CC BY
39
№ 4 - 2013 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 616.13/.14-089:616-002:575.852
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ
КОНТРОЛЬ ХРОНИЧЕСКИХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ У ПАЦИЕНТОВ ПОСЛЕ БЕДРЕННО-ПОДКОЛЕННОГО ПРОТЕЗИРОВАНИЯ БИЛОГИЧЕСКИМ ПРОТЕЗОМ «КЕМАНГИОПРОТЕЗ»
Н. Н. Бурков, И. Ю. Журавлева
ФГБУ «НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» СО РАМН
(г. Кемерово)
Целью настоящего исследования явился анализ роли некоторых цитокинов в развитии рестеноза и тромбоза биологических протезов «КемАнгиопротез», а также оценка влияния полиморфных вариантов генов на экспрессию про- и противовоспалительных интерлейкинов. I группу (п = 52) составили пациенты с неблагоприятным исходом (рестеноз протеза, у 35-ти больных сопровождавшийся тромбозом); II группу (п = 59) — больные с функционирующими и неизмененными протезами. У больных I группы выявлен достоверно более высокий уровень маркера хронического воспаления IgG и ГЬ-8(р = 0,01).Анализ влияния полиморфных вариантов генов на экспрессию про-и противовоспалительных интерлейкинов показал, что полиморфизм генов провоспалительных цитокинов (Т№^а, ГЬ-8, ГЬ-6) является высокопродуцирующим. Отмечена явная тенденция к более частой встречаемости полиморфных аллелей генов провоспалительных цитокинов у пациентов с осложненным отдаленным послеоперационным периодом.
Ключевые слова: рестеноз зон анастомозов, биологические протезы «КемАнгиопротез», предикторы, полиморфизм генов интерлейкинов.
Бурков Николай Николаевич — научный сотрудник лаборатории кардиоваскулярного биопротезирования ФГБУ «НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», рабочий телефон: 8 (384-2) 64-05-69, е-таП: burkovn79@mail.ru
Журавлева Ирина Юрьевна — доктор медицинских наук, профессор главный научный сотрудник лаборатории кардиоваскулярного биопротезирования отдела экспериментальной и клинической кардиологии ФГБУ «НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», рабочий телефон/факс: 8 (384-2) 64-16-53, е-таП: bio@cardio.kem.ru
Введение. В настоящее время доказано, что дисфункция эндотелия, гиперпролиферация гладкомышечных клеток, воспалительные реакции в сосудистой стенке артерии реципиента приводят к сужению просвета анастомоза и развитию реокклюзий артериальных протезов [1-4].
Известно, что функциональный (ответственный за измененную экспрессию и продукцию соответствующего белка) полиморфизм генов, кодирующих ряд известных про-и противовоспалительных цитокинов, несущих небольшие мутационные изменения, может приводить к дисбалансу воспалительного иммунного ответа. Выявлены аллельные варианты генов ряда про- и противовоспалительных цитокинов, ответственные за повышенную продукцию кодируемых ими белков: TNF-a(G308A)/(rs1800629), IL-10 (A1082G)/(rs1800896), IL-6 (G1888T)/(rs1554606), IL-8 (А251Т) /(rs4073), частота встречаемости которых в ряде популяций в гетерозиготном виде достигает 40-50 %, а в гомозиготном 10-15 % [6].
Целью настоящего исследования явился анализ роли некоторых цитокинов в развитии рестеноза и тромбоза биологических протезов «КемАнгиопротез», а также оценка влияния полиморфных вариантов генов на экспрессию про- и противовоспалительных интерлейкинов.
Материалы и методы исследования. За период с 2006 по 2010 год в отделении сердечнососудистой хирургии НИИ КПССЗ СО РАМН 133 пациентам было выполнено бедренно-подколенное протезирование выше щели коленного сустава с использованием биопротезов «КемАнгиопротез». Для целей данной работы критерием исключения из исследования стало развитие раннего тромбоза протеза (n =12; 9 %) и структурная дегенерация протеза в виде аневризмы на всем протяжении (n = 10; 7,5 %). Остальных пациентов (n = 111) разделили на 2 группы: I группу (n = 52) составили пациенты с неблагоприятным исходом (рестеноз протеза, у 35-ти больных сопровождавшийся тромбозом); II группу (n = 59) — больные с функционирующими неизмененными протезами (табл. 1). Все пациенты проходили контрольное обследование 1 раз в 36 месяцев.
