23@mail.ru, http://orcid.org/
Viktor A. Kutyakov, Cand. of Biol. Sci., expert, Krasnoyarsk Regional Bureau of Forensic Medicine; Address: 35, Mira Avenue, Krasnoyarsk, Russian Federation 660049; Associate Professor of the Department of Biological Chemistry with courses in medical, pharmaceutical and toxicological chemistry; Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Address: 1, Partizana Zheleznyak Str., Krasnoyarsk, Russian Federation 660022; Phone: +7 (923) 5794625; e-mail victor-koutjakov@yandex.ru, http://orcid.org/0000-0001-7814-4176
Elena V. Lychkovskaya, senior lecturer of the Department of Biological Chemistry with courses in medical, pharmaceutical and toxicological chemistry; Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Address: 1, Partizana Zheleznyak Str., Krasnoyarsk, Russian Federation 660022; Phone: +7 (962) 0697447; e-mail lychk-elena@mail.ru, http://orcid.org/0000-0002-4017-1125
Tatyana N. Chekisheva, Assistant of the Department of Human Anatomy, Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Address: 1, Partizana Zheleznyak Str., Krasnoyarsk, Russian Federation 660022; Phone: +7 (950) 4326530; e-mail maksi726@mail.ru, http://orcid.org/0000-0001-6905-980X
Natalia A. Malinovskaya, Dr. Med. Sci., Head of the Department of Biological Chemistry with courses in medical, pharmaceutical and toxicological chemistry, Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Address: 1, Partizana Zheleznyak Str., Krasnoyarsk, Russian Federation 660022; Phone:+7 (983) 3637925; e-mail malinovskaya-na@mail.ru, http://orcid.org/0000-0002-0033-3804
Nadezhda N. Medvedeva, Dr. Med. Sci., Professor, Head of the Department of Human Anatomy, Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Address: 1, Partizana Zheleznyak Str., Krasnoyarsk, Russian Federation 660022; Phone: +7 (923) 2766388; e-mail medvenad@mail.ru, http://orcid.org/0000-0002-7757-6628
Tatiana A. Makarenko, Dr. Med. Sci., Associate Professor, Head of the Department of Operative Gynecology, IPO, Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Address: 1, Partizana Zheleznyak Str., Krasnoyarsk, Russian Federation 660022; Phone: +7 (904) 8954799; e-mail makarenko7777@yandex.ru, http://orcid.org/0000-0002-2899-8103
Alla B. Salmina, Dr. Med. Sci., Professor, Chief Researcher, Head of the Laboratory of Experimental Neurocytology, Brain Research Department. Scientific Center of Neurology; Address: 80, Volokolamskoe Highway, Moscow, Russian Federation 125367; Chief Researcher, Research Institute of Molecular Medicine and Pathobiochemistry, Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Address: 1, Partizana Zheleznyak Str., Krasnoyarsk, Russian Federation 660022; Phone: 7 (913) 1920624; e-mail allasalmina@mail.ru, http://orcid. org/0000-0003-4012-6348
Дата поступления 28.10.2021 Дата рецензирования 16.04.2022 Принята к печати 30.05.2022
Received 28 October 2021 Revision Received 16 April 2022 Accepted 30 May 2022
