CC BY
83
2003
Известия ТИНРО
Том 133
УДК 628.394
О.Н.Лукьянова
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ БИОМАРКЕРЫ В ЭКОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ МОРСКИХ ЭКОСИСТЕМ
Приводятся современные литературные данные об основных классах приоритетных загрязнителей морской среды. Особое внимание уделено персистент-ным углеводородам, представляющим особую опасность для гидробионтов вследствие разнообразных биологических эффектов. Среди многочисленных молекулярных биомаркеров, используемых в современных программах мониторинга, наибольший интерес представляет определение активности фермента этоксирезору-фин-О-диэтилазы (EROD), характеризующего влияние различных типов органических загрязнителей при остром и хроническом воздействии. Изменение репродуктивной системы рыб происходит под влиянием ксеноэстрогенов — органических веществ, сходных по строению с половыми гормонами. Молекулярным биомаркером этого типа загрязнения является появление вителлогенина — предшественника запасных питательных белков яйцеклеток — в плазме крови самцов. В результате особи приобретают свойства интерсексов, что приводит к изменению половой структуры популяций. Молекулярные биомаркеры свидетельствуют о самых ранних изменениях метаболизма гидробионтов, что позволяет не только контролировать, но и прогнозировать состояние организмов при действии загрязнения.
Lukyanova O.N. Molecular biomarkers in ecological monitoring of marine ecosystems // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 133. — P. 271-281.
Recent cited data concerning the main classes of marine environmental pollutants and their biomarkers are reviewed. Persistent chlororganic hydrocarbons are described in detail due to their harmful effect to hydrobionts. Ethoxyresorufine-O-deethylase (EROD) is the very important molecular biomarker using in monitoring program. The activity if this enzyme characterizes the effect of organic compounds on marine organisms under short time and chronic influences. EROD properties in marine fish are described. The structure of other class of organic biomarkers, so called xenoestrogens, is similar to steroid hormones. These substances can disturb reproductive system of fish. In this case, vitellogenin — a precursor protein of egg yolk, is detected both in female and male fish. As result, the fish gonads have the features of male and female simultaneously, so the population structure changes. Molecular biomarkers allow us to control and, moreover, to predict the state of animals in polluted areas.
В современных программах экологического мониторинга большое внимание уделяется молекулярным биомаркерам — биохимическим показателям состояния организмов в природных экосистемах. Это относится как к наземным видам, так и к гидробионтам, и к последним даже в большей степени, поскольку водные и в особенности морские экосистемы являются конечными "накопителями" загрязняющих веществ. В настоящее время биомаркеры определяют как количественные показатели, измеряемые в полостных жидкостях, клетках или
тканях, которые на биохимическом или клеточном уровне указывают на присутствие загрязнителя и/ или величину ответной реакции организма (McCarty, S hugart, 1990). Молекулярные биомаркеры имеют преимущества в сравнении как с химическим анализом уровня токсиканта в организме, так и с методами биотестирования. Химический анализ может определить наличие загрязнителя в организме, но ничего не скажет о его биологическом эффекте. Биотестирование дает информацию об относительной токсичности отдельных веществ и имеет дело всегда с ограниченным числом тест-объектов. Биомаркеры применимы для любых живых систем и свидетельствуют в первую очередь о взаимодействии организма и токсиканта. Разработка биомаркеров включает в себя эксперименты для определения первичного ответа организма и установления причинных механизмов данной реакции с последующим применением к полевым условиям (Livingstone, 1993).
С начала 1990-х гг. особое значение приобрели биомаркеры, характеризующие биотрансформацию органических загрязняющих веществ природного и искусственного происхождения. Эти соединения в настоящее время признаются наиболее опасными по широте распространения и степени воздействия на живые организмы. К ним относятся различные полиароматические и полихлориро-ванные углеводороды, такие как ДДТ и его метаболиты, гексахлорциклогексан (ГХЦГ) и его изомеры, полихлорированные бифенилы, продукты деградации нефти, переработки древесины и многие другие. В последние годы к ним добавились такие классы, как органические соединения олова (Adelman et al., 1990; Fent, Stegeman, 1991; Choi et al., 1993) и различные алкилфенолэтоксилаты и продукты их распада (Matozzo et al., 2003).
Хлорированные углеводороды. Среди органических поллютантов наиболее устойчивы к действию различных факторов среды хлорированные соединения, которые хорошо известны своей высокой токсичностью, способностью накапливаться в органах живых организмов и передаваться по пищевой цепи. Основными источниками их поступления в экосистемы остаются сельское хозяйство, отходы химической, целлюлозно-бумажной промышленности, машиностроения, нефтепереработки. Липофильные по своей химической природе, эти вещества поступают в водные экосистемы при аэральном переносе или путем адгезии на частицах взвеси.
Вследствие огромных масштабов производства и широкого применения они обнаружены в абиотической и биотической компонентах экосистем различных стран мира, несмотря на то что применение их в сельском хозяйстве разрешено в настоящее время только в некоторых развивающихся странах Юго-Восточной Азии и Африки. В Юго-Восточной Азии наивысшие концентрации ДДТ в мидиях (как сумма изомеров ДДТ + ДДД + ДДЕ) обнаружены в Гонконге (свыше 1000 нг/г сырой массы), Вьетнаме, Таиланде, Камбодже, Индии, в южных областях Китая, тогда как в Японии и вблизи Владивостока это значение составляло около 15-20 нг/г (Monirith et al., 2000). В отличие от ДДТ, концентрации поли-хлорированных бифенилов (ПХБ) были значительно выше в Японии и в районе Владивостока (70-75 нг/г), чем в южных регионах. Органические комплексы олова присутствуют вблизи практически всех крупных морских портов в различных странах АТР, особенно в Южной Корее и в Японии, но обнаружены также и вблизи Владивостока — около 500 нг/г (Tanabe, 2002).