Таблица 1
Клиническая характеристика оперированных пациентов
Показатель I группа (n = 52) II группа (n = 59) р
Мужчины/женщины, n (%) 46/6 88,2/11,8 53/6 89,8/10,2 0,830 0,817
Возраст, лет 59 (42-78) ± 1,07 61 (48-81) ± 1,08 0,117
Причины облитераций артерий
Атеросклероз, n (%) 51 (98,1) 56 (94,9) 0,913
Облитерирующий тромбангиит, n (%) 1 (1,9) 1 (1,7) 0,962
Тромбированная аневризма, n (%) 0 2 (3,4) 0,962
Сопутствующие заболевания
ИБС, n (%) 38 (72,6) 43 (72,9) 0,810
ЦВБ, n (%) 26 (51) 31 (52,5) 0,303
Артериальная гипертония, n (%) 52 (100) 56 (95,2) 0,844
Сахарный диабет, n (%) 8 (15,4) 6 (10,2) 0,154
Ранее перенесенные операции на других бассейнах
АКШ, n (%) 19 (36,5) 17 (28,8) 0,112
ЧКВ, n (%) 8 (15,4) 6 (10,2) 0,176
КЭЭ, n (%) 8 (15,4) 10 (17) 0,147
Стентирование сонных артерий, n (%) 1 (1,9) 1 (1,69) 0,962
Протезирование БЦС, n (%) 1 (1,9) 0 0,570
Степень ишемии конечности
Хроническая II б ст., n (%) 30 (57,7) 38 (64,4) 0,157
Хроническая III ст., n (%) 14 (26,9) 15 (25,4) 0,193
Хроническая IV ст., n (%) 8 (15,4) 6 (10,2) 0,146
Состояние путей «оттока» на голени по Rutherford [8]
Хорошие, п (%) 25 (48,1) 29 (49,1) 0,274
Удовлетворительные, п (%) 24 (46,1) 26 (44,1) 0,189
Плохие, п (%) 3 (5,8) 4 (6,8) 0,181
Средний балл «путей оттока» 4,5 ± 1,3 4,3 ± 1,5 0,253
Через 6 месяцев после операции каждому пациенту в сыворотке крови определяли уровень иммуноглобулинов IgM, IgG и IgA, гомоцистеина (Hom), интерлейкинов IL-8, IL-6, IL-10, фактор некроза опухоли альфа (TNF-a), методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Количественную оценку исследуемых показателей выполняли на иммуноферментном планшетном ридере «Униплан» (ПИКОН, Россия).
Всем пациентам проводили генотипирование полиморфных вариантов генов TNF-a (G308A)/(rs1800629), IL-10 (A1082G)/(rs1800896), IL-6 (G1888T)/(rs1554606), IL-8 (А251Т) /(rs4073).
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. В случае распределения близкого к нормальному для проверки гипотезы о равенстве групповых средних использовали t-критерий Стьюдента. Для каждого анализируемого показателя вычисляли среднее (Х), ошибку среднего (m), среднеквадратичное отклонение (s) и критерий значимости Стьюдента (t). Статистически значимыми считались различия при р < 0,05. Результаты всех экспериментов приведены в виде Х ± m.
Результаты и обсуждение. У всех больных I группы наблюдали рестенозы зоны анастомозов, у 35-ти (67,3 %) пациентов осложнившиеся тромбозами. Большинство пациентов обеих групп имели мультифокальное поражение. Следует отметить, что группы достоверно не различались по наличию сопутствующих ИБС и ЦВБ, ранее перенесенным операциям и эндоваскулярным вмешательствам на других артериальных бассейнах. Исходно у пациентов I и II групп преобладала 2Б степень ишемии, а средний балл путей «оттока» составил у пациентов I группы 4,5 ± 1,3, II группы — 4,3 ± 1,5 (табл. 1).
Таким образом, группы сопоставимы между собой по клиническим характеристикам. Однако обращает на себя внимание различие их по ряду метаболических показателей.
Помимо этого, у пациентов I группы были зарегистрированы достоверно более высокие показатели маркера хронического системного воспаления — иммуноглобулина G — и провоспалительного интерлейкина 8. Концентрация IgG в I группе пациентов (22,43 ± 0,75 мг/мл) была на 27,1 % (р=0,01) выше по сравнению с показателями II группы (16,35 ± 0,84 мг/мл). Уровень ГЬ-8 (6,34 ± 1,00 пг/мл) у пациентов I группы также значительно (р = 0,01) превышал показатели II группы (3,96 ± 0,40 пг/мл). Следует отметить, однако, что другие маркеры воспаления — ГЬ-6, ^А, IgM и TNF-a — демонстрировали лишь небольшую недостоверную тенденцию к увеличению в Ьй группе по сравнению со П-й. В то же время, уровень противовоспалительного ГЬ-10 практически не различался у пациентов обеих групп.
Учитывая сложные молекулярно-клеточные взаимодействия представителей семейства интерлейкинов, большой интерес представляет изучение полиморфных вариантов генов, кодирующих данные биологически активные молекулы.
Известно, что ген Ш-10 представлен одной копией и локализован на хромосоме 1. В гене насчитывается 194 полиморфизма, но наиболее значимым является ГЬЮ^-1082G)/(rs1800896). Частота встречаемости аллеля G в европейской популяции достигает 30 % [8]. Вариант ШШ (-1082G) приводит к снижению синтеза цитокина, что ведет к снижению противовоспалительной активности.
Таблица 2
Частота выявления полиморфных вариантов генов интерлейкинов и влияние генотипов на уровни соответствующих цитокинов
Генотипы, п (%) Аллели,%
Ген И-10 (0-1082А) к 1800896 AA AG GG A G
I группа 23 (44,2%) 29 (55,8%) 0 (0%) 72,1% 27,9%
II группа 16 (27,2 %) 35 (60,1%) 8 (12,7%) 56,8% 43,2%
р 0,25 0,17
Уровень Ш-Ю, пг/мл 0,306 ± 0,10 0,302 ± 0,02 0,301 ± 0,07
р 0,285
Ген И-8 (А-251Т) ™ 4073 AA AT A T
I группа 9 (17,8%) 26 (50,3%) 17 (31,93%) 42,3% 57,7%
II группа 15 (25,8%) 31 (53%) 13 (21,2%) 51,7% 48,3%
р 0,24 0,21
Уровень Ш-8, пг/мл 3,73 ± 1,7 4,88 ± 2,5 5,66 ± 5,7
P 0,235
Ген И-6 (0-1888Т) к 1554606 GG GT G T
I группа 9 (16,4%) 17 (33,3%) 26 (50,3%) 33,6% 66,4%
II группа 21 (35,7%) 27 (45,6%) 11 (18,7%) 58,5% 41,5%
р 0,45 0,35
Уровень !Ь-6, пг/мл 2,54 ± 2,2 4,36 ± 2,6 4,40 ± 2,3
p 0,068
Ген TNF-a (G-308A) rs 1800629 GG GA AA G A
I группа 5 (10,7%) 44 (84,3%) 3 (5,0%) 51,9% 48,1%
II группа 5 (8,5%) 54 (91,5%) 0 (0%) 54,2% 45,8%
р 0,64 0,56
Уровень TNF-a, пг/мл 1,519 ± 0,3 2,594 ± 0,9 2,719 ± 1,06
Р 0,195
В настоящем исследовании частота аллеля G составила 27,9 % в I группе и 43,2 % — во II группе (табл. 2), что практически соответствует литературным данным, учитывая небольшие (с точки зрения генетических исследований) размеры выборок. Следует отметить, что среди пациентов II группы преобладали носители полиморфного варианта гена — в гетеро- или гомозиготном состоянии. Интересен, однако, тот факт, что в данной работе не удалось выявить влияния полиморфных вариантов гена на экспрессию интерлейкина-10: так, уровень данного цитокина у пациентов был практически идентичен при различных генотипах. Таким образом, можно предполагать следующее: либо более значимыми для изменения концентрации цитокина являются иные полиморфные варианты гена IL-10, либо угнетение его синтеза связано с конкурентными взаимодействиями других генов и кодируемых ими соединений.
