CC BY
90
УДК 579.841.93:579.253:577.21.08
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТИПИРОВАНИЕ БАКТЕРИИ РОДА BRUCELLA, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В РЕСПУБЛИКЕ КАЗАХСТАН
© С. О. Садикалиева*, В. М. Строчков, М. Б. Орынбаев, К. А. Шораева, Б. А. Еспембетов, А. Р. Сансызбай, К. Т. Султанкулова
Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Республика Казахстан, п.г.т. Гвардейский.
*Email: [email protected]
В данной работе представлены результаты работ по молекулярно-генетическому титрованию бактерии рода Brucella, циркулирующих в Республике Казахстан, с использыванием метода MLVA, основанного на анализе локусных вариабельных тандемных повторов возбудителя. В результате проведенных исследований было установлено, что казахстанские штаммы бактерии рода Brucella образуют два отдельных кластера. К первому кластеру отнеслись штаммы Brucella abortus (B. abortus) 0036/Х, 0037/Х, Alakol 1 и Alakol 2, выделенные в ЮжноКазахстанской области и в Талдыкорганском регионе Алматинской области в 2012-2013 гг. Данные штаммы показали принадлежность к 1 биовару B. abortus. Второй кластер образовали штаммы 3 биовара B. abortus 0001/Н, 0002/Н, выделенные в Жамбылской области, 0006/B, 0007/B, 0008/B, выделенные в Алматинской области, 0038/X, 0009/X, выделенные в Южно-Казахстанской области, 0047/T, выденный в Северо-Казахстанской области, 0050/F, выделенный в Восточно-Казахстанской области, и 0046/E, выделенный в Атырауской области.
Ключевые слова: бактерии рода Brucella, бруцеллез, MLVA, ПЦР, локусы, мультиплексные реакции.
Введение
Бруцеллез относится к наиболее распространенным и опасным заболеваниям, наносящих большой экономический ущерб животноводству. Полная ликвидация бруцеллеза является актуальной задачей, стоящей перед отраслью медицины и ветеринарии. Сложность этой проблемы обусловливается рядом особенностей биологии возбудителя этого заболевания [1, 2].
Распространенность бруцеллезной инфекции не одинакова по регионам, его регистрируют в основном в животноводческих районах. Наиболее широко бруцеллез распространен в странах Средиземноморья, Малой Азии, Юга и Юго-Восточной Азии, Африки, Центральной и Южной Америки, в том числе и в Казахстане [3, 4].
В системе мероприятий по контролю и борьбе с бруцеллезом важное значение имеет своевременное выявление источника инфекции, выделение, идентификация и дифференциация возбудителя заболевания.
Бруцеллы не обладают строгой специфичностью к основному хозяину и способны поражать эволюционно далеко стоящие виды животных. Эта их способность имеет большое эпидемическое значение при переходе самого патогенного для человека вида бруцелл с мелкого на крупный рогатый скот и другие виды животных. При этом необходимо идентифицировать эпидемически опасные штаммы, характеризующиеся повышенной вирулентностью и персистенцией в организме хозяина.
В Республике Казахстан, несмотря на проводимые противоэпидемические и противоэпизоотиче-ские, санитарно-гигиенические и профилактические
мероприятия заболеваемость бруцеллезом не теряет свою актуальность.
Изоляты различных видов бруцелл, выделяемые в регионах Казахстана, характеризуют в основном фенотипическими методами, не позволяющими выявлять их внутривидовые особенности и связывать с территориями эпидемиологического неблагополучия по бруцеллезу. Решение этой проблемы видится в использовании современных методов моле-кулярно-генетического типирования изолятов бруцелл. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов бруцелл, выделяемых от различных природных хозяев, позволяет получать новые данные о генетическом родстве и разнообразии разных родов бруцелл, систематизировать возбудителей бруцеллеза в каталоги, сравнивать с существующими международными базами данных, что в итоге приводит к совершенствованию системы эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией в нашей стране.
Благодаря внедрению в практику молекулярно-генетических методов стало возможным проводить не только родовую и видовую идентификацию с помощью ПЦР, но и дифференциацию штаммов с использованием метода MLVA, основанного на анализе локусных вариабельных тандемных повторов возбудителя [5-8].
MLVA позволяет проводить определение видовой, подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности штаммов B. abortus. При этом метод мульти-локусного анализа обеспечивает различие между штаммами и кластеризацию штаммов по очаговой приуроченности.
