CC BY
27
СОВРЕМЕННАЯ ГЕРПЕТОЛОГИЯ. 2013. Том 13, вып. 3/4. С. 117 - 121
УДК 597.841:591.16
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛОКАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ЧЕСНОЧНИЦЫ ОБЫКНОВЕННОЙ PELOBATES FUSCUS (LAURENTI, 1768) ДОЛИНЫ р. МЕДВЕДИЦА (САРАТОВСКАЯ ОБЛАСТЬ) ПО УЧАСТКУ ГЕНА мтДНК - CytB
А. В. Полуконова 1, А. Г. Демин 1, Н. В. Полуконова 2, М. В. Ермохин 1, В. Г. Табачишин 3
1 Саратовский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского Россия, 410012, Саратов, Астраханская, 83 2 Саратовский государственный медицинский университет им. В. И. Разумовского Россия, 410012, Саратов, Б. Казачья, 112 3 Саратовский филиал Института проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН
Россия, 410028, Саратов, Рабочая, 24 E-mail: annypol@rambler.ru
Поступила в редакцию 14.11.2012 г.
Сравнивали участок гена мтДНК - CytB чесночницы обыкновенной (Pelobates fuscus (Laurenti, 1768)) из двух локальных популяций (озёра Садок и Кругленькое в долине р. Медведица в Саратовской области). Все определенные гаплотипы P. fuscus относятся к восточной форме этого вида. Из семи выявленных гаплотипов один был известен ранее (E9), а шесть - обнаружены впервые и обозначены как Е12 - Е17. Уникальные гаплотипы P. fuscus из популяции оз. Кругленькое (Е15, Е16 и Е17) отличаются значительно большей удаленностью как от всех ранее известных гаплотипов восточной формы, так и от новых гаплотипов из популяции оз. Садок. Совокупность проанализированных гаплотипов объединяется в три кластера: первый кластер представлен новыми гаплотипами Е15 и Е17, второй - новыми гаплотипами Е12 и Е13, а третий - объединяет как уже известные гаплотипы Е1 - Е7, Е9 - Е11, так и новые - Е14 и Е16. Ключевые слова: Pelobates fuscus, гаплотипы, Саратовская область.
ВВЕДЕНИЕ
Чесночница обыкновенная (Pelobates fus-cus (Laurenti, 1768)) - широко распространенный вид бесхвостых амфибий, достигающий высокой численности в долинах рек (Ермохин, Табачишин, 2010, 2011 а, б). Долгое время этот вид считался морфологически консервативным и моно-морфным. Однако после привлечения к исследованию его генетической структуры новых подходов анализа (проточной ДНК-цитометрии, электрофореза белков, секвенирования гена мтДНК - CytB) стало очевидно, что вид не только полиморфен, но и, по-видимому, может оказаться политипическим, в настоящее время включающим, по крайней мере, две формы - западную и восточную (Халтурин и др., 2003; Бор-кин и др., 2001; Borkin et al., 2001; Crottini et al., 2007). В связи с этим было выдвинуто предположение о том, что в случае с P. fuscus имеет место криптическое видообразование, приводящее к возникновению внешне практически неразличимых, но генетически различных видов (Халтурин и др., 2003).
В ходе молекулярно-биологических исследований различных групп животных, в том числе бесхвостых амфибий, анализ гаплотипов таких генов мтДНК, как COI, COII, CytB, позволил достоверно установить внутривидовую и видовую принадлежность, а также оценить генетическое разнообразие популяций (Полуконова и др., 2009; Демин и др., 2011; Полуконова и др., 2013; Crottini et al., 2007; Cranston et al., 2010). К настоящему времени получены данные по гапло-типам гена мтДНК - CytB для 61 локальной популяции P. fuscus (Crottini et al., 2007). Однако популяции P. fuscus в Саратовской области до настоящего времени изучены недостаточно.
Цель настоящего исследования - на основе анализа участка гена мтДНК - CytB оценить генетическое разнообразие гаплотипов P. fuscus на неисследованной ранее территории, а также установить, к какой внутривидовой форме (западной или восточной) относятся гаплотипы особей этого вида, нерестящихся в озёрах Садок и Кругленькое долины р. Медведица (Саратовская область).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использованы особи чесночницы обыкновенной - Ре1оЪМе8 /шеш, собранные в 2012 г. в озёрах Садок и Кругленькое в долине р. Медведица Лысогорского района Саратовской области (табл. 1). Всего было исследовано 13 особей. Материалом для выделения ДНК послужила печень чесночниц, фиксированная в 95%-ном этиловом спирте.