В гене IL-8 известно 129 полиморфизмов, из которых наиболее изученным и значимым является IL8(A-251T)/(rs4073). Частота встречаемости аллеля Т достигает 49 %. Показано, что наличие аллеля Т связано с более высоким уровнем экспрессии IL-8, что, в свою очередь, приводит к большей выраженности воспалительных реакций в организме [9].
Действительно, в настоящей работе частота встречаемости аллеля Т во II группе составила 48,3 %, что согласуется с данными литературы, но в группе I данный показатель был выше — 57,70 % (р = 0,21) (табл. 2). Кроме того, была выявлена связь между генотипом и концентрацией IL-8 в плазме крови пациентов: у носителей «дикого» генотипа уровень цитокина составлял 3,73 ± 1,70 пг/мл, тогда как у гомозигот TT — 5,66 ± 5,70 пг/мл. Это дает основания предполагать участие IL-8 в развитии каскада молекулярных событий, реализующихся клинически рестенозом и тромбозом артериальных биопротезов.
Аналогичные закономерности были получены в отношении провоспалительного IL-6 и полиморфизма гена IL-6(G1888T)/(rs1554606). Наличие аллеля Т ассоциировано с повышением продукции IL-6: при «диком» генотипе концентрация цитокина составляла 2,54 ± 2,2 пг/мл, тогда как при гетеро- и гомозиготном вариантах была практически одинакова — 4,36-4,40 пг/мл. Известно, что частота встречаемости аллеля Т у европейцев составляет 27-59 %. Во II группе 44,5 % пациентов были носителями аллеля Т, тогда как в I группе таковых было 66,4 % (табл. 2).
Схожие результаты были получены при изучении TNF-a, являющегося ключевым медиатором воспаления. Известны 146 полиморфных вариантов гена TNF-a (микросателлиты, SNP-полиморфизмы), но только около половины из них влияют на экспрессию TNF-a in vitro [5]. Наиболее значимым для иммунного ответа против инфекции и опухолевого роста является полиморфизм TNF-a (G-308A)/(rs1800629). Хотя считается, что частота встречаемости аллеля А в европейской популяции составляет около 10 % [7], в исследуемых группах данный аллель встречался в 4 раза чаще. Было выявлено, что наличие аллеля А влечет за собой повышение уровня TNF-a.
Таким образом, очевидно, что полиморфизм генов провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-8, IL-6) является высокопродуцирующим, а полиморфизм гена противовоспалительного цитокина IL-10 — низкопродуцирующим. Кроме того, была отмечена явная тенденция к более частой встречаемости полиморфных аллелей генов провоспалительных цитокинов у пациентов I группы, превышающей значения, известные для европейской популяции. Возможно, однако, что эти результаты связаны с небольшим количеством наблюдений в сравнении с теми выборками, которыми обычно оперируют генетические исследования.
Тем не менее, полученные данные подтверждают перспективность дальнейшего поиска индивидуальных (в том числе, генетических) факторов риска развития атерогенных поражений сосудистого русла и связанных с ними тяжелых клинических проявлений. Дальнейший скрининг большего количества пациентов позволит вывить более достоверные ассоциативные связи между аллельными вариантами полиморфных участков ДНК и предрасположенностью к развитию сосудистых катастроф.
Заключение. Дальнейшие исследования, посвященные маркерам хронического воспаления, в частности, провоспалительным интерлейкинам, а также поиску генотипов, кодирующих повышение их уровня, являются перспективными и позволят в будущем сформировать диагностические критерии выделения группы риска среди пациентов, оперированных по поводу атеросклеротических окклюзий артерий нижних конечностей.
Список литературы
1. Современное состояние проблемы реокклюзии после реконструктивных вмешательств на артериях таза и нижних конечностей у больных облитерирующим атеросклерозом / М. Р. Кузнецов, К. В. Комов, С. А. Тепляков [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. — 2009. — Т. 15, № 4. — С. 145-151.
2. Морфологические изменения в артериальной стенке при рестенозе после реконструктивно-восстановительных и эндоваскулярных вмешательств / П. Г. Швальб, Р. Е. Калинин, Ю. И. Ухов [и др.] // Арх. патофизиологии. — 2008. — № 1.
— С. 42-44.
3. Nemby A. C. Molecular mechanisms in intimal hyperplasia / А. С. Nemby, А. В. Zaltsman // J Pathol. — 2000. — Vol. 190 (3). — Р. 300-309.