Исходя из вышеперечисленных фактов, целью данной работы являлось проведение молекулярно-
генетического типирования штаммов бактерии рода Brucella, циркулирующих в Республике Казахстан.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. Объектом для исследований являлись 14 штаммов бактерии B. abortus выделенные из цельной крови, серопозитивных на
бруцеллез Крупного рогатого скота (КРС), из различных областей Республики Казахстан (табл. 1).
Выделение бактериальной ДНК. Выделение бактериальной ДНК проведен с использованием коммерческого набора "PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent" фирмы Applied Biosystems, согласно протоколу производителя.
Таблица 1
Штаммы бактерии рода Brucella___
№ Наименование штамма Регионы Объект выделения Год выде-
ления
1 Brucella abortus 0001/Н Жамбылская область Патологический мате- 2012
2 Brucella abortus 0002/M риал КРС 2012
3 Brucella abortus 0006/B 2012
4 Brucella abortus 0007/B Алматинская область КРС, кровь 2012
5 Brucella abortus 0008/B 2012
6 Brucella abortus 0009/X 2012
7 Brucella abortus 0036/X Южно-Казахстанская область КРС, кровь 2012
8 Brucella abortus 0037/X 2012
9 Brucella abortus 0038/X 2012
10 Brucella abortus Alakol 1 Алматинская область, Талдыкор- КРС, кровь 2013
11 Brucella abortus Alakol 2 ганский регион 2013
12 Brucella abortus 0046/E Атырауская область КРС, кровь 2013
13 Brucella abortus 0047/T Северо-Казахстанская область КРС, кровь 2013
14 Brucella abortus 0050/F Восточно-казахстанская область, Зайсанский район КРС, кровь 2013
Таблица 2
Олигонуклеотидные праймеры для наработки вариабельных локусов_
| Наименование | Последовательность праймера | Размер продукта (п.н) |
Bruce 30F PET-TGACCGCAAAACCATATCCTTC 119-199
Bruce 30R TATGTGCAGAGCTTCATGTTCG
Bruce 08F PET-ATTATTCGCAGGCTCGTGATTC 312-384
Bruce 08R ACAGAAGGTTTTCCAGCTCGTC
Bruce 11F 6FAM-CTGTTGATCTGACCTTGCAACC 257-1076
Bruce 11R CCAGACAACAACCTACGTCCTG
Bruce 45F 6FAM-ATCCTTGCCTCTCCCTACCAG 133-187
Bruce 45R CGGGTAAATATCAATGGCTTGG
Bruce 19F NED-GACGACCCGGACCATGTCT 76-202
Bruce 19R ACTTCACCGTAACGTCGTGGAT
Bruce 06F NED-GATTGCGGAACGTCTGAACT 140-542
Bruce 06R TAACCGCCTTCCACATAATCG
Bruce 42F VIC-CATCGCCTCAACTATACCGTCA 164-914
Bruce 42R ACCGCAAAATTTACGCATCG
Bruce 12F NED-CGGTAAATCAATTGTCCCATGA 302-452
Bruce 12R GCCCAAGTTCAACAGGAGTTTC
Bruce 18F PET-TATGTTAGGGCAATAGGGCAGT 130-186
Bruce 18R GATGGTTGAGAGCATTGTGAAG
Bruce 55F PET-TCAGGCTGTTTCGTCATGTCTT 193-553
Bruce 55R AATCTGGCGTTCGAGTTGTTCT
Bruce 21F 6FAM-CTCATGCGCAACCAAAACA 140-175
Bruce 21R GTGGATACGCTCATTCTCGTTG
Bruce 04F VIC-CTGACGAAGGGAAGGCAATAAG 144-360
Bruce 04R TGGTTTTCGCCAATATCAACAA
Bruce 07F NED-GCTGACGGGGAAGAACATCTAT 134-246
Bruce 07R ACCCTTTTTCAGTCAAGGCAAA
Bruce 09F VIC-GCGGATTCGTTCTTCAGTTATC 124-292
Bruce 09R GGGAGTATGTTTTGGTTGTACATAG
Bruce 43F 6FAM-TCTCAAGCCCGATATGGAGAAT 170-194
Bruce 43R TATTTTCCGCCTGCCCATAAAC
Bruce 16F 6FAM-ACGGGAGTTTTTGTTGCTCAAT 144-270
Bruce 16R GGCCATATCCTTCCGCAATA
МЬУЛ. Для проведения MLVA из базы данных о тандемных повторах были выбраны праймеры, фланкирующие 16 вариабельных локусов I и II хромосомы бруцелл.
Для упрощения и ускорения анализа MLVA были использованы 3 мультиплексных ПЦР.
СЕ3 bruce 07, bruce 09, bruce 43, bruce 16
ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 1x ПЦР буфер, по 0.8 mM каждого праймера, 0.04 ед. Taq-ДНК полемеразы, ДНК образца и деионизированной вода (свободная от ДНК-азы и РНК-азы). Температурный режим амплификации: денатурация - 94 °С 2 мин, репликация 30 циклов: 94 °С - 30 сек, 60 °С - 30 сек, 68 °С -1 мин, пострепликация 68 °С - 7 мин.
Для точного определения размеров ПЦР-про-дуктов, проводили фрагментный анализ на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 310 xl,
Applied Biosystems. В качестве стандарта молекулярных масс использовали GeneScan - 600 LIZ Size Standard, фирмы Applied Biosystems.
Размеры продуктов были получены с использованием программного обеспечения Peak Scanner. Результаты анализа были обработаны с использованием online-базы MLVA bank (http://mlva.u-psud.fr/mlvav4/genotyping/).
Результаты и обсуждения
При анализе данных, полученных на сервере MLVA bank, были построены филогенетические древы, исследованных казахстанских штаммов B. abortus (рис. 1, 2).
На рис. 1 представлено филогенетическое дерево казахстанских штаммов B. abortus, образующие 1 кластер.
Как видно из рис. 1, штаммы B. abortus 0036/Х, 0037/Х, Alakol 1 и Alakol 2, выделенные от КРС, относятся к 1 биовару и близкородственны со штаммами B. abortus, выделенными от КРС в Италии, Китае, Португалии, Сицилии, Монголии и в Бразилии. Штаммы B. abortus 0036/Х и 0037/Х, выделенные в южно-Казахстанской области, отличаются от перечисленных штаммов в локусах BRU18, BRU07, BRU16, BRU04. В штаммах B. abortus Alakol 1 и Alakol 2 отличия наблюдаются в локусах BRU06, BRU11, BRU30, BRU18, BRU16 и BRU04.
Таблица 3
Комбинации праймеров для мультиплексных реакции
Мультиплексные реакций
Локусы
СЕ1 СЕ2
bruce 30, bruce 08, bruce 11, bruce 45, bruce 19, bruce 06, bruce 42 bruce 12, bruce 18, bruce 55, bruce 21, bruce 04
Рис. 1. Филогенетическое дерево казахстанских штаммов B. abortus при кластеризации в соответствии с их типами
(MLVA-16). - штаммы, выделенные в Южно-Казахстанской области B. abortus 0036/Х, 003 7/Х и штаммы выделенные Талдыкорганском регионе Алматинской области B.abortus Alakol 1 и Alakol 2.
Рис. 2. Филогенетическое дерево казахстанских штаммов B. abortus при кластеризации в соответствии с их типами
(MLVA-16). ^ - штаммы B. abortus 0001/Н, 0002/Н, выделенные в Жамбылской области; штаммы B. abortus 0006/B, 0007/B, 0008/B, выделенные в Алматинской области; штаммы B. abortus 0038/X, 0009/X, выделенные в Южно-Казахстанской области; штамм B. abortus 0047/T, выделенный в Северо-Казахстанской области; штамм B. abortus 0050/F, выделенный в Восточно-Казахстанской области; штамм B. abortus 0046/E, выделенный в Атырауской области.
На рис. 2 представлено филогенетическое дерево казахстанских штаммов B. abortus, образующие 2 кластер.
Десять казахстанских штаммов B. abortus 0001/Н, 0002/Н, 0006/B, 0007/B, 0008/B, 0038/X, 0009/X, 0047/T, 0050/F, 0046/E, относятся к 3 биовару и показывают наибольшее сходство со штаммами B. abortus, выделенными от КРС в Китае, Италии и Португалии. Штаммы 0001/Н и 0002/Н, выделенные в Жамбылской области, отличаются от остальных казахстанских штаммов по локусам BRU11 и BRU08 соответственно. Основные различия казахстанских штаммов от штаммов из MLVA
базы наблюдаются в локусах BRU18, BRU19, BRU07, BRU09 и BRU16.
Таким образом, в результате проведения MLVA анализа было выявлено, что исследуемые штаммы бактерии рода Brucella, выделенные в различных регионах республики Казахстан образуют 2 отдельных кластера: B. abortus 1 биовар и B. abortus 3 биовар. Также полученные данные показали, что Казахстанские штаммы показали родство со штаммами, выделенными от КРС в Италии, Китае, Португалии, Сицилии, Монголии и в Бразилии. Монголия является наиболее близкорасположенной республикой к нашей стране, где практикуется
пастбищный метод ведения животноводства, и неблагополучная эпизоотическая ситуация по бруцеллезу мелкого и крупного скота сохраняется на протяжении нескольких десятилетий. Учитывая, что в Монголии выделяются изоляты B. abortus 1, 3 и 6 биоваров, можно предпологать общность их происхождения с казахстанскими изолятами, тем более, что в этих регионах происходит перемещение сельскохозяйственных животных [11].
Из литературных данных известно, что с момента создания точек дозорного эпиднадзора в Китае, была собрана и проанализирована коллекция изолятов бактерии рода Brucella. Было выявлено, что основной причиной бруцеллеза в различных эпидемических районах Китая и Монголии является B.melitensis как доминирующий вид, а также B. Abortus, B. suis как самые распространенные виды данной инфекции [12].
Возможность штаммовой дифференциации изолятов одного вида, быстрота и низкая стоимость проведения анализов в сочитании с простотой интерпретации результатов подтверждают преимущества MLVA при проведении эпидемиологического надзора за бруцеллезом на территории Республики Казахстан и сопредельных государствах.
ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вершилова П. А. Бруцеллез // Медицина. 1972.
2. Желудков М. М., Цирельсон Л. Е., Кулаков Ю. К. и др. //
Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. 2009. N°6. С. 23-28.
3. Аманфуз В., Уорд Д., Пите Л. Обзор эпидемиологии бруцеллеза в отдельных странах // Семинар по проблемам бруцеллеза людей и животных Казахстана, Узбекистана и Грузии. Алма-Ата. 2004. С. 89-92.
4. Кузнецов А. Н., Сыздыков М. С., Дуйсенова А. К., Абуова Г. Н., Бердалиева Ф. А., Дауылбаева С. Ф., Садовская В. П.. Информационное обеспечение эпидемиологического надзора за бруцеллезом с использованием ГИС-техноло-гии. - http://journal.ksph.kz/contents/v10n4_2011 .pdf
5. Le Flèche P., Jacques I., Grayon M., Al Dahouk S., Bouchon P., Denoeud F. et al. Evaluation and selection of tandem repeat loci for a Brucella MLVA typing assay // BMC Microbiol. 2006. V. 6. P. 1-14.
6. Scholz H. C., Hubalek Z., Sedlâcek I., Vergnaud G., Tomaso H., Al Dahouk S. et al. Brucella microti sp. nov., isolated from the common vole Microtus arvalis // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. V. 58. P. 375-382.
7. Lindstedt B. A. Multiple-locus variable number tandem repeats analysis for genetic fingerprinting of pathogenic bacteria // Electrophoresis. 2005. V. 26. P 2567-2582.
8. Chang C. H., Chang Y. C., Underwood A. et al. VNTRDB: a bacterial variable number tandem repeat locus database // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. P. 416-421.
9. Marianelli C., Petrucca A., Pasquali P., Ciuchini F., Papadopou-lou S. et al. Use of MLVA-16 typing to trace the source of a laboratory-acquired Brucella infection // J. Hosp. Infect. 2008. V. 68. P. 274-276.
10. Al Dahouk S., Le Flèche P., Nockler K., Jacques I., Grayon M. et al. Evaluation of Brucella MLVA typing for human brucellosis // J. Microbiol Methods. 2007. V. 69. P. 137-145.
11. Zhang W. Y., Guo W. D., Sun S. H., Jiang J. F., Sun H. L., Li S. L., Liu W., Cao W. C. Human brucellosis, Inner Mongolia, China // Emerg. Infect. Dis. 2010. V.16. P. 2001-2003.
12. Shang D. Q., Xiao D. L., Yin J. M. Epidemiology and control ofbrucellosis in China // Vet. Microbiol. 2002. V. 90. P. 165182.
Поступила в редакцию 18.05.2017 г.
MOLECULAR-GENETIC TYPING OF BACTERIA OF GENUS BRUCELLA CIRCULATED IN THE REPUBLIC OF KAZAKHSTAN
© S. O. Sadikalieva*, V. M. Strochkov, M. B. Orynbaev, K. A. Shorayeva, B. A. Espembetov, A. R. Sansyzbay, K. T. Sultankulova
Research Institute for Biological Safety Gvardeisky town, Jambyl region, Republic of Kazakhstan.
*Email: sadikalieva86@mail. ru
In this paper, the authors present the results of work on the molecular genetic typing of bacteria of the genus Brucella circulating in the Republic of Kazakhstan, using the MLVA method based on the analysis of variable number tandem repeats loci of the pathogen. When analyzing the data obtained on the MLVA bank server, phylogenetic trees were constructed with studied Kazakh strains of B. abortus. As a result of the study, it was found that Kazakhstan strains of the Brucella genus form two separate clusters. The strains B. abortus 0036/X, 003 7/X, Alakol 1 and Alakol 2, isolated in the South Kazakhstan oblast and in the Taldykorgan region of Almaty oblast in 2012-2013, belong to the first cluster. These strains showed belonging to biovar 1 B. abortus, and are closely related to B. abortus strains isolated from cattle in Italy, China, Portugal, Sicily, Mongolia, and Brazil. Differences of Kazakhstan strains from the above mentioned strains are mainly observed in the loci BRU04, BRU06, BRU07, BRU11, BRU16, BRU18 and BRU30. The second cluster formed strains of biovar 3 B. abortus 0001/H, 0002/H, 0006/B, 0007/B, 0008/B, 0038/X, 0009/X, 0047/T, 0050/Fand 0046/E. These strains show the greatest similarity with B. abortus strains isolated from cattle in China, Italy and Portugal. The main differences of Kazakhstan strains from strains from the MLVA database are observed in the loci BRU18, BRU19, BRU07, BRU09 and BRU16.
Keywords: Brucella bacteria, brucellosis, MLVA, PCR, loci, multiplex reaction.
Published in Russian. Do not hesitate to contact us at [email protected] if you need translation of the article.
REFERENCES
1. Vershilova P. A. Brutsellez. Meditsina. 1972.
2. Zheludkov M. M., Tsirel'son L. E., Kulakov Yu. K. i dr. Epidemiol. i vaktsinoprofilaktika. 2009. No. 6. Pp. 23-28.
3. Amanfuz V., Uord D., Pite L. Seminar po problemam brutselleza lyudei i zhivotnykh Kazakhstana, Uzbekistana i Gruzii. Alma-Ata. 2004. Pp. 89-92.
4. Kuznetsov A. N., Syzdykov M. S., Duisenova A. K., Abuova G. N., Berdalieva F. A., Dauylbaeva S. F., Sadovskaya V. P.. Informatsionnoe obespechenie epidemiologicheskogo nadzora za brutsellezom s ispol'zovaniem GIS-tekhnologii. - http://journal.ksph.kz/con-tents/v 10n4_2011 .pdf
5. Le Flèche P., Jacques I., Grayon M., Al Dahouk S., Bouchon P., Denoeud F. et al. Evaluation and selection of tandem repeat loci for a Brucella MLVA typing assay. BMC Microbiol. 2006. Vol. 6. Pp. 1-14.
6. Scholz H. C., Hubalek Z., Sedlâcek I., Vergnaud G., Tomaso H., Al Dahouk S. et al. Brucella microti sp. nov., isolated from the common vole Microtus arvalis. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. Vol. 58. Pp. 375-382.
7. Lindstedt B. A. Electrophoresis. 2005. Vol. 26. P 2567-2582.
8. Chang C. H., Chang Y. C., Underwood A. et al. VNTRDB: a bacterial variable number tandem repeat locus database. Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35. Pp. 416-421.
9. Marianelli C., Petrucca A., Pasquali P., Ciuchini F., Papadopoulou S. et al. Use of MLVA-16 typing to trace the source of a laboratory-acquired Brucella infection. J. Hosp. Infect. 2008. Vol. 68. Pp. 274-276.
10. Al Dahouk S., Le Flèche P., Nöckler K., Jacques I., Grayon M. et al. Evaluation of Brucella MLVA typing for human brucellosis. J. Microbiol Methods. 2007. Vol. 69. Pp. 137-145.
11. Zhang W. Y., Guo W. D., Sun S. H., Jiang J. F., Sun H. L., Li S. L., Liu W., Cao W. C. Emerg. Infect. Dis. 2010. V.16. Pp. 2001-2003.
12. Shang D. Q., Xiao D. L., Yin J. M. Vet. Microbiol. 2002. Vol. 90. Pp. 165-182.
Received 18.05.2017.