Следует помнить, что в тропическом климате, с его высокими температурами и повышенной влажностью, легче происходит испарение ксенобиотиков из почвы в атмосферу и их воздушный перенос на любые расстояния. Вследствие глобальной циркуляции атмосферы они перемещаются в более умеренные зоны и обнаруживаются даже в полярных областях, в морях Арктики и Антарктики. Этот же механизм приводит к тому, что значительное содержание ксенобиотиков обнаружено не только в прибрежных зонах, но и в поверхностных водах
открытых морей. Все эти изменения глобального распределения ксенобиотиков приводят к их появлению в тех районах мира, где производство и применение этих веществ минимально.
Существует обширная литература, посвященная биологическим эффектам подобных соединений на морские организмы, в частности на моллюсков и рыб (Porte et al., 2001; Cheung et al., 2002; Corsi et al., 2003). В настоящее время особое внимание уделяется накоплению подобных персистентных (устойчивых) соединений у организмов высших трофических уровней — птиц и морских млекопитающих.
О масштабах органического загрязнения в водных экосистемах можно судить и по тем фактам, что если в 1960 г. у 81 особи морских млекопитающих было обнаружено только 5 хлорорганических веществ и ртуть, то в 1990 г. при обследовании более чем 5000 особей из разных районов мира было обнаружено 256 органических поллютантов и 5 0 токсичных элементов (O'Shea, Tanabe, 1999). Эти данные наглядно демонстрируют увеличение антропогенного загрязнения за последние 30 лет, его воздействие на морские организмы и аккумуляцию по пищевым цепям.
У морских млекопитающих — дельфинов и тюленей, — обитающих в разных широтах, наблюдается различное распределение пестицидов в органах. Уровень ГХЦГ больше у животных высоких широт, а концентрация ДДТ выше у животных южных районов, что соответствует их содержанию в морской воде. Это подтверждает, что загрязнение морской воды является стартовой точкой в биоаккумуляции определенных соединений в морских экосистемах (Prudente et al., 1997).
Достаточно часто содержание ПХБ у животных открытых морей выше, чем в прибрежных зонах (Tanabe et al., 1994а). Это опровергает устойчивое мнение, что китообразные, удаленные от побережья, далеко от антропогенного воздействия обитают в более чистых районах. Высокие концентрации ПХБ были найдены и в печени альбатросов в открытых районах океана (Guruge et al., 2001).
Накопление ПХБ у китообразных, как полагают, связаны с их неспособностью к деградации подобных соединений вследствие очень низкой активности ферментов биотрансформации в их органах по сравнению с наземными животными (Tanabe et al., 1994a). Таким образом, для морских млекопитающих риск от воздействия ксенобиотиков значительно выше, что говорит об их высокой чувствительности к действию поллютантов.
Чтобы представить перспективы сохранения загрязняющих веществ в морских экосистемах, следует ретроспективно проанализировать изменение их уровня в гидробионтах за последние годы. Можно отметить, что в Северной Пацифике уровень ПХБ и ДДТ был максимален в начале 70-х гг. В 80 и 90-е гг. ДДТ постепенно снижался и в конце 90-х гг. составил 1/30 часть от максимального значения, характерного для начала 70-х гг. В то же время уровень ПХБ в 80 и 90-е гг. был относительно постоянным и составил примерно половину от уровня начала 70-х гг. (Tanabe et al., 1994b). Со временем темпы распада замедляются, одни формы переходят в другие и продолжают циркулировать в экосистемах.
Таким образом, несмотря на то что содержание персистентных поллютан-тов в органах гидробионтов несколько снизилось по сравнению с 70-ми гг., но это снижение происходит достаточно медленно, в экосистемах сохраняется много токсикантов, и эффект их еще долго будет сказываться на морских организмах в будущие годы. Важнейшими организмами-мишениями в этом отношении будут крупные хищные рыбы, птицы, млекопитающие.
Монооксигеназы смешанных функций. Биологические эффекты органических веществ-загрязнителей природного и искусственного происхождения в первую очередь обнаруживаются при исследовании различных биомаркеров,
таких как монооксигеназы смешанных функций семейства цитохрома Р450. Начиная с 6 0-х гг. XX в., стерильность, невынашивание и гибель потомства, различные болезни, массовая гибель и аномалии развития стали встречаться значительно чаще у разных видов во многих районах мира. Эти случаи участились в 8090-е гг. Причины таких явлений еще точно не установлены, но многие исследователи связывают это с токсичностью соединений, аккумулирующихся в органах животных. Для морских львов с побережья Японии показана положительная корреляция содержания в органах ПХБ и активности монооксигеназ. При увеличении в органах содержания ДДТ наблюдалось снижение тестостерона у тюленей (Tanabe et al., 1994а).