4. Osada M. T lymphocytes activation and restenosis after prrcutaneous transluminal coronary angioplasty / М. Osada, S. Takeda, R. Ogawa // J Interferon Cytokine Res. — 2001. — Vol. 21. — Р. 219-221.
5. Woods A. Genetics of inflammation and risk of coronary artery disease : the central role of interleukin-6 / А. Woods [et al.] // Eur. Heart J. — 2000. — Vol. 21. — Р. 1574-1583.
6. Hollegaard M. V. Cytokine gene polymorphism in human disease : on-line databases. Supplement 3 / М. V. Hollegaard, J. L. Bidwell // Genes Immun. — 2006. — Vol. 7 (4).
— Р.269-276.
7. Aggarwal B. Cytokines : from clone to clinic / В. Aggarwal, Е. Pocsik // Arch. Biochem. Biophys. — 1992. — Vol. 292. — Р. 335-345.
8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp
9. Serum levels of the anti-inflammatory cytokine interleukin-10 are decreased in patients with unstable angina / D. A. Smith, S. D. Irving, J. Sheldon [et al.] // Circulation. — 2001. — Vol. 104. — Р. 746-749.
MOLECULAR AND GENETIC CONTROL OF CHRONIC INFLAMMATORY PROCESSES AT PATIENTS AFTER FEMORAL AND POPLITEAL PROSTHETIC REPAIR BY BILOGICAL
PROSTHESIS «KEMANGIOPROSTHESES»
N. N. Burkov, I. Y. Zhuravleva
FSBE «Scientific Research Institute of Complex Problems of Cardiovascular Diseases»
SB RAMS (Kemerovo c.)
The objective of research was the analysis of role of some cytokines in restenosis and clottage development of biological prostheses «Kemangioprosthesis», and also the assessment of influence of polymorphic options of genes on expression of pro- and antiinflammatory interleukins. The I group (n = 52) was made by patients with failure (restenosis of prosthesis, at 35 patients accompanied by clottage); The II group (n = 59) — patients with functioning and not changed prostheses. Higher level of marker of chronic inflammation of IgG and IL-8 (p = 0,01) is authentically revealed at patients of the I group. The analysis of influence of polymorphic options of genes on expression of pro- and antiinflammatory interleukins showed that the polymorphism of genes of pro-inflammatory cytokines (TNF-a, IL-8, IL-6) is high-producing. The obvious tendency to more frequent occurrence of polymorphic alleles of genes of pro-inflammatory cytokines at patients with the complicated remote postoperative period is registered.
Keywords: restenosis of anastomoses zones, biological prostheses «Kemangioprosthesis», predictors, polymorphism of interleukins genes.
About authors:
Burkov Nikolay Nikolaevich — research associate of laboratory of cardiovascular bioprosthetic repair at FSBE «Scientific Research Institute of Complex Problems of Cardiovascular Diseases» SB RAMS, office phone: 8 (384-2) 64-05-69, e-mail: burkovn79@mail.ru
Zhuravleva Irina Yurevna — doctor of medical sciences, professor, chief researcher of laboratory of cardiovascular bioprosthetic repair of experimental and clinical cardiology department at FSBE «Scientific Research Institute of Complex Problems of Cardiovascular Diseases» SB RAMS, office phone/fax: 8 (384-2) 64-16-53, e-mail: bio@cardio.kem.ru
List of the Literature:
1. Current state of problem of reocclusion after reconstructive interventions on arteries of basin and bottom extremities at patients with obliterating atherosclerosis / M. P. Kuznetsov, K. V. Komov, S. A.Teplyakov [etc.] // Angiology and vascular surgery. — 2009. — V. 15, № 4. — P. 145-151.
2. Morphological changes in arterial wall at restenosis after reconstructive recovery and endovascular interventions / P. G. Shvalb, R. E. Kalinin, Y. I. Ukhov [etc.] / /Arch. pathophysiology. — 2008. — № 1. — P. 42-44.
3. Nemby A. C. Molecular mechanisms in intimal hyperplasia / A. C. Nemby, A. B. Zaltsman // J Pathol. — 2000. — Vol. 190 (3). — P. 300-309.
4. Osada M. T lymphocytes activation and restenosis after prrcutaneