МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ АСПЕКТЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ БАРБАРИСА ОБЫКНОВЕННОГО И БЕЛОКОПЫТНИКА ГИБРИДНОГО НА КЛЕТОЧНУЮ ЛИНИЮ HELA

Златник Елена Юрьевна; Енин Ярослав Сергеевич; Буров Олег Николаевич; Бондаренко Елена Сергеевна; Сагакянц Александр Борисович; Кутилин Денис Сергеевич; Дзигунова Юлия Викторовна; Ишонина Оксана Георгиевна; Шалашная Елена Владимировна; Ушакова Наталья Дмитриевна

Исследования и практика в медицине. 2023.Т.10, № 4. С. 31-47

https://doi.org/10.17709/2410-1893-2023-10-4-3

https://e1ibrary.ru/WNOCXO

3.1.6. Онкология, лучевая терапия

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

Ш

МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ АСПЕКТЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ БАРБАРИСА ОБЫКНОВЕННОГО И БЕЛОКОПЫТНИКА ГИБРИДНОГО НА КЛЕТОЧНУЮ ЛИНИЮ HELA

Е. Ю. Златник', Я. С. Енин"3, О. Н. Буров2, Е. С. Бондаренко', А. Б. Сагакянц', Д. С. Кутилин', Ю. В. Дзигунова2, О. Г. Ишонина', Е. В. Шалашная', Н. Д. Ушакова'

1 Национальный медицинский исследовательский центр онкологии Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону,

Российская Федерация

2 Южный федеральный университет, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация И Dendro51@yandex.ru

Цель исследования. Выделить и верифицировать чистые фракции вторичных метаболитов растений, содержащихся в B. vulgaris (L.) и P. hibridus (L.), а также провести модельный эксперимент и молекулярно-генетическое исследование для оценки их цито-токсического действия в условиях in vitro на клеточной линии HeLa.

Материалы и методы. Выделение и верификация всех использованных в эксперименте соединений проводили методами колоночной хроматографии и ядерно-магнитного резонанса на кафедре природных соединений химического факультета Южного федерального университета. Дальнейший эксперимент выполнен с использованием культуральных и молекулярных методов на клеточной линии HeLa в трех повторах для каждого исследуемого соединения, после инкубации с которыми проводили учет количества мертвых клеток на автоматическом счетчике NanoEnTek JuliFl, а также измерение количества клеток в состоянии апоптоза методом проточной цитофлюориметрии на анализаторе BD FACSCanto II. Оценку уровня копийности и экспрессии генов, ответственных за апоптоз, выполняли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (RT-PCR). Всего исследовали 3 вещества, по 2 концентрации (4 и 12 мкг/мл) и 2 экспозиции (24 и 72 часа) каждого из них. Результаты. На первом этапе исследования были выделены и верифицированы алкалоид берберин, экстрагированный из корней B. vulgaris (L.), а также 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one и 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde из P. hibridus (L.). На следующем этапе исследования было обнаружено, что клеточная гибель была максимальной под действием берберина при экспозиции 72 часа. Однако оценка показателей копийности и экспрессии генов CASP8, CASP9, CASP3, BAX, BCL2, TP53 и MDM2 методом RT-PCR выявила наличие инициации апоптоза в опухолевых клетках на молекулярном уровне под действием всех исследованных соединений: как берберина, так и производных фурана и азулена, полученных из P. hibridus (L.). Заключение. Все использованные в эксперименте соединения показали цитотоксическое действие на клеточную линию HeLa. Алкалоид берберин проявил наиболее выраженное цитотоксическое действие на линию HeLa зарегистрированное всеми используемыми в исследовании методами. Терпеноиды 4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one и 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-d icarbaldehyde при воздействии на линию HeLa вызвали увеличение показателей копийности и экспрессии локусов CASP9, CASP3 которые являются однимм из основных активаторов апоптоза. Они же оказали влияние на экспрессию локусов TP53 и MDM2.

Ключевые слова:

вторичные метаболиты растений, апоптоз, экспрессия генов, копийность генов, клеточная линия HeLa

Для цитирования: Златник Е. Ю., Енин Я. С., Буров О. Н., Бондаренко Е. С., Сагакянц А. Б., Кутилин Д. С., Дзигунова Ю. В., Ишонина О. Г., Шалашная Е. В., Ушакова Н. Д. Молекулярно-клеточные аспекты воздействия вторичных метаболитов Барбариса обыкновенного и Белокопытника гибридного на клеточную линию HeLa. Research and Practical Medicine Journal (Исследования и практика в медицине). 2023; 10(4): 31-47. https://doi.org/10.17709/2410-1893-2023-10-4-3 EDN: WNOCXO

Для корреспонденции: Енин Ярослав Сергеевич - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной онкологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация Адрес: 344037, Российская Федерация, г. Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, д. 63 E-mail: Dendro51@yandex.ru

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4572-1579, SPIN: 7683-2286, AuthorID: 840050, Scopus Author ID: 57196464479

Финансирование: финансирование данного исследования выполнено в рамках выполнения работы на соискание степени кандидатской диссертации «Изучение действия вторичных метаболитов растений на культуры опухолевых клеток и его молекулярно-генетических механизмов».

Конфликт интересов: все авторы заявляют об отсутствии явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. Статья поступила в редакцию 04.07.2023; одобрена после рецензирования 08.11.2023; принята к публикации 01.12.2023.

Резюме

Research'n Practical Medicine Journal. 2023. Vol. 10, No. 4. P. 31-47

https://doi.org/10.17709/2410-1893-2023-10-4-3

https://e1ibrary.ru/WNOCXO

Oncology, radiotherapy

ORIGINAL ARTICLE

MOLECULAR AND CELLULAR ASPECTS OF THE IMPACT OF SECONDARY METABOLITES FROM COMMON BARBERRY AND HYBRID GOAT'S RUE ON THE HELA CELL LINE

E. Yu. Zlatnik1, Ya. S. Enin1H, O. N. Burov2, E. S. Bondarenko1, A. B. Sagakyants1, D. S. Kutilin1, Yu. V. Dzigunova2, O. G. Ishonina1, E. V. Shalashnaya1, N. D. Ushakova1

1 National Medical Research Centre for Oncology of the Ministry of Health of Russia, Rostov-on-Don, Russian Federation

2 Southern Federal University, Rostov-on-Don, Russian Federation E Dendro51@yandex.ru

Abstract

Purpose of the study. To isolate and verify pure fractions of secondary plant metabolites contained in B. vulgaris (L.) and P. hibridus (L.), as well as to conduct a model experiment and molecular genetic study to evaluate their cytotoxic effect in vitro on the HeLa cell line. Materials and methods. The isolation and verification of all compounds used in the experiment were carried out using column chromatography and nuclear magnetic resonance methods at the Department of Natural Compounds, Faculty of Chemistry, Southern Federal University. Subsequently, an experiment was conducted using cultural and molecular methods on the HeLa cell line in three repetitions for each test compound; after incubation with them, the numbers of dead cells were counted on the automated NanoEnTek JuliFl counter, and the numbers of cells in apoptosis were measured by flow cytometry on the BD analyzer FACS Canto II. The level of copy number variation and expression of genes responsible for apoptosis were assessed by real-time PCR (RT-PCR). In total, three substances were studied, with two concentrations (4 and 12 ^g/ml) and two exposures (24 and 72 hours) for each of them.

Results. In the first stage of the study, we isolated and verified the berberine alkaloid extracted from the roots of B. vulgaris (L.), as well as 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one and 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde from P. hibridus (L.). The subsequent stage of the study demonstrated the maximal cellular death under the action of berberine at a 72-hour exposure. However, the RT-PCR assessment of the copy number variation and expression of the CASP8, CASP9, CASP3, BAX, BCL2, TP53 and MDM2 genes revealed the presence of apoptosis initiation in tumor cells at the molecular level under the action of all the studied compounds: both berberine and furan and azulene derivatives derived from P. hibridus (L.).

Conclusion. All compounds used in the experiment exhibited a cytotoxic effect on the HeLa cell line. Berberine alkaloid showed the most pronounced cytotoxic effect on the HeLa line as recorded by all methods used in the study. Terpenoids 4-dihydroxy-2,5-dimethyl-furan-3(2H)-one and 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde, when exposed to the HeLa line, caused an increase in the copy number variation and expression of the CASP9, CASP3 loci, which are among the main activators of apoptosis. They also influenced the expression of TP53 and MDM2 loci.

Keywords:

secondary plant metabolites, apoptosis, gene expression, copy number variation, HeLa cell line

For citation: Zlatnik E. Yu., Enin Ya. S., Burov O. N., Bondarenko E. S., Sagakyants A. B., Kutilin D. S., Dzigunova Yu. V., Ishonina O. G., Shalashnaya E. V., Ushakova N. D. Molecular and cellular aspects of the impact of secondary metabolites from common barberry and hybrid goat's rue on the HeLa cell line. Research and Practical Medicine Journal (Issled. prakt. med.). 2023; 10(4): 31-47. (In Russ.). https://doi.org/10.17709/2410-1893-2023-10-4-3 EDN: WNOCXO

For correspondence: Yaroslav S. Enin - Junior Researcher, Laboratory of Molecular Oncology, National Medical Research Centre for Oncology of the Ministry of Health of

Russia, Rostov-on-Don, Russian Federation

Address: 63 14 line str., Rostov-on-Don 344037, Russian Federation

E-mail: Dendro51@yandex.ru

ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4572-1579, SPIN: 7683-2286, AuthorlD: 840050, Scopus Author ID: 57196464479

Funding: this study was performed and funded as part of the PhD thesis titled 'Study of the Action of Secondary Metabolites of Plants on Tumor Cell Cultures and Its Molecular Genetic Mechanisms'.

Conflict of interest: the authors declare that there are no obvious and potential conflicts of interest associated with the publication of this article. The article was submitted 04.07.2023; approved after reviewing 08.11.2023; accepted for publication 01.12.2023.

АКТУАЛЬНОСТЬ

Рак шейки матки является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований у женщин [1, 2]. Химические соединения растительного происхождения для лечения злокачественных новообразований шейки матки и других нозологий привлекают все большее внимание химиотерапевтов как более щадящие по сравнению с синтетическими цитостатиками: не ослабляющие иммунную систему организма и менее токсичные для нормальных клеток [3]. Более того, есть данные о том, что соединения растительного происхождения способны стимулировать гибель опухолевых клеток, по путям, отличающимся от путей действия синтетических химиотерапевтических препаратов [4, 5]. Основываясь на этих фактах, в настоящее время продолжается поиск новых вторичных метаболитов растений, которые могут быть перспективными в разработке противоопухолевых препаратов [6-8].

Белокопытник гибридный Petasites hibridus (L.) Gaertn., B. Mey. & Scherb. семейства астровые Asteraceae широко применяем в традиционной китайской фитотерапии, содержит большое количество биологически активных соединений. Вещество се-сквитерпен S-петазин, которое также было обнаружено как в Белокопытнике японском Petasites japonicus (Siebold & Zucc.) Maxim., так и в P. hibridus (L.), проявляет богатую биологическую активность, включая, цитотоксическое действие на пролиферацию клеток рака предстательной железы человека [9, 10].

Ареал распространения P hibridus (L.) покрывает всю территорию Европы, Китай, а также он встречается в Турции. На территории Российской Федерации распространен в горных районах Краснодарского края и Республики Адыгея, является одним из представляющих интерес видов для поиска новых терпенов либо алкалоидов, обладающих проапо-птотической активностью в отношении опухолевых клеток. В литературе основное действие экстрактов

белокопытника объясняется наличием в их составе S-петазина и изо^-петазина с молекулярной массой равной для каждого 334 г/моль и (рис. 1, 2).

Представители многолетних травянистых растений рода Petasites не перестают привлекать интерес в качестве объекта поиска новых соединений, обладающих антипролиферативным действием. В проведенных ранее подобных исследованиях упомянутые сесквитерпены подавляли клеточную пролиферацию линий DU145, PC3, LNCaP, а также активировали каспазные каскады, увеличивали высвобождение цитохрома С из митохондрий и подавление экспрессии BCL-2 [11]. Так, S-петазин, экстрагированный из P japónicas (Siebold & Zucc.), индуцировал апоптоз и ингибировал миграцию клеток меланомы B16F10 и клеток A375 за счет активации сигнального пути р53 [12]. Из метанольного экстракта надземных частей P. japonicus (Siebold & Zucc.) были выделены шесть новых сесквитерпеноидов эремофиланово-го типа, петаситестерпены I—VI, включая S-японин и эремофилинолид. Среди выделенных соединений петаситестерпены I, II, VI и S-японин проявляли цитотоксические свойства и антипролиферативную активность против опухолевых клеток астроцитомы человека U-251MG и их опухолевых стволовых клеток (CSC) [13].

Берберин, (C20H18NO4+ производное 5,6-дигидро-бензо [a, g]хинолизиния рис. 3) MW = 337 г/моль, является четвертичным изохинолиновым алкалоидо, м получаемым из кустарников рода Berberís, в нашем случае из Барбариса обыкновенного Berberís vulgaris (L.), и широко используются в Китае для коррекции гиперлипидемии человека и кишечных заболеваний в клинической практике [14].

Берберин обладает разнообразными фармакологическими эффектами и обычно используется для лечения гастроэнтерита [15, 16]. Он проявляет значительное антипролиферативное действие, показанное как в условиях in vitro на таких линиях опухолевых клеток, как MCF-7, MDA-MB231, HT-29, A549,

Рис. 1. Структурная формула S-петазина. Fig. 1. The structural formula of S-petasin.

Рис. 2. Структурная формула изо^-петазина.

Fig. 2. The structural formula of /so-S-petasin.

Рис. 3. Структурная формула алкалоида берберина.

Fig. 3. The structural formula of berberine.

LNCaP, так и в экспериментах in vivo на моделях A549 xenograft, LNCaP xenograft mice, SW-620 xenograft mice, U87 xenograft mice, вызывая остановку клеточного цикла и апоптоз, ингибируя метастазиро-вание и ангиогенез [17]. В литературе описано, что существуют несколько механизмов антипролифера-тивного действия берберина. Он взаимодействует с различными молекулярными мишенями путем связывания со специфическими последовательностями дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК). Так же известны несколько механизмов антипролифе-ративного действия берберина, а именно подавление циклинов A, D, CDK 1, CDK4, Jak2, фактор роста эндотелия сосудов VEGF, NF-kB путь активатора белка 1 (AP-1) и индукция аутофагической гибели клеток через сигнальный путь mTOR [18, 19]. Берберин также индуцирует митохондриально-опосредованный апоптоз за счет потери мембранного потенциала митохондрий, высвобождения цитохрома С, активации каспазы и PARP, усиления регуляции проапо-птотических белков семейства BCL-2 и понижающей регуляции антиапоптотических белков семейства BCL-2 [20].

Цель исследования: выделить и верифицировать чистые фракции вторичных метаболитов растений, содержащихся в B. vulgaris (L.) и P. hibridus (L.), а так-

CI Cl

Cl Cl

Рис. 4. Структурная формула тетрахлорэтилена.

Fig. 4. The structural formula of tetrachlorethylene.

же провести модельный эксперимент и молекулярно-генетическое исследование для оценки их цитоток-сического действия в условиях in vitro на клеточной линии HeLa.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено совместно со специалистами Южного федерального университета кафедры ботаники академии биологии и биотехнологии им. Д. И. Ивановского и кафедры природных и высокомолекулярных соединений химического факультета. Выделение вторичных метаболитов из P. hibridus (L.) и B. vulgaris (L.) производилось на химическом факультете Южного федерального университета на кафедре природных соединений. Для экстракции из Белокопытника гибридного были использованы механически очищенные, измельченные корневища, которые заливались тетрахлорэтиленом (рис. 4) - хлорорганическим растворителем устойчивым к гидролизу [21].

Первичная экстракция заняла четыре месяца. Тетрахлорэтилен (рис. 4) отделяли от растительного сырья путем декантации и сконцентрировали, отогнав растворитель в перегонной установке (рис. 5).

Сконцентрированный раствор разделяли методом колоночной хроматографии. В качестве сорбента (твердой фазы) использовался силикагель ^Ю2хН20). В качестве элюента (подвижной фазы) последовательно использовались тетрахлорэтилен, хлористый метилен и смесь хлористого метилена со спиртом в соотношении 10:1 (рис. 6).

При использовании тетрахлорэтилена нами были выделены 10 фракций, цвет которых менялся от бесцветного до светло-желтого. Далее в качестве элюента использовали хлористый метилен и получили

Рис. 5. Общая схема перегонной установки для концентрирования (1 - электроплитка, 2 - колба, 3 - насадка Вюрдца, 4 - прямой водяной холодильник Либиха, 5 - аллондж, 6 - колба).

Fig. 5. The general scheme of the distillation still for concentration (1 - electric stove, 2 - flask, 3 - Wurdz nozzle, 4 - Liebig consider, 5 -allonge, 6 - receiving flask).

еще 10 фракций. После этого залили колонку смесью хлористого метилена и спирта, и собрали еще 2 фракции. Все фракции сконцентрировали методом упаривания.

Для идентификации выделенных соединений, было проведено разделение исходного экстракта методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-детектированием. Полученные масс-спектры были расшифрованы и идентифицированы с помощью библиотек NIST 2011, которые содержали данные по алкалоидам и биологически активным веществам.

Из дальнейшего анализа были исключены фракции, содержащие высшие жирные кислоты (валериановую и изовалериановую), азотистые основания нуклеиновых кислот и их гликозидов. Далее проводилась идентификация оставшихся фракций методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на атомах водорода.

Идентификация методом ЯМР позволила выявить ряд следующих соединений (рис. 7).

Интересно отметить то обстоятельство, что 5-пета-зин и изо-5-петазин из исследуемых образцов выделить не удалось ввиду крайне низкого их содержания в растительном сырье. Для выделения берберина,

которое также производилось на химическом факультете Южного федерального университета на кафедре природных соединений, использовалась навеска корней B. vulgaris (L.) общей массой 0,5 г. В качестве реагента для экстракции (растворителя) была применена смесь 70 % водного этанола и 70 % водной

Рис. 6. Общая схема хроматографической колонки

(1 - растворитель, 2 - вата, 3 - силикагель, 4 - вещество).

Fig. 6. The general scheme of a chromatography column (1 - solvent, 2 - cotton wool, 3 - silica gel, 4 - substance).

Рис. 7. Структурные формулы соединений, выделенных из P. h/br/dus (L.).

Fig. 7. The structural formulas of compounds isolated from P. hybridus (L.).

Рис. 8. Структурная формула берберина, выделенного из корней B. vulgar/s (L.).

Fig. 8. The structural formula of berberine isolated from the roots of B. vulgaris (L.).

уксусной кислоты в соотношении 9:1. Экстракцию проводили при комнатной температуре 4 дня. После этого полученный первичный экстракт сконцентрировали перегонкой. Сухой остаток после дистилляции растворяли в 96 % водном этаноле и проводили хроматографическое разделение на колонке, заполненной силикагелем. В качестве подвижной фазы использовали смесь хлористого метилена и этанола в соотношении 10:1. Из колонки выделили фракцию желтого цвета с подвижностью (Rf) 0,1. Раствор сконцентрировали методом перегонки, как описано выше. Отгонку вели до тех пор, пока в колбе не осталось 5 мл спирта (рис. 5). Выделенный бербе-рин полностью соответствуют по физико-химическим данным коммерчески доступному [CAS 2086-83-1] (рис. 8).

Оценку воздействия полученных соединений проводили в условиях in vitro на клеточной линии HeLa CCL2. Клеточная линия была получена из Института цитологии и генетики РАН. Клетки наращивались в питательной среде Игла MEM (БиолоТ) с внесением 10 % фетальной сыворотки коров (ФСК) (HyClone, США) до количества 1 х 106 при 37 °C и 5 % СО2. Экспозиция составляла 24 и 72 часа. При достижении 75-80 % уровня конфлюэнтности клеточной линии, питательная среда заменялась на аналогичную с внесением берберина и производных фурфурола и азулена (в концентрациях 4 и 12 мкг/мл) в опытные образцы, в отрицательном контроле вносилась среда без добавления исследуемых веществ. Через 24 и 72 часа экспозиции клетки снимались при помощи 0,1 % раствора трипсина для определения количества живых и мертвых клеток на автоматическом счетчике NanoEnTek JuliFl (Корея) с применением окрашивания 0,4 % трипановым синим. Затем клетки снимали с культуральных флаконов раствором 0,1 % трипсина и консервировали в РНК среде (IntactRNA Евроген) [22]. Оценку процентного содержания клеток в состоянии апоптоза от общего количества клеток проводили на проточном цитофлюориметре BD FACSCanto II с помощью FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I. Клетки, сохраненные в РНК среде, делились на две равные аликвоты, из которых выделялись тотальные препараты ДНК и РНК.

ДНК выделалась коммерческим набором «ДНК-сорб-В» по соответствующему протоколу. РНК выделяли Тризолом по методу Хомчинского [23]. Оценку показателей копийности и экспрессии после воздействия проводили методом Real-time PCR. RT-qPCR амплификация проводилась на термоциклере ДТпрайм (ДНК технология, Россия). Амплификацию каждого образца осуществляли в трех технических повторах. Далее усредненные данные порогового цикла по каждому генетическому локусу нормировались по

усредненному показателю порогового цикла для референсных генов (ДО: = среднее Ct (исследуемого гена) - среднее геометрическое Ct (референсных генов)), и вычисляли величину rQ, равную 2-дс:. Далее вычисляли среднее rQ клеток под воздействием исследуемых веществ и среднее rQ интактных клеток (контроль) для каждого генетического локуса и соотношение RQоб/RQк, представляющее собой показатель относительной копийности генов в экспериментальных образцах по отношению к контрольным [24]. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 19.0 (StatSoft Inc., США). Полученные данные подвергали однофактор-ному дисперсионному анализу (критический уровень статистической значимости р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В первый этап исследования входили выделение, очистка и верификация соединений, которые обладают потенциальным цитостатическим действием в отношении клеточной линии HeLa. Идентификация была осуществлена методами масс-спектометрии и ядерного магнитного резонанса (ЯМР); в ходе нее был верифицирован 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one, которому был присвоен порядковый номер 2, а также 2,2,8-tr imethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde под порядковым номером 5.3. Оба соединения выделены из корневищ P. hibridus (L.). Из B. vulgaris (L.) был выделен алкалоид берберин. Данные, полученные при оценке цитотоксического действия исследуемых веществ на счетчике клеток NanoEnTek JuliFl. представлены в таблице 1.

Как видно из представленных в таблице 1 данных, наибольший процент мертвых клеток HeLa наблюдался при воздействии берберином (28,39 % 4 мкг/мл, 29,79 % 12 мкг/мл) при временной экспозиции 72 часа. Этот результат оценки противоопухолевого воздействия использованных нами метаболитов также подтверждается данными проточной цито-метрии, представленными в таблицах 2, 3.

Наиболее выраженное цитотоксическое действие показал берберин в концентрации 4 мкг/мл при экспозиции 72 часа. Интересной особенностью данных результатов проточной цитофлюориметрии оказалось то, что концентрация берберина 12 мкг/мл показала меньшее проапоптогенное действие на клеточную линию HeLa, чем концентрация 4 мкг/мл.

При воздействии берберином в концентрации 4 мкг/мл и временной экспозиции 24 часа наблюдались увеличения копийности локуса CASP9 в 5,02 раза (p <0,05) по отношению к контролю, CASP3 в 21,11 раза (p < 0,05). При концентрации 12 мкг/мл

Таблица 1. Количество живых и мертвых клеток линии HeLa после воздействия выделенными вторичными метаболитами после окраски трипановым синим

Table 1. The number of living and dead cells of the HeLa line after exposure to isolated secondary metabolites after staining with trypan blue

Вещество, концентрации/ Substance, concentration 24 часа, живые клетки / 24 hours, live cells 24 часа, мертвые клетки / 24 hours, dead cells 72 часа, живые клетки / 72 hours, live cells 72 часа, мертвые клетки / 72 hours, dead cells

Контроль без воздействия / Control without influence 96,27 % 3,73 % 92,65 % 7,35 %

№ 2, 4 мкг/мл / № 2 4 ^g/ml 88,46 % 11,54 % 88,46 % 11,54 %

№ 2, 12 мкг/мл / № 2, 12 ^g/ml 87,50 % 12,50 % 95,83 % 4,17 %

№ 5.3, 4 мкг/мл / № 5.3 4 ^g/ml 88,89 % 11,11 % 91,74 % 8,26 %

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

№ 5.3, 12 мкг/мл / № 5.3 12 ^g/ml 89,29 % 10,71 % 89,29 % 10,71 %

Берберин 4 мкг/мл / Berberi 4 ^g/ml ne 86,21 % 13,40 % 77,61 % 28,39 %

Берберин 12 мкг/мл / Berbe 12 ^g/ml rine 75,45 % 17,72 % 70,21 % 29,79 %

Таблица 2. Количество клеток линии HeLa в состоянии апоптоза после воздействия выделенными вторичными метаболитами (экспозиция 24 часа) Table 2. The number of HeLa cells in apoptosis after exposure to isolated secondary metabolites (24-hour exposure)

Ранний Живые клетки Вещество / Концентрация, мкг/мл / Ann V- PI- / Ann v+ pi / Substance Concentration, ug/ml Living cells .- . AnnV-PI- Early apoptosis Ann V+ PI- , Мертвые Поздний апоптоз/ клетки некроз Ann V+PI+ / Ann V- PI+ / Late ар°№ / necrosis Dead cells Ann Ann V+PI+ V- PI+

Контроль / Control 95,8 % 1,1 % 3,0 % 0,1 %

№ 2 4 95,4 % 1,4 % 3,1 % 0,1 %

№ 2 12 94,7 % 2,1 % 3,2 % 0 %

№ 5,3 4 93,8 % 1,7 % 4,5 % 0,1 %

№ 5,3 12 94,8 % 1,7 % 3,5 % 0,1 %

Берберин / Berberine 4 76,8 % 9,0 % 13,8 % 0,4 %

Берберин / Berberine 12 91,3 % 3,3 % 5,3 % 0,1 %

копийность CASP9 увеличилась в 18,31 раза (p < 0,05), а CASP3 в 19,70 раза (p < 0,05). Однако изменения показателей экспрессии данных генов в указанных временных точках при использовании тех же концентраций берберина были незначительны. Воздействие берберином во временной экспозиции 72 часа с концентрацией 4 мкг/мл и 12 мкг/мл не оказало выраженного эффекта на изменения показателей копийности и экспрессии в локусах CASP8, CASP9, CASP3 (рис. 9).

Оценка влияния берберина на локус TP53 и MDM2 показала следующие результаты. Во временной экспозиции 24 часа с концентрацией 4 мкг/мл уровень экспрессии локуса TP53 составил 1,02 (p < 0,05),

а уровень экспрессии локуса MDM2-0,55 (р < 0,05). Разница составила 1,85 раза в сторону увеличения уровня экспрессии ТР53 над MDM2. Концентрация берберина 12 мкг/мл с экспозицией 24 часа показала увеличение уровня экспрессии ТР53 в 1,78 (р < 0,05) раза и снижение MDM2 до уровня, равного 0,18 раза (р < 0,05). Разница значений экспрессии между локу-сами ТР53 и MDM2 в данной экспозиции составила 9,89 раза в сторону увеличения ТР53 (рис. 10). При этом изменения показателей копийности локусов ТР53 и MDM2 в данном случае не наблюдалось. В экспозиции 72 часа с берберином для локусов ТР53 и MDM2 были обнаружены следующие изменения уровня экспрессии. При концентрации берберина

Таблица 3. Количество клеток линии HeLa в состоянии апоптоза после воздействия выделенными вторичными метаболитами (экспозиция 72 часа)

Table 3. The number of HeLa cells in apoptosis after exposure to isolated secondary metabolites (72-hour exposure)

Вещество / Berberine

Концентрация, мкг/мл / Concentration, ^g/ml

Живые клетки Ann V- PI- / Living cells Ann V-PI-

Ранний апоптоз Ann V+ PI- / Early apoptosis Ann V+ PI-

Поздний апоптоз / некроз Ann V+PI+ / Late apoptosis/necrosis Ann V+PI+

Мертвые клетки Ann V- PI+ / Dead cells Ann V- PI+

Контроль/ Control 87,0 % 7,2 % 5,8 % 0 %

№ 2 4 79,6 % 13,1 % 7,3 % 0 %

№ 2 12 85,1 % 5,3 % 9,6 % 0 %

№ 5,3 4 96,6 % 1,3 % 2,1 % 0 %

№ 5,3 12 91,9 % 4,7 % 3,3 % 0,1 %

Берберин / Berberine

32,8 %

29,3 %

37,2 %

0,7 %

Берберин / Berberine

12

65,9 %

4,5 %

28,5 %

1,1 %

4

Рис. 9. Уровень копийности и экспрессии каспаз под воздействием берберина в обеих использованных концентрациях при экспозиции 24 и 72 часа.

Fig. 9. The copy number and expression levels of caspases under the influence of berberine at both used concentrations during exposure for 24 and 72 hours.

4 мкг/мл было выявлено увеличение уровня экспрессии ТР53 в 1,1 раза (р < 0,05), а также снижение уровня экспрессии MDM2 до значения 0,22 (р < 0,05). Разница между уровнем экспрессии ТР53 и MDM2 составила 4,86 раза в сторону увеличения ТР53 над MDM2. Уровень экспрессии ТР53 с использованием берберина в концентрации 12 мкг/мл и экспозицией 72 часа увеличился в 3,10 раза (р < 0,05); в тоже время уровень экспрессии MDM2 составил 0,09 (р < 0,05). Таким образом, разница между уровнями экспрессии локусов ТР53 и MDM2 в данной точке достигла 34,4 в сторону увеличения уровня экспрессии ТР53. (рис. 10).

Для локусов ВАХ и BCL2 под воздействием берберина на клетки линии HeLa были отмечены следующие изменения. При экспозиции 24 часа и концентрации 4 мкг/мл копийность Ва2 увеличивалась относительно контроля без воздействия в 50,37 раза (р < 0,05), а копийность ВАХ - в 1,1 (р < 0,05); таким образом, разница между Ва2 и ВАХ в данной точке была 45,78 раза в сторону BCL2 (рис. 10). При использовании концентрации берберина 12 мкг/мл копийность ВСП составила 83,73 раза (р < 0,05), а копийность ВАХ - 0,72 раза (р < 0,05), таким образом, разница показателей копийности между Ва2 и ВАХ составила 116,29 раза (рис. 11).

blldLlll

о

БерберинЕХР 6ep6epifflCNV БерберинЕХР Берберин CNV БерберинЕХР Берберин CNV БерберинЕХР Берберин CNV 24 часа 4мкг/мл 24 часа 12 мкг/мл 72 часа 4мкг/мл 72 часа 12 мкг/мл

■ ТР53 1MDM2

Рис. 10. Уровень копийности и экспрессии локусов TP53 и MDM2 под воздействием берберина в обеих использованных концентрациях при экспозиции 24 и 72 часа.

Fig. 10. The copy number and expression levels of the TP53 and MDM2 loci under the influence of berberine at both used concentrations during exposure for 24 and 72 hours.

БерберинЕХР Берберин CNV БерберинЕХР Берберин CNV

24 часа 4мкг/мл 24 часа 12 мкг/мл

■ ВАХ "BCL2

Рис. 11. Уровень копийности и экспрессии генов ВАХ и BCL2 под воздействием берберина в первые 24 часа.

Fig. 11. The copy number and expression level of BAXand BCL2 genes under the influence of berberine during the first 24 hours.

При использовании концентрации берберина 4 мкг/мл и экспозиции 72 часа уровень копийности ВАХ был 1,1 (р < 0,05), уровень копийности BCL2 составил 0,93 (р < 0,05). Разница между уровнем копийности ВАХ и BCL2 составила 1,18 раза в сторону увеличения ВАХ. При применении концентрации берберина 12 мкг/мл и экспозиции 72 часа уровень копийности ВАХ составил 1,29 (р < 0,05), а ВС£2-0,81 (р < 0,05). Разница между показателями копийности ВАХ и BCL2 составила 1,59 раза с преобладанием ВАХ (рис. 12). Уровень экспрессии локусов ВАХ и BCL2 под действием концентрации берберина 4 мкг/мл и 12 мкг/мл при обеих использованных экспозициях не претерпевал существенных изменений.

Воздействие производных фурана и азулена, выделенными из Р. hibridus (L.), вызвало следующие изменения копийности и экспрессии исследуемых генов. Так 2,4^Ь^гоху-2,5^те^у^игап-3(2Н)-опе (соединение под № 2) во временной экспозиции 24 часа и концентрации 4 мкг/мл увеличивал копийность CASP9 в 4,91 раза (р < 0,05), а копийность CASP3 при такой же экспозиции и концентрации увеличивалась в 21,1 раза (р < 0,05). 2,2,8-trimethyldecahydroazulene -5,6^сагЬаИе1^е (соединение под № 5.3) при действии в течение 24 часов в концентрации 4 мкг/мл вызвал увеличение копийности САБР9 в 5,14 раза (р < 0,05), а копийность CASP3 увеличивалась в 25,39 раза относительно контроля (р < 0,05) (рис. 13).

■ ВАХ 1BCL2

Рис. 12. Уровень копийности и экспрессии генов BAX и BCL2 под воздействием берберина в экспозиции 72 часа.

Fig. 12. The copy number and expression level of BAX and BCL2 genes under the influence of berberine after a 72-hour exposure.

Рис. 13. Уровень копийности и экспрессии генов CASP9, CASP8 и CASP3 в обеих использованных концентрациях при экспозиции 24 и 72 часа под воздействием 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one, 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde.

Fig. 13. The copy number and expression level of CASP9, CASP8, and CASP3 genes at both used concentrations after 24 and 72 hours of exposure under the influence of 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one, 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde.

Соединение 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one при экспозиции 24 часа и концентрации 12 мкг/мл вызывало увеличение копийности CASP9 в 4,58 раза (р < 0,05), а САБР3 в 13,30 раза (р < 0,05). 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde при концентрации 12 мкг/мл во временной экспозиции 24 часа увеличивал уровень копийности САБР9 в 19,18 раза (р < 0,05), а уровень САБР3 - в 24,81 раза (р < 0,05). Уровень экспрессии локусов САБР9, САБР8, CASP3 с временной экспозицией 24 часа и воздействии 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one, 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde в обеих концентрациях, использованных в эксперименте, не менялся статистически значимо (рис. 13).

Использованные нами производные фурана и терпеноиды, полученные из Р. hibridus (L.), оказали следующее влияние на изменения уровня копийности и экспрессии генов ТР53 и MDM2. Наиболее ярко выраженные изменения наблюдались при временной экспозиции 72 часа (рис. 14). Так 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one в концентрации 4 мкг/мл увеличил экспрессию ТР53 относительно контроля без воздействия в 2,19 раза (р < 0,05), на этом фоне снижался уровень экспрессии MDM2 в 1,35 раза (р < 0,05). Разница между экспрессией ТР53 и MDM2 при данном воздействии составила 1,62 раза в сторону увеличения ТР53 над MDM2. 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde с той же временной экспозицией 72 часа, но при концентрации 12 мкг/мл увеличивал экспрессию ТР53 в 2,58 раза относительно контроля, при этом уровень экспрессии MDM2 снижался до уровня, равного 0,35 (р < 0,05). Разница между экспрессией ТР53 и MDM2 в данном случае составила 7,37 раз.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании установлено, что все выделенные и верифицированные вторичные метаболиты растений оказывают цитотоксическое действие на клеточную линию HeLa, в большей или меньшей степени. Исходя из описанных выше результатов эксперимента, следует обратить внимание на то, что профиль относительного изменения экспрессии локусов TP53/MDM2 после воздействия берберином на клетки HeLa, совпадает как при экспозиции 24 часа, так и 72 часа в обеих использованных концентрациях. В каждой временной экспозиции отмечается наличие дозозависимого эффекта, так как уровень экспрессии ТР53 увеличивается с ростом применяемой концентрации берберина, хотя при этом с наблюдается снижение уровня экспрессии MDM2.

Как известно из проведенных ранее многочисленных исследований, белок р53 выполняет функцию супрессора злокачественных опухолей, а также может принимать участие в запуске апоптоза [25]. В то же время убиквитинлигаза Е3 MDM2 является негативным регулятором белка-супрессора опухоли р53. MDM2 связывает и убиквитинирует ТР53, способствуя его деградации. ТР53 является одним из ключевых генов-супрессоров опухолей и очень важен в процессе апоптоза в различных опухолевых клетках. Белок, кодируемый этим геном, является фактором транскрипции и контролирует инициацию клеточного цикла. Следовательно, ТР53 играет решающую роль в том, начинается ли деление клетки. Если клетка повреждена и не подлежит восстановлению, белок р53 будет участвовать в процессе инициации апоптоза. Например, белок р53 может ингибировать

■ ТР53 "MDM2

Рис. 14. Уровень экспрессии TP53 и MDM2 при экспозиции 72 часа.

Fig. 14. The expression levels of TP53 and MDM2 after a 72-hour exposure.

BCL2 с помощью BAX, что увеличивает соотношение BAX/BCL2, а также может индуцировать клеточный апоптоз с помощью APAF-1, который лежит в основе сигнала для CASP3. Белок p53 играет ключевую роль в противоопухолевом действии берберина. Недавнее исследование показало, что берберин может усиливать экспрессию белка p53, подавляя ингибитор MDM2 на посттранскрипционном уровне. Такое действие берберина в случае с использованной клеточной линией обусловлено тем, что HeLa изначально является носителем вируса папилломы человека, вирусный онкопротеин Е6 отвечает за инактивацию опухолевого супрессора р53 и, таким образом, играет решающую роль в онкогенезе, индуцированном ВПЧ. Вирусный белок E6 образует тримерный комплекс с эндогенной убиквитинлигазой E3 E6AP и ДНК-связывающим доменом. Однако развитие и про-грессирование опухолей шейки матки обусловлено экспрессией двух онкогенов, Е6 и Е7. ВПЧ E6 и E7 взаимодействуют с белками-супрессорами опухолей p53 и Rb соответственно. Е6 связывает и индуцирует убиквитин-опосредованную деградацию p53, в то время как E7 инактивирует белок Rb и изменяет дополнительные клеточные сигнальные пути, важные для трансформации.

Берберин, в свою очередь, может эффективно нацеливаться как на AP1, так и на вирусные онко-протеины Е6 и Е7. Ингибирование AP1 и блокирование экспрессии вирусных онкобелков Е6 и Е7 является одним из механизмов анти-ВПЧ действия берберина [26]. Кроме того, берберин также может усиливать экспрессию предшественника и зрелых форм miR-23a, которая может вызвать остановку клеточного цикла в стадии G2/M, индуцированную берберином. [27]. В нашем случае c использованием клеточной линии HeLa в качестве модельного объекта при оценке уровня цитотоксического действия исследуемых соединений Белокопытника гибридного, отмечался рост уровня экспрессии локуса TP53 и снижение уровня экспрессии локуса MDM2 при экспозиции 72 часа. В то же время наблюдаемые нами изменения уровня копийности генов BAX и BCL2 в случае воздействия берберином на клетки HeLa при временных экспозициях 24 и 72 часа, указывают на наличие проапоптотического ответа на данное воздействие. Так, при экспозиции 24 часа наблюдается явное превосходство уровня копийности локуса BCL2 над BAX, причем дозозависимо, с увеличением концентрации берберина увеличивается копийность BCL2. Однако, при экспозиции 72 часа уровень копийности BCL2 с концентрацией 4 мкг/мл снижается в 53 раза, а при концентрации 12 мкг/мл в 103 раза. Наблюдаемый в данном случае эффект берберина также подтверждается недавними исследования-

ми, в которых показано, что он индуцирует апоптоз в опухолевых клетках, за счет повышения регуляция проапоптотических генов BAD, BAX, BID и понижения регуляции генов, ингибирующих апоптоз BCL2, BCL2L2, BCL2L1. Также он ингибирует пролиферацию клеток линии рака шейки матки человека Ca Ski за счет изменения соотношения белков p53 и BAX/Bcl-2, активации АФК и усиления активности экспрессии каспазы-3 [28].

Увеличение уровня копийности генов CASP9 и CASP3 наблюдается как при воздействии берберином, так и c использованными нами в эксперименте производными фурана и азулена, экстрагированными из корней P. hibridus (L.). Как известно, CASP9 является одной из инициаторных каспаз: цитохром С, освобождаясь из мембран митохондрий, активирует CASP9, и посредством ее весь остальной каспазный каскад. Выход цитохрома C в цитозоль обуславливается состоянием мембанных каналов митохондрий которые, в свою очередь, контролируются белками семейства BAX и BCL2. Белки семейства BCL2, BCLX входят в состав митохондриальных мембран и закрывают каналы, тогда как белки семейства BAX выполняют обратную функцию, открывая их. При этом сами белки BAX находятся в цитоплазме, а при апоптогенных сигналах перемещаются к митохондри-альным мембранам, где образуют комплексы BCL-2/ BAX, в результате чего происходит деблокирование каналов [29].

Однако, в наших экспериментах увеличение копийности регистрируется только при экспозиции 24 часа, в то время как рост уровня экспрессии гена TP53 и снижение экспрессии MDM2, наблюдаемые нами в случае с использованием 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one и 2,2,8-tri methyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde, отмечается при временной экспозиции 72 часа. Полученные данные подтверждают известный факт о том, что ген TP53 является геном-супрессором опухолей и транскрипционным фактором, регулирующим клеточный цикл [30]. В целом это предполагает, что использованные в эксперименте вторичные метаболиты P hibridus (L.) в первые 24 часа запускают активацию CASP9 и CASP3, а по достижении времени экпози-ции 72 часа, когда накапливаются повреждения ДНК, влияют на уровень экспрессии TP53.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследования свидетельствуют о том, что алкалоид берберин, производные фурфурола и азулена способны оказывать воздействие на опухолевые клетки на уровне ДНК (показатель копийности) и матричной РНК (уровень экспрессии), что

отражается в изменении копийности и экспрессии ло-кусов CASP8, CASP9, CASP3, BAX, BCL2, TP53 и MDM2. Молекулярные изменения под воздействием этих соединений находят отражение в данных об инициации апоптоза в опухолевых клетках, полученных при помощи метода проточной цитофлюориметрии. По данным теста трипановым синим и проточной цитофлюориметрии, берберин (из всех использованных в эксперименте соединений) обладал наиболее выраженным цитотоксическим действием на клеточную

линию HeLa. В свою очередь, по данным ПЦР в режиме реального времени, производные фурфурола и азулена, выделенные из Р. hibridus (I.), также, как и берберин, показали наличие эффекта инициации апоптоза. Важно отметить, что использованные в эксперименте соединения Р. hibridus (I.) ранее активно не исследовались в этом аспекте, что в свою очередь дает основу для проведения дальнейших экспериментов с использованием этих соединений на линиях опухолевых клеток различных нозологий.

Список источников

1. Rosato I, Dalla Zuanna T, Tricarico V, Barbiellini Amidei C, Canova C. Adherence to cervical cancer screening programs in migrant populations: A systematic review and meta-analysis. Int J Environ Res Public Health. 2023;20(3):2200. https://doi.org/10.3390/ijerph20032200

2. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. https://doi.org/10.3322/ caac.21660

3. Gado F, Ferrario G, Della Vedova L, Zoanni B, Altomare A, Carini M, et al. Targeting Nrf2 and NF-kB signaling pathways in cancer prevention: The role of apple phytochemicals. Molecules. 2023;28(3):1356. https://doi.org/10.3390/molecules28031356

4. Alves-Silva JM, Romane A, Efferth T, Salgueiro L. North African Medicinal Plants Traditionally Used in Cancer Therapy. Front Pharmacol. 2017 Jun 26;8:383. https://doi.org/10.3389/fphar.2017.00383

5. Yan Z, Lai Z, Lin J. Anticancer properties of traditional Chinese medicine. Comb Chem High Throughput Screen. 2017;20(5):423-429. https://doi.org/10.2174/1386207320666170116141818

6. Habli Z, Toumieh G, Fatfat M, Rahal ON, Gali-Muhtasib H. Emerging cytotoxic alkaloids in the battle against cancer: Overview of molecular mechanisms. Molecules. 2017;22(2):250. https://doi.org/10.3390/molecules22020250

7. Hsiao YT, Kuo CL, Chueh FS, Liu KC, Bau DT, Chung JG. Curcuminoids induce reactive oxygen species and autophagy to enhance apoptosis in human oral cancer cells. Am J Chin Med. 2018;46(5):1145-1168. https://doi.org/10.1142/s0192415x1850060x

8. Bernardini S, Tiezzi A, Laghezza Masci V, Ovidi E. Natural products for human health: A historical overview of the drug discovery approaches. Nat Prod Res. 2018;32(16):1926-1950. https://doi.org/10.1080/14786419.2017.1356838

9. Kulinowski t, Luca SV, Minceva M, Skalicka-Wozniak K. A review on the ethnobotany, phytochemistry, pharmacology and toxicology of butterbur species (Petasites L.). J Ethnopharmacol. 2022;293:115263. https://doi.org/10.1016/jjep.2022.115263

10. Guo L, Li K, Cui ZW, Kang JS, Son BG, Choi YW. S-Petasin isolated from Petasites japonicus exerts anti-adipogenic activity in the 3T3-L1 cell line by inhibiting PPAR-y pathway signaling. Food Funct. 2019;10(7):4396-4406. https://doi.org/10.1039/c9fo00549h

11. Wang ZH, Hsu HW, Chou JC, Yu CH, Bau DT, Wang GJ, et al. Cytotoxic effect of s-petasin and iso-s-petasin on the proliferation of human prostate cancer cells. Anticancer Res. 2015;35(1):191-199.

12. Guo L, Kang JS, Kang NJ, Choi YW. S-petasin induces apoptosis and inhibits cell migration through activation of p53 pathway signaling in melanoma B16F10 cells and A375 cells. Arch Biochem Biophys. 2020;692:108519. https://doi.org/10.1016/j.abb.2020.108519

13. Matsumoto T, Imahori D, Saito Y, Zhang W, Ohta T, Yoshida T, et al. Cytotoxic activities of sesquiterpenoids from the aerial parts of Petasites japonicus against cancer stem cells. J Nat Med. 2020;74(4):689-701. https://doi.org/10.1007/s11418-020-01420-x

14. Lu B, Hu M, Liu K, Peng J. Cytotoxicity of berberine on human cervical carcinoma HeLa cells through mitochondria, death receptor and MAPK pathways, and in-silico drug-target prediction. Toxicol In Vitro. 2010;24(6):1482-1490. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2010.07.017

15. Zhu X, Yue H, Guo X, Yang J, Liu J, Liu J, Wang R, Zhu W. The Preconditioning of Berberine Suppresses Hydrogen Peroxide-Induced Premature Senescence via Regulation of Sirtuin 1. Oxid Med Cell Longev. 2017;2017:2391820. https://doi.org/10.1155/2017/2391820

16. Chuang TY, Wu HL, Min J, Diamond M, Azziz R, Chen YH. Berberine regulates the protein expression of multiple tumorigenesis-re-lated genes in hepatocellular carcinoma cell lines. Cancer Cell Int. 2017 May 30;17:59. https://doi.org/10.1186/s12935-017-0429-3

17. Luo H, Vong CT, Chen H, Gao Y, Lyu P, Qiu L, et al. Naturally occurring anti-cancer compounds: shining from Chinese herbal medicine. Chin Med. 2019;14:48. https://doi.org/10.1186/s13020-019-0270-9

18. Li J, Liu F, Jiang S, Liu J, Chen X, Zhang S, Zhao H. Berberine hydrochloride inhibits cell proliferation and promotes apoptosis of non-small cell lung cancer via the suppression of the MMP2 and Bcl-2/Bax signaling pathways. Oncol Lett. 2018 May;15(5):7409-7414. https://doi.org/10.3892/ol.2018.8249

19. Zhong XD, Chen LJ, Xu XY, Liu YJ, Tao F, Zhu MH, et al. Berberine as a potential agent for breast cancer therapy. Front Oncol. 2022;12:993775. https://doi.org/10.3389/fonc.2022.993775

20. Yao Z, Wan Y, Li B, Zhai C, Yao F, Kang Y, Liu Q, Lin D. Berberine induces mitochondrial mediated apoptosis and protective autoph-agy in human malignant pleural mesothelioma NCI H2452 cells. Oncol Rep. 2018 Dec;40(6):3603-3610. https://doi.org/10.3892/or.2018.6757

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

21. Rossberg M, Lendle W, Pfleiderer G, Togel A, Dreher EL, Langer E, et al. Chlorinated Hydrocarbons. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. Weinheim: Wiley-VCH; 2006. https://doi.org/10.1002/14356007.a06_233

22. Кит О. И., Филиппова С. Ю., Тимофеева С. В., Ситковская А. О., Златник Е. Ю., Колпаков С. А., и др. Влияние онколитических штаммов новой неклассифицированной группы ротавирусов человека на лимфоциты периферической крови. ЮжноРоссийский онкологический журнал. 2021;2(3):23-30. https://doi.org/10.37748/2686-9039-2021-2-3-3

23. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987;162(1):156-159. https://doi.org/10.1006/abio.1987.9999

24. Кутилин Д. С., Зинькович М. С., Гусарева М. А., Фаенсон А. В., Карнаухова Е. А., Розенко Л. Я., и др. Копийность генов как фактор устойчивости опухолевых клеток предстательной железы к облучению. Современные проблемы науки и образования. 2020;4:82. https://doi.org/10.17513/spno.29866

25. Suzuki N, Johmura Y, Wang TW, Migita T, Wu W, Noguchi R, et al. TP53/p53-FBXO22-TFEB controls basal autophagy to govern hormesis. Autophagy. 2021;17(11):3776-3793. https://doi.org/10.1080/15548627.2021.1897961

26. Warowicka A, Nawrot R, Gozdzicka-Jozefiak A. Antiviral activity of berberine. Arch Virol. 2020;165(9):1935-1945. https://doi.org/10.1007/s00705-020-04706-3

27. Zhang C, Sheng J, Li G, Zhao L, Wang Y, Yang W, et al. Effects of berberine and its derivatives on cancer: A systems pharmacology review. Front Pharmacol. 2020;10:1461. https://doi.org/10.3389/fphar.2019.01461

28. Liu D, Meng X, Wu D, Qiu Z, Luo H. A natural isoquinoline alkaloid with antitumor activity: Studies of the biological activities of berberine. Front Pharmacol. 2019;10:9. https://doi.org/10.3389/fphar.2019.00009

29. Suyatmi S, Mudigdo A, Purwanto B, Indarto D, Hakim FA, Krisnawati DI. Brazilin isolated from caesalpina sappan wood induces intrinsic apoptosis on A549 cancer cell line by increasing p53, caspase-9, and caspase-3. Asian Pac J Cancer Prev. 2022;23(4):1337-1343. https://doi.org/10.31557/apjcp.2022.23A1337

30. Levine AJ. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nat Rev Cancer. 2020;20(8):471-480. https://doi.org/10.1038/s41568-020-0262-1

References

1. Rosato I, Dalla Zuanna T, Tricarico V, Barbiellini Amidei C, Canova C. Adherence to cervical cancer screening programs in migrant populations: A systematic review and meta-analysis. Int J Environ Res Public Health. 2023;20(3):2200. https://doi.org/10.3390/ijerph20032200

2. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. https://doi.org/10.3322/caac.21660