Таблица 1
Материал и места сбора
№ п/п Популяция Время сбора Обозначение сиквенса
1 Саратовская обл., 07.2012 г. S2, S3, S8
оз. Садок 04.2012 г. S9, S11
2 Саратовская обл., 04.2012 г. К1, К13, К14, К16
оз. Кругленькое 07.2012 г. К4, К5, К6, К7
Определена последовательность нуклео-тидов (п. н.) на участке 14676 - 15378 п. н. гена мтДНК - CytB (Gissi et al., 2008). В работе также использовано 24 нуклеотидных последовательностей гена CytB, относящихся к восточной форме P. fuscus, депонированные в GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov), каталожные номера которых приведены в табл. 2.
Выделение тотальной ДНК проводилось набором Diatomtm DNA Prep 100 «Изоген», амплификация гена CytB - набором GenePak@ PCR Core «Изоген» на термоциклере «Терцик». ПЦР-амплификация: структура праймеров для амплификации гена CytB: L15162 (light chain; 5'-GCAAGCTTCTACCATGAGGACAAATATC-3') (Taberlet, Bouvet, 1992) и H15915 (heavy chain; 5'-AACTGCAGTCATCTCCGGTTTACAAGAC-3 '). Условия ПЦР: I. 94° - 1'; II. 5 циклов: a) 94° - 1', b) 45° - 1.5', c) 72° - 1.5'; III. 35 циклов: a) 94° -1', b) 50°- 1.5', c) 72° - 1'; IV. 72° - 5'.
Детекция ПЦР-продуктов проводилась с помощью горизонтального электрофореза в 1%-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия. В качестве буфера использовался стандартный трис-ацетатный буфер. Для элюции ПЦР-продуктов из геля применялся набор Dia-tomtm DNA Elution «Изоген». Определение первичной нуклеотидной последовательности генов проводилось на базе ЗАО ЕВРОГЕН (г. Москва) на секвенаторе Backman 2000.
Для коррекции полученных последовательностей использовалась программа Chro-masPro, множественное выравнивание проводилось в ClustalW, филогенетические построения
методом Minimum Evolution и анализ генетических дистанций выполнялись в программе Mega5. Генетические дистанции рассчитывались методом Maximum Composite Likelihood. При построении дендрограммы в качестве внешней группы выбраны сиквенсы западной формы P. fuscus (www.ncbi.nlm.nih.gov).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Все полученные сиквенсы гена мтДНК -CytB P. fuscus из двух исследованных саратовских популяций свидетельствовали об их принадлежности гаплотипам восточной формы этого вида. Анализ нуклеотидных последовательностей CytB на основе /»-дистанций позволил провести их распределение по гаплотипам (см. табл. 2).
Таблица 2
Соответствие гаплотипов восточной формы P. fuscus сиквенсам
Число исследо- Accession
Гаплотип ванных популяций с данным гаплотипом № GenBank или сиквенс Источник
Е1 12 EF133842 Crottini et al.,
Е2 1 EF133843 2007
Е3 1 EF133844
Е4 2 EF133845
Е5 1 EF133846
Е6 1 EF133847
Е7 1 EF133848
Е8 3 EF133849
Е9 4 EF133850 Crottini et al., 2007
К1, К4, К5, Собственные
К6, данные
S2, S11
Е10 1 EF133851 Crottini et al.,
Е11 1 EF133852 2007
Е12* 1 S3 Собственные
Е13* 2 К7 данные
S8
Е14* 1 S9
Е15* 1 К13
Е16* 1 К14
Е17* 1 К16
* Обозначены впервые описанные гаплотипы.
К одному и тому же описанному ранее га-плотипу Е9 (Сгойш et а1., 2007), наряду с н. п. ЕБ133850, относятся и отсеквенированные нами н. п. чесночниц из оз. Кругленькое (К1, К4, К5, К6) и оз. Садок (82, 811), поскольку между ними не выявлено ни одной нуклеотидной замены.
Другие же обнаруженные нами гаплотипы оказались новыми для восточной формы Р. /шсш: Е12 - Е17 (см. табл. 2).
На основе анализа нуклеотидной последовательности СуХБ Р. /иъсш методом минимальной эволюции построена дендрограмма, объединяющая как известные ранее гаплотипы восточной формы, так и впервые обнаруженные в популяциях этого вида на территории Саратовской области (рисунок). Анализ структуры дендро-граммы показал присутствие трёх четких кластеров. Первый кластер включает сиквенсы Р./шсш из оз. Кругленькое (К13 и К16), представляющие собой два новых для вида гаплотипа (Е15 и Е17). Второй кластер содержит сиквенсы популяций Р. /шсш из оз. Кругленькое (К7) и оз. Садок (83 и 88), относящиеся к новым для вида гаплотипам (Е12 и Е13). Третий кластер объединяет сиквенсы из ОепБапк (ЕБ133842, ЕБ133843, ЕБ133844, ЕБ133845, ЕБ133846, ЕБ133847, ЕБ133848, ЕБ133850, ЕБ133851, ЕБ133852) как уже известные для вида гаплотипы (Е1 - Е11), так и новые, из популяции из озёр Кругленькое (К1, К4, К5, К6, К14) и Садок (82, 89, 811), часть из которых относится к новым для вида гаплотипам - Е14 и Е16 (см. рисунок).
Разнообразие гаплотипов в Саратовских популяциях Р. /иъсш несколько выше в локальной популяции, нерестящейся в оз. Садок - из четырех проанализированных сиквенсов обнаружено три гаплотипа (0.75), по сравнению с оз. Кругленькое, в котором из девяти сиквенсов были выявлены шесть гаплотипов (0.67).
Гаплотип Е1, по-видимому, относится к гаплотипам-основателям, поскольку был отмечен ранее в 12 географически разобщенных популяциях Р. /шсш (Сгоййш е! а1., 2007). Такой гаплотип, как Е9, по-видимому, наиболее близок к гаплотипам-основателям, поскольку встречен и в других популяциях (см. табл. 2). В то время как новые гаплотипы (Е12 - Е17) встречены пока только на территории Саратовской области и, очевидно, образовались позднее. В оз. Садок из четырёх гаплотипов Р. /шсш два были встрече -ны также в популяции оз. Кругленькое (Е9 и Е13), а другие два (Е12, Е14) были уникальными. Из пяти выявленных
гаплотипов Р. /шсш в популяции оз. Кругленькое два оказались общими с гаплотипами оз. Садок, а остальные три - уникальными (Е15 - Е17). Учитывая биологические особенности Р./иъсш, заключающиеся в репродуктивном консерватизме (нерест половозрелых особей происходит только в том водоёме, в котором они проходили личиночное развитие (Ие^, 2002), можно предположить, что уникальные гаплотипы, очевидно, более молодые и возникли после заселения этими амфибиями исследуемых водоёмов.
Новые для восточной формы Р./шсш гап-лотипы, обнаруженные в Саратовской области, в разной степени отличались от ранее известных. Так, по значениям /»-дистанции наиболее близким к гаплотипу Е14 из популяции оз. Садок следует считать ранее известный Е9 (0.001); к гаплотипу Е12 - только новый гаплотип Е13 (0.004); к Е13 наиболее близок Е9 (0.003). Гаплотипы Е12 и Е13 наиболее близки и образуют единый кластер II (см. рисунок).
Уникальные гаплотипы Р. /шсш из популяции оз. Кругленькое характеризуются значи-
Западная форма
> P. fuscus K13 E15*
0.005
1 • P. fuscus K16 E17*
• P. fuscus S3 E12* _
• P. fuscus S8 E13* II
• P. fuscus K7 E13*_ P. fuscus EF133849 E8
— P. fuscus EF133852 E11
— P. fuscus EF133843 E2
— • P. fuscus K14 E16*
— P. fuscus EF133847 E6
— • P. fuscus S9 E14* P. fuscus EF133850 E9 P. fuscus EF133842 E1
• P. fuscus K6 E9
• P. fuscus S11 E9
— P. fuscus EF133848 E7
• P. fuscus K1 E9
— P. fuscus EF133845 E4
• P. fuscus K4 E9
— P. fuscus EF133844 E3
• P. fuscus S2 E9
— P. fuscus EF133851 E10
• P. fuscus K5 E9
— P. fuscus EF133846 E5
III
р
о ф
я
Дендрограмма сиквенсов гаплотипов P. fuscus, полученная на основе анализа нуклеотидной последовательности CytS методом минимальной эволюции; после видового названия на дендрограмме указан Accession № GenBank или полученный нами сиквенс, № гаплотипа, звездочкой обозначен номер нового для вида гаплотипа
тельно большей удаленностью как от ранее известных гаплотипов, так и от новых из оз. Садок. Так, согласно значениям /-дистанции, гаплотип Е16 отдален от всех остальных гаплотипов дистанцией от 0.004 до 0.011; гаплотип Е17 - дистанцией от 0.005 до 0.010. Наиболее удален от других гаплотипов Е15 - от 0.017 до 0.026. Гап-лотипы Е15 и Е17 образуют единый кластер I. Такие гаплотипы, как Е1 - Е7, Е9 - Е11, а также Е14 и Е16 также образуют единый, третий кластер, куда входят гаплотипы, удаленные от первых двух кластеров (см. рисунок).
Полученные результаты дают основание полагать, что совокупность гаплотипов P. fuscus из популяции оз. Кругленькое могла возникнуть позднее при заселении этого озера. Кроме того, несмотря на незначительную удаленность исследованных озёр друг от друга, локальные популяции чесночниц, нерестящиеся в них, оказались в значительной степени репродуктивно изолированными.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Сиквенсы гена мтДНК - CytB, особей нерестящихся в озёрах Садок и Кругленькое долины р. Медведица (Саратовская область), свидетельствуют об их принадлежности гаплотипам восточной формы P. fuscus. Такие результаты вполне согласуются с уже имеющимися данными о распространении чесночниц восточной формы в центре и на юго-востоке Европейской части России (Халтурин и др., 2003).
Детальный анализ сиквенсов гена мтДНК - CytB P. fuscus позволяет оценить генетическое разнообразие гаплотипов этого вида на исследуемой территории. Обнаружение новых гаплотипов в неизученных ранее локальных популяциях P. fuscus в Саратовской области свидетельствует о том, что разнообразие гаплотипов митохондриального гена Cyt B у этого вида еще недостаточно изучено. Были выявлены семь гап-лотипов, из которых один был известен ранее (E9) (Crottini et al., 2007), а шесть оказались новыми для восточной формы этого вида: Е12 -Е17. Таким образом, из 61 исследованных ранее локальных популяций чесночницы обыкновенной было описано всего 11 гаплотипов, в то время как только из двух локальных саратовских популяций еще шесть. Поэтому есть основание полагать, что исследование генетического разнообразия локальных популяций P. fuscus на юго-востоке Европейской части России далеко от завершения и, очевидно, должно быть про-
должено. Полученные результаты будут в дальнейшем использованы для решения проблемы внутренней генетической и экологической структуры чесночницы обыкновенной, а также для формирования представлений о происхождении локальных популяций этого вида.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Боркин Л. Я., Литвинчук С. Н., Мильто К. Д., Розанов К. М., Халтурин М. Д. 2001. Критическое видообразование у Pelobates fuscus (Amphibia, Peloba-tidae): цитометрические биохимические доказательства // Докл. РАН. Т. 376, № 5. С. 707 - 709.
Демин А. Г., Полуконова Н. В., Мюге Н. С. 2011. Молекулярная филогения и время дивергенции комаров- звонцов (Chironomidae, Nematocera, Diptera) на основе частичной последовательности гена первой субъединицы цитохром-с-оксидазы (COI) // Генетика. Т. 47, № 10. С. 1315 - 1327.
Ермохин М. В., Табачишин В. Г. 2010. Динамика размерной и половой структуры сеголеток чесночницы обыкновенной - Pelobates fuscus (Laurenti, 1768) в пойме р. Медведицы // Совр. герпетология. Т. 10, вып. 3/4. С. 101 - 108.
Ермохин М. В., Табачишин В. Г. 2011 а. Зависимость репродуктивных показателей самок Pelobates fuscus (Laurenti, 1768) от размерных и весовых характеристик // Совр. герпетология. Т. 11, вып. 1/2. С. 28 -39.
Ермохин М. В., Табачишин В. Г. 2011 б. Сходимость результатов учета численности мигрирующих сеголеток чесночницы обыкновенной, Pelobatus fuscus (Laurenti, 1768), при полном и частичном огораживании нерестового водоёма заборчиками с ловчими цилиндрами // Совр. герпетология. Т. 11, вып. 3/4. С. 121 - 131.
Полуконова Н. В., Демин А. Г, Мюге Н. С., Шайкевич Е. В. 2009. Сравнение Chironomus usenicus и Ch. curabilis с видами группы plumosus (Diptera) по гену митохондриальной днк COI и рисунку дисков поли-тенных хромосом // Генетика. Т. 45, № 8. С. 1 - 7.
Полуконова Н. В., Демин А. Г., Мюге Н. С. 2013. Молекулярные критерии в систематике насекомых : диапазон изменчивости штрихкодового гена COI как таксономический критерий рода, трибы и подсемейства, на примере комаров-звонцов Chironominae и Orthocladiinae (Chironomidae, Diptera) // Журн. общей биологии. Т. 74, № 1. С. 66 - 76.
Халтурин М. Д., Литвинчук С. Н., Боркин Л. Я, Розанов Ю. М., Мильто К. Д. 2003. Генетическая изменчивость у двух форм обыкновенной чесночницы Pelobates fuscus (Pelobatidae, Anura, Amphibia), различающихся по размеру генома // Цитология. Т. 45, № 3. С. 308 - 323.
Borkin L. J., Litvinchuk S. N., Rosanov J. M., Milto K. D. 2001. Cryptic speciation in Pelobates fuscus (Anura, Pelobatidae) : evidence from DNA flow cytometry // Amphibia - Reptilia. Vol. 22. P. 387 - 396.
Cranston P., Hardy N., Morse G., Pusledni L. K., Mc Cluen S. R. 2010. When molecules and mor-
phology concur : the «Gondwanan» midges (Diptera : Chironomidae) // Systematic Entomology. Vol. 35, № 4. Р. 636 - 648.
Crottini A., Andreone F, Kosuch J., Borkin L. J., Litvinchuk S. N., Eggert C., Veith M. 2007. Fossorial but widespread : the phylogeography of the common spade-foot toad (Pelobates fuscus), and the role of the Po Valley as a major source of genetic variability // Molecular Ecology. Vol. 16. P. 2734 - 2754.
Gissi C., Iannelli F., Pesole G. 2008. Evolution of the mitochondrial genome of Metazoa as exemplified by comparison of congeneric species // Heredity. Vol. 101. P. 301 - 320.
Hels T. 2002. Population dynamics in a Danish metapopulation of spadefoot toads Pelobates fuscus // Ecography. Vol. 25, № 3. P. 303 - 313.
Taberlet P., Bouvet J. 1992. Bear conservation genetics // Nature. Vol. 358. P. 197.
A MOLECULAR-GENETIC STUDY OF SPADEFOOT TOAD PELOBATES FUSCUS (LAURENTI, 1768) LOCAL POPULATIONS FROM THE MEDVEDITSA RIVER VALLEY (SARATOV REGION) BY mtDNA - CytB GENE
A. V. Polukonova 1, A. G. Djomin 1, N. V. Polukonova 2, M. V. Yermokhin 1, and V. G. Tabachishin 3
1 Saratov State University named after N. G. Chernyshevsky 33 Astrakhanskaya Str., Saratov 410012, Russia E-mail: annypol@rambler.ru Saratov State Medical University named after V. I. Razumovsky 112 B. Kazach'ya Str., Saratov 410012, Russia 3 Saratov branch of A. N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution, Russian Academy of Sciences
24 Rabochaya Str., Saratov 410028, Russia
A part of the mtDNA - CytB gene of Pelobates fuscus from two local populations (Sadok and Krug-len'koye lakes, the Medveditsa river valley, Saratov region) was compared. All the nucleotide sequences of P. fuscus are most similar with the eastern form of this species. Seven gaplotypes were revealed from the 13 sequences analyzed. One of them had been known before (E9), and six ones were found for the first time and marked as E12 - E17. The unique gaplotypes of the spadefoot toad from the Kruglen'koye lake population (E15, E16, and E17) are characterized by significantly longer distances from the other known gaplotypes and from the new gaplotypes of the Sadok lake population. A first cluster of the dendrogram includes the new gaplotypes E15 and E17, a second cluster does the new gaplotypes E12 and E13, and a third cluster does the gaplotypes E1 - E7, E9 - E11 known before and two new ones (E14 and E16).
Key words: Pelobates fuscus, gaplotypes, Saratov region.