Эти факты подтверждают, что индукция ферментов биотрансформации и нарушение эндокринной регуляции происходят в природных морских экосистемах даже на вершине пищевой пирамиды, к которой относятся морские млекопитающие.
Среди множества неспецифических и специфических биомаркеров состояния организмов в условиях антропогенного загрязнения (Лукьянова, 2001) на современном этапе исследований определился круг показателей, выявляющих действие планарных полициклических ароматических углеводородов на живые организмы. В первую очередь к ним относится определение активности фермента этоксирезоруфин-О-диэтилазы (EROD) in vivo и in vitro. Этот фермент является частью системы монооксигеназ смешанных функций, осуществляющих биотрансформацию ксенобиотиков в гладком эндоплазматическом ретикулуме клеток печени различных видов животных. Конечным акцептором электронов, поступающих по электрон-транспортной цепи монооксигеназ, является цитох-ром Р450 — ключевой компонент ферментного комплекса, осуществляющий связывание молекул гидрофобных субстратов и одновременное активирование молекулярного кислорода:
RH + O2 + 2H+ + 2- ^ ROH + H2O.
Участие ферментов этого семейства в биотрансформации как эндогенных соединений — стероидов, простагландинов, витаминов, — так и экзогенных ксенобиотиков было подробно изучено на многих видах наземных организмов (Bernhardt, 1996). В начале 70-х гг. цитохром Р450 был обнаружен у рыб и в последующие годы исследован более чем у 150 пресноводных и морских видов (Stege-man, Hahn, 1994). Иммунохимическими методами была доказана генетическая связь цитохромов этого семейства у водных и наземных организмов.
Использование цитохрома Р450 в мониторинговых исследованиях основано на способности клеток увеличивать индукцию синтеза этих ферментов при воздействии различных химических веществ. Механизм индукции сходен как у млекопитающих, так и у рыб и включает связывание ксенобиотика цитозольным рецептором ароматических углеводородов (AhR) (Zabel et al., 1995). Лиганды этого рецептора имеют изостерическую конфигурацию со структурой 2,3,7,8 тетрахлор-дибензодиоксина, модельной молекулы при изучении типичного для рыб семейства цитохромов CYP1A. Рецептор существует в агрегированной форме с другими белками, включая димерную форму белков теплового шока и специфическую тирозин-киназу. После взаимодействия с лигандом стадия активации включает освобождение дополнительных белков, что позволяет рецептору связывать ядерный белок-переносчик. AhR рассматривается как лиганд-активируемый транскрипционный фактор, который узнает специфическую последовательность в ДНК, определяемую как диоксин-ответственный элемент. Этот процесс инициирует транскрипцию нескольких генов и последующий синтез белков, в том числе белков семейства цитохрома Р450 и других ферментов биотрансформации.
При индукции синтеза этих белков происходит ряд событий на молекулярном уровне, который включает образование электрофильных интермедиатов и оксирадикалов, изменение скорости метаболизма эндогенных субстратов и уве-
личение скорости биотрансформации ксенобиотиков (Stegeman, 1992). Продукты биотрансформации часто оказываются более токсичными, чем исходные соединения, вызывают повреждения клеточных структур, в первую очередь в силу своей свободнорадикальной активности. Существует обширная литература по изучению про- и антиоксидантных процессов у морских организмов, в качестве последнего обобщения можно рекомендовать обзор Ливингстона (Livingstone, 2001). В данной работе более подробно рассмотрены другие аспекты воздействия ксенобиотиков на живые системы.
Использование индукции цитохромов для оценки химического загрязнения стало особенно широко применяться в последние годы. Это связано с оптимизацией протоколов быстрого и относительно недорогого определения каталитической активности EROD у различных гидробионтов, в основном у рыб. Этот подход позволил получить большое количество сопоставимых данных, по которым можно судить о состоянии рыб из различных районов мира с разным уровнем загрязнения. Следует помнить, что прямое аналитическое определение органических веществ в органах гидробионтов остается длительным и дорогостоящим анализом. Кроме того, быстрая трансформация многих полиароматических и некоторых полихлорированных исходных соединений не позволяет установить их содержание у рыб через некоторое время после залповых воздействий. Все вышесказанное определяет преимущества EROD. Во-первых, использование EROD дает возможность установить биологические изменения у гидро-бионтов даже после изменения структуры поллютанта. Во-вторых, EROD относится к весьма чувствительным индикаторам присутствия AhR-антагонистов, т.е. органических ксенобиотиков и природных веществ, и обычно используется как первый этап в количественном определении отклика организма на внешние воздействия. В-третьих, EROD отражает кумулятивный эффект всех химических агентов, действующих на рыб, независимо от того, можем ли мы установить их присутствие химическим путем. И наконец, даже если действие ксенобиотиков не приводит к прямой токсичности, изменение биохимического гомеостаза может оказать повреждающее действие на более высокие уровни биологической организации (Stegeman, 1992).
Индукцию EROD у рыб вызывают различные соединения, в первую очередь полихлорированные и полиароматические углеводороды, а именно: полихло-рированные дибензодиоксины, полихлорированные бифенилы, полициклические ароматические углеводороды, пестициды и биоциды, а также нефть, продукты ее переработки и деградации (Whyte et al., 2000). Молекула вещества-индуктора должна иметь определенные физико-химические и геометрические свойства, такие как гидрофобность, способность принимать электроны, способность к поляризации и некоторые другие. Из внешних факторов, влияющих на способность вещества вызывать индукцию EROD, имеет значение его концентрация во внешней среде, биодоступность и способность к деградации. Как правило, промышленные и бытовые стоки, представляющие собой смесь различных поллютантов, также вызывают индукцию синтеза EROD.
При измерении активности EROD непосредственно регистрируется активация AhR-рецептора. Активность фермента определяется как скорость цитохром Р450-опосредованного деэтилирования субстрата эфира феноксазона, в данном случае 7-этоксирезоруфина, ведущего к образованию гидроксилированного продукта резоруфина. Каталитическая активность по отношению к этому субстрату является функциональным индикатором количества цитохрома Р450, присутствующего в органах. В отличие от млекопитающих, у рыб существуют очень малые различия между изоформами цитохрома Р450 по отношению к разным структурным аналогам эфиров феноксазона.
Связь между активностью EROD и эффектами на организменном (смертность) и популяционном (воспроизводство) уровнях не всегда прослеживается
однозначно. Токсичность часто связана с нарушением окислительного гомеоста-за вследствие образования свободнорадикальных продуктов при активации AhR-рецепторов. Эти соединения могут вызывать нарушения структуры ДНК путем образования сшивок между азотистыми основаниями, что в конечном счете ведет к канцерогенезу. В этом смысле измерение активности EROD есть прямое определение нарушения состояния организмов. Подобные эффекты были определены у различных видов камбаловых рыб (Varanasi et al., 1989). C проявлением активности EROD связывают различные аномалии состояния рыб, включая влияние на репродукцию (снижение уровня стероидов в сыворотке крови), изменение гонадосоматического индекса и увеличение общей смертности.
EROD и нефть. Использование EROD как показателя воздействия нефтепродуктов на гидробионтов является одним из важных направлений исследования, однако работ в этой области относительно немного (Lindstrom-Seppa, 1988; Collier et al., 1992). Одним из главных условий успешного мониторинга последствий нефтяных разливов следует признать получение образцов органов рыб как можно быстрее и ближе к месту загрязнения и последующее наблюдение за временными, сезонными и химическими изменениями, которые происходят после разлива и на протяжении работы нефтяной платформы. Биомониторинг с использованием EROD хорошо подходит для контроля за разливами нефтепродуктов. Агонистом AhR-рецепторов в нефти являются полиароматические углеводороды. Обычно в органах гидробионтов полиароматические углеводороды (ПАУ) быстро подвергаются метаболизму, поэтому измерение содержания их в органах может не дать достоверной информации о загрязнении или накоплении. Несмотря на это, активность EROD может быть определена у рыб даже при низком содержании углеводородов в органах. Например, у пятиусого налима, собранного в районе аварии танкера на побережье Шотландии в 1994 г., через три месяца после разлива в мышцах не обнаружили заметного содержания ПАУ, тогда как активность EROD была повышена в 7-9 раз (George et al., 1995). Этот биомаркер можно применять и при изучении распределения нефти по акватории, поскольку наибольшая активность фермента была обнаружена у рыб из районов, максимально близких к месту разлива.
Хорошо известно, что нефть вследствие адгезии на частицах взвеси оседает на дно и накапливается в донных отложениях, а затем очень медленно и долго из них высвобождается, вызывая вторичное загрязнение. Исследование активности EROD было проведено на фундулюсах, собранных через 20 лет после разлива сырой нефти на побережье Испании (Teal et al., 1992). Результаты показали, что в осадках определялись только следовые количества ПАУ, но активность EROD у рыб была значительно повышена. Авторы предлагают рассматривать EROD как чувствительный интегральный показатель, который дает информацию о загрязнении даже через много лет после случая разлива.
Активность EROD в печени рыб используется и для оценки поступления нефти в окружающую среду при работе нефтяных платформ. Такие работы выполнены в Северном море, на рыбах семейства камбаловых. Результаты показали градиент активности фермента у рыб, выловленных на различном расстоянии от платформы (Stagg et al., 1995).
Таким образом, активность EROD можно считать чувствительным биомаркером при разливах нефти, анализе их долговременных последствий и мониторинге влияния нефтяных платформ на окружающую среду.
Ксеноэстрогены. Изучение влияния экотоксикантов на репродуктивную систему водных организмов представляет собой одну из важнейших задач, связанных с прогнозом состояния рыбных ресурсов. В этом отношении активно изучалась взаимосвязь EROD и возраст достижения половой зрелости, развитие гонад и гомеостаз стероидных гормонов. Однако, как правило, не выявляется прямой корреляции между уровнем EROD в печени, концентрацией эстрогенов,
размером гонад и другими признаками. Высказано предположение, что эти процессы развиваются в определенной степени независимо (Munkittrick et al., 1994). Таким образом, EROD можно рассматривать как индикатор химического загрязнения определенного типа, но не состояния стероидного метаболизма.
В большом списке веществ, ингибирующих активность EROD, на первом месте стоят алкилфенолы, и прежде всего 4-нонилфенолы (Arukwe et al., 1997; Whyte et al., 2000). Нонилфенолы (НФ) — продукты распада алкилфенолэток-силатов (АФЭ), которые используются при производстве резиновых и пластиковых изделий, некоторых инсектицидов, являются побочными продуктами при получении эмульгаторов, детергентов, переработке нефти, в бумажной и текстильной промышленности (Lee, 1 999). Вследствие своего широкого применения АФЭ поступают в водные экосистемы с неочищенными стоками либо со стоками очистных сооружений. АФЭ неустойчивы в водной среде и быстро разлагаются до НФ. НФ достаточно стабильны в воде, способны накапливаться в осадках, причем в большей степени, чем в поверхностных слоях водной толщи. Часто НФ присутствуют в глубинных водах (до 1000 м), даже если в поверхностных слоях их содержание не определяется: разница может составлять 70 раз и более. Эту картину можно считать характерной для Японского моря, поверхностные воды которого, содержащие поллютанты, зимой охлаждаются и опускаются в нижние горизонты. Тем самым возникает угроза здоровью не только гидробионтов, находящихся в прибрежной зоне, но и организмов батиали. Нонилфенолы относятся к липофильным веществам, могут накапливаться в водных организмах и переноситься по пищевой цепи. Доказан значительный токсический эффект этих соединений, LC50 для которых лежит в диапазоне от 17 до 3000 мкг/л для рыб и от 20 до 3000 мкг/л для беспозвоночных (Servos, 1999).
Основной биологический эффект нонилфенолов — нарушение эндокринного метаболизма у многих водных организмов, особенно у рыб. Механизм действия основан на сходстве структуры этих соединений со структурой эндогенных эстрогенов и конкурентного связывания с эстрогенными рецепторами (Ma-digou et al., 2001). Вследствие этого возникает нарушение репродукции рыб и половой структуры популяций (Christensen et al., 1999). Показано влияние НФ и на отдельных представителей беспозвоночных — копепод, полихет, двустворчатых моллюсков (Matozzo et al., 2003), их рост, выживаемость, поведенческие реакции. Так, в экспериментах на трехиглой колюшке Gasterosteus aculeatus воздействие аналогов эстрогенов приводит к нарушению полового поведения и самцы начинают строить гнездо значительно позже, чем особи в контрольной группе (Wibe et al., 2002). У Gambusia holbrooki при подобных воздействиях наблюдались морфологические изменения строения гоноподиев и снижение половой активности самцов (Doyle, Lim, 2002).
Наряду с НФ многие глобальные ксенобиотики выступают как эстрогено-подобные вещества, например ДДТ и его метаболиты, линдан, некоторые поверхностно-активные вещества, концентрации которых в крови гидробионтов в настоящее время стали сопоставимы с действующими концентрациями стероидных гормонов. Называемые в данном случае ксеноэстрогенами подобные вещества обнаружены в сточных водах целлюлозно-бумажных комбинатов, стоках очистных сооружений городов и предприятий, в районах расположения нефтяных и газовых платформ (Дудкин, 2002). Влияние ксеноэстрогенов было впервые отмечено на пресноводных рыбах: у плотвы, а затем и представителей семейства карповых в равнинных реках и озерах Англии и Европы в некоторых местах отмечается почти 100 %-ное отсутствие самцов в популяциях. Биологические эффекты ксеноэстрогенов проявляются как на молекулярном уровне, так и на организменном и популяционном. При этом наблюдаются: ингибирование развития семенников или их развитие по типу яичников; повы-
шенные концентрации в крови эндогенных стероидных гормонов; интерсексуальность или феминизация внутренних или внешних половых органов; нарушение нереста, снижение количества икры, жизнеспособности потомства, выживания личинок.
Изменение поведения рыб, в том числе полового, связано с тем, что ксеноэ-строгены влияют не только на сперматогенез, но и на нейрогенез. Показано, что дефект единичного гена вызывает дисфункцию обоих процессов (Yuasa, 1999).
Работы по изучению ксеноэстрогенов в настоящее время активно ведутся в Европе, Англии, США, Австралии, Японии. В США с 1996 г. ксеноэстрогены стали частью исследований по безопасности пищи, и к настоящему времени более 80000 химических веществ исследовано на потенциальную эстрогенность или гормоноподобную активность.
Такие хорошо известные загрязнители, как ДДТ и ГХЦГ, возможно, имеют различный механизм влияния на стероидный метаболизм (Bigsby, 1999). Если ДДТ, подобно алкилфенолам, непосредственно связывается с рецепторным белком стероидных гормонов, то ГХЦГ не конкурирует с эстрадиолом за рецептор, а действует по-другому, не классическому пути, включающему активацию протеин-киназ, последующее быстрое фосфорилирование и активацию эстрогенных рецепторов.
У камбал из эстуариев на северо-восточном побережье Англии, загрязненном веществами с эстрогенной активностью, наблюдается аномальное изменение структуры семенников (гипертрофия соединительной ткани, нарушение морфологии сперматозоидов — до 100 % в области "хвоста"), снижение репродуктивной способности (Gill et al., 2002).
Широкие исследования эндокринного статуса рыб Балтийского и Северного морей были проведены скандинавскими учеными (Bengtsson, 1 999). На различных видах были показаны множественные аномалии репродуктивной системы, а также изменение белкового состава плазмы крови.
Вителлогенин. Для рыб высокочувствительным биомаркером на присутствие ксеноэстрогенов является появление в плазме крови самцов белка ви-теллогенина. Яйцеклетки нерестящихся рыб накапливают значительные количества желточных белков как запас питательных веществ для развивающихся эмбрионов. Процесс накопления этих белков, называемый вителлогенез, происходит в печени и регулируется эстрогенами, в основном 17-^-эстрадиолом. В плазме крови вителлогенин протеолитически расщепляется на 2 основных класса белков: обогащенный липидами липовителлин и высокофосфорилированный фосви-тин, которые затем путем эндоцитоза включаются в растущие ооциты. В дальнейшем роль этих белков состоит в обеспечении яйцеклеток достаточным количеством свободных аминокислот (Matsubara et al., 1999).
Подобные белки в норме отсутствуют у неполовозрелых рыб обоего пола и у самцов на любой стадии зрелости. У самок при половом созревании в сыворотке нарастает количество основных стероидов, которые индуцируют выработку в печени рыб м-РНК и полипептидных цепей вителлогенина. Воздействие ксеноэстрогенов запускает этот процесс и у самцов, что позволяет использовать определение вителлогенина в крови в качестве высокочувствительного биомаркера на присутствие ксеноэстрогенов в водных экосистемах.
У камбалы Pleuronectes yokohamae, выловленной в Токийском заливе, содержание вителлогенина у самцов изменялось в интервале от 50 до 2200 нг/мл сыворотки, а у камбал, выловленных вблизи о. Хоккайдо, среднее значение было меньше 50 нг/мл. У самок никаких различий не отмечено (Hashimoto et al., 1998). Не было установлено достоверной связи между уровнем вителлогенина в сыворотке крови и длиной тела рыбы, что указывает на индукцию вителлоге-нина у самцов всех возрастов в течение одного года. Более высокая концентрация вителлогенина наблюдается у самцов с пониженным гонадосоматическим
индексом, что свидетельствует о корреляции уровня ксенобиотиков и ингибиро-вания роста семенников.
У трех видов рыб-хищников, находящихся на вершине пищевой пирамиды в Средиземном море, — голубого тунца Thunnus thynnus thynnus , меч-рыбы Xiphias gladius и средиземноморского копьеносца Tetrapturus belone — было исследовано возможное влияние на репродуктивную систему имеющегося уровня ксеноэ-строгенов. Высокий уровень индукции вителлогенина был определен у самцов тунца и меч-рыбы. Повышенная активность EROD и монооксигеназ смешанных функций у всех трех видов, как у самцов, так и у самок, подтверждает негативное влияние ксенобиотиков на гидробионтов Средиземного моря (Fossi et al., 2002).
Как и в большинстве токсикологических исследований, наиболее чувствительными к действию ксеноэстрогенов являются личиночные стадии рыб. На личинках лаврака (Moron saxatilis), содержавшихся в сточных водах очистных сооружений Нью-Йорка, на 4-е сут эксперимента уровень вителлогенина у личинок был в 3-5 раз больше по сравнению с контролем. При этом концентрация нонилфенолэтоксилатных метаболитов в 40000 раз превышала уровень гормонов в сточных водах, подтверждая химическую природу факторов, вызывающих нарушения личиночного развития.
У речных рыб семейства карповых показана корреляция между уровнем алкилфенолов в воде и осадках и индукцией вителлогенина у самцов (Petrovic et al., 2002; Villeneave, 2002).
В течение 4 лет на побережье Швеции в Балтийском море велись наблюдения за европейской бельдюгой (Zoarces viviparous) , обитающей в районах , подверженных выбросам отходов бумажного производства. При максимальном количестве выбросов в 1997-1998 гг. было обнаружено резкое снижение количества самцов в популяциях. В последующие годы, когда выбросы сократились, соотношение полов приблизилось к 50/50. Эти данные свидетельствуют о том, что нарушения эндокринного метаболизма могут восстанавливаться при снижении уровня загрязнения (Larsson, Forlin, 2002).
Таким образом, молекулярные биомаркеры являются чувствительным показателем состояния видов, обитающих в неблагоприятных условиях среды. Именно такие параметры дают основания судить о самых ранних изменениях метаболизма гидробионтов. Подобные исследования позволяют не только контролировать, но и прогнозировать состояние организмов при хроническом загрязнении.
Литература
Дудкин С.И. Биоиндикация ксеноэстрогенов и антистероидных поллютантов как фактор эндокринных нарушений в популяциях рыб // Совр. проблемы физиол. и экол. мор. животных (рыбы, птицы, млекопитающие): Тез. докл. Междунар. науч. семин. — Ростов-на-Дону, 2002. — С. 61-64.
Лукьянова О.Н. Молекулярные биомаркеры. — Владивосток: ДВГАЭУ, 2001. — 196 с.
Adelman D., Hinha K.R., Pilson M.E.Q. Biogeochemistry of butyltins in an enclosed marine ecosystem // Environ. Sci. Technol. — 1990. — Vol. 24. — P. 87-92.
Arukwe A., Forlin L., Gokseyr A. Xenobiotic and steroid biotransformation enzymes in Atlantic salmon (Salmo salar) liver treated with an estrogenic compounds, 4-nonylphenol // Environ. Toxicol. Chem. — 1997. — Vol. 16. — P. 2576-2583.
Bengtsson B.-E. Endocrine disruption studies on fish (in vivo) in the Nordic countries // Intern. Symp. on Environ. Endocrine Disruptors. — Kobe, Japan, 1999. — P. 80.
Bernhardt R. Cytochrome P-450: structure, function, and generation of reactive oxygen species // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. — 1996. — Vol. 127. — P. 137-221.
Bigsby R. Xenoestrogens: pharmacokinetics and molecular mechanisms // Intern. Symp. on Environ. Endocrine Disruptors. — Kobe, Japan, 1999. — P. 60.
Cheung C.C.C., Zheng G.J., Lam P.K.S., Richardson B.J. Relationship between tissue concentrations of chlorinated hydrocarbons (Polychlorinated bi phenyls and
chlorinated pesticides) and antioxidative responses of marine mussels, Perna viridis // Mar. Pollut. Bull. — 2002. — Vol. 45. — P. 181-191.
Choi H.S., Kwon E.Y., Lee D.S. Determination of mono-, di-, and tributyltin compounds in seawater of several bay in Korea // Bull. Korean Chem. Soc. — 1993. — Vol. 14, № 2. — P. 234-238.
Christensen L.J., Korsgaard B., Bjerregaard P. The effect of 4-nonylphenol on the synthesis of vitellogenin in the flounder Platichthys flesus // Aquat. Toxicol. — 1999. — Vol. 46. — P. 211-219.
Collier T.K., Connor S.D., Eberhart B.T.L. et al. Using cytochrome P-450 to monitor the aquatic environment: initial results from regional and national surveys // Mar. Environ. Res. — 1992. — Vol. 34. — P. 195-199.
Corsi I., Mariottini M., Sensini C. et al. Cytochrome P450, acetylcholinesterase and gonadal histology for evaluating contaminant exposure levels in fish from a highly eutrophic brackish ecosystem: the Orbetello Lagoon, Italy // Mar. Pollut. Bull. — 2003. — Vol. 46, № 2. — P. 203-212.
Doyle C.J., Lim R.P. The effect of 17-0-estradiol on the gonopodial development and sexual activity of Gambusia holbroki // Environ. Toxicol. Chem. — 2002. — Vol. 21, № 12. — P. 2719-2724.
Fent K., Stegeman J.J. Effects of tributyltin chloride in vitro on the hepatic microsomal monooxygenase system in the fish Stenotomus chrysops // Aquat. Toxicol. — 1991. — Vol. 20. — P. 159-168.
Fossi M.C., Casini S., Marsili L. et al. Biomarkers for endocrine disruptors in three species of Mediterranean large pelagic fish // Mar. Environ. Res. — 2002. — Vol. 54, № 3-5. — P. 667-671.
George S.G., Wright J., Conroy J. Temporal studies of the impact of the Braer oil spill on inshore feral fish from Shetland, Scotland // Arch. Environ. Contam. Toxicol. — 1995. — Vol. 29. — P. 530-534.
Gill M.E., Spiropoulos J., Moss C. Testicular structure and sperm production in flounder from a polluted estuary: a preliminary study // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. — 2002. — Vol. 281, № 1-2. — P. 41-51.
Guruge K.S., Tanaka H., Tanabe S. Concentrations and toxic potential of poly-chlorinated biphenyl congeners in migratory oceanic birds from the North Pacific and the Southern Ocean // Mar. Environ. Res. — 2001. — Vol. 52, № 3. — P. 271-288.
Hashimoto S., Bessho H., Sat K. et al. Vitellogenin in wild male flounder Pleu-ronectes yokohamae in Tokyo Bay, Japan // Jpn J. Environ. Toxicol. — 1998. — Vol. 1, № 2. — P. 75-85.
Larsson D.G.J., Forlin L. Male-based sex ratios of fish embryos near a pulp mill: temporary recovery after a short-term shutdown // Environ. Health Perspectiv. — 2002. — Vol. 110, № 8. — P. 739-742.
Lee H.-B. Review of analytical methods for the determination of nonylphenol and related compounds in environmental samples // Water Qual. Res. J. Canada. — 1999. — Vol. 34. — P. 3-35.
Lindstrom-Seppa P. Biomonitoring of oil spill in a boreal archipelago by xenobiotic biotransformation in perch (Perca fluviatilis) // Ecotoxicol. Environ. Saf. — 1988. — Vol. 15. — P. 162-170.
Livingstone D.R. Biotechnology and pollution monitoring: use of molecular biomarkers in the aquatic environment // J. Chem. Tech. Biotechnol. — 1993. — Vol. 57. — P. 195-211.
Livingstone D.R. Contaminant-stimulated reactive oxygen species production and oxida-tive damage in aquatic organisms // Mar. Pollut. Bull. — 2001. — Vol. 42 , № 8. — P. 656-666.
Madigou T., Le Coff P., Salbert G. et al. Effects of nonylphenol on estrogen receptor conformation , transcriptional activity and sexual reversion in rainbow trout (On-corhynchus mykiss) // Aquatic Toxicol. — 2001. — Vol. 53. — P. 173-186.
Matozzo V., Dippieri M., Moschino V., Marin M.G. Evaluation of 4-nonylphenol toxicity in the clam Tapes philippinarum // Environ. Res. — 2003. — Vol. 91. — P. 179-185.
Matsubara T., Ohkubo N., Andoh T., Sullivan C., Hara A. Two forms of vitellogenin , yielding two distinct lipovitellins , play different roles during oocyte maturation and early development of barfin flownder, Verasper moseri, a marine teleost that spawns pelagic eggs // Develop. Biol. — 1999. — Vol. 213. — P. 18-23.
McCarty J.F., Shugart L.R. Biomarkers of environmental contamination. — Boca Raton: Lewis Publ., 1990. — 457 p.
Monirith I., Nakata H., Watanabe M. et al. Organochlorine contamination in fish and mussels from Cambodja and other Asian countries // Water Sci. and Technol. — 2000. — Vol. 42. — P. 241-252.
Munkittrick K.R., van der Kraak G.J., McMaster M.E. et al. Survey of receiving-water environmental impacts associated with discharges from pulp mass. Gonad size, liver size, hepatic EROD activity and plasma sex steroid levels in white sucker (Catostomus commersoni) // Environm. Toxicol. Chem. — 1994. — Vol. 13. — P. 1089-1101.
O'Shea T.J., Tanabe S. Persistent ocean contaminants and marine mammals: a retrospective overview // Proceedings of the Marine Mammals Commission Workshop Marine Mammals and Persistent Ocean Contaminant / Eds. O'Shea et al. — 1999. — P. 87-92.
Petrovic M., Sole M., de Alba M.J.L. Barcelo D. Endocrine disruptors in sea-wage treatment plants, receiving river waters, and sediments: integration of chemical analysis and biological effects on feral carp // Environ. Toxicol. Chem. — 2002. — Vol. 21, № 10. — P. 2146-2156.
Porte C., Biosca X., Sole M., Albaiges J. The integrated use of chemical analysis, cytochrome P450 and stress proteins in mussels to access pollution along the Galician coast (NW Spain) // Environ. Pollut. — 2001. — Vol. 112. — P. 261-268.
Prudente M., Tanabe S., Watanabe M. et al. Organochlorine contamination in some odontoceti species from the North Pacific and Indian Ocean // Mar. Environ. Res. — 1997. — Vol. 44. — P. 415-427.
Servos M.R. Review of the aquatic toxicity , estrogenic responses and bioaccumulation of alkylphenols and alkylphenol polyethoxylates // Water Qual. Res. J. Canada. — 1999. — Vol. 34. — P. 123-177.
Stagg R.M., McIntosh A., Mackie P. Elevation of hepatic monooxygenase activity in the dab (Limanda limanda) in relation to environmental contamination with petroleum hydrocarbons in the Nothern Sea // Aquat. Toxicol. — 1995. — Vol. 33. — P. 245-264.
Stegeman J.J., Hahn M.E. Biochemistry and molecular biology of monoxygenases: current perspectives on forms , functions , and regulation of cytochrome P-450 in aquatic species // Aquatic Toxicology: Molecular, Biochemical and Cellular Perspectives. — Boca Raton: Lewis Publ., 1994. — P. 87-206.
Stegeman J.J. Nomenclature for hydrocarbon-inducible cytochrome P-450 in fish // Mar. Environ. Res. — 1992. — Vol. 34. — P. 133-138.
Tanabe S. Contamination and toxic effects of persistent endocrine disrupters in marine mammals and birds // Mar. Poll. Bull. — 2002. — Vol. 45. — P. 69-77.
Tanabe S., Iwata H., Tatsukawa R. Global contamination by persistent orga-nochlorines and their ecotoxicological impact on marine mammals // Sci. Total Environ. — 1994a. — Vol. 154. — P. 163-177.
Tanabe S., Sung J., Choi D. et al. Persistent organochlorine residues in northern fur seal from the Pacific coast of Japan since 1971 // Environ. Pollut. — 1994b. — Vol. 85. — P. 305-314.
Teal J., Farrington J., Burns K. et al. The West Falmouth oil spill after 20 years: fate of fuel oil compounds and effects on animals // Mar. Pol. Bull. — 1992. — Vol. 24. — P. 607-614.
Varanasi U., Stein J.E., Nishimoto M. Biotransformation and disposition of poly-cyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in fish: Metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons in the aq uatic environment. — Boca Raton: CRC Press , 1 989. — 374 p.
Villeneave D.L., Villalobos S.A., Keith T.L. et al. Effects of waterborne exposure to 4-nonylphenol on plasma sex steroid and vitellogenin concentrations in sexually mature male carp (Cyprinus carpio) // Chemosphere. — 2002. — Vol. 47, № 1. — P. 15-28.
Whyte J.J., Jung R.E., Schmitt C.J., Tillitt D.E. Ethoxyresorufin-o-deethylase (EROD) activity in fish as a biomarker of chemical exposure // Crit. Rev. Toxicol. — 2000. — Vol. 30, № 4. — P. 347-570.
Wibe A.E., Rosenquist G., Jenssen B.M. Disruption of male reproductive behavior in threespine stickleback Gasterosteus aculeatus exposed to 17-0-estradiol // Environ. Res. — 2002. — Vol. 90, № 2. — P. 136-141.
Yuasa S. Both spermatogenesis and neurogenesis are defective in the Fyn-deficient mice: a prospect on the possible common molecular mechanisms related to environmental endocrine disruptors // Intern. Symp. on Environ. Endocrine Disruptors. — Kobe, Japan, 1999. — P. 69-70.
Zabel E.W., Cook P.M., Peterson R.E. Toxic equivalency factors of polychlorinated dibnenzo-p-dioxin , dibenzofuran and biphenyl congeners based on early life stage mortality in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // Aquat. Toxicol. — 1995. — Vol. 31. — P. 315-328.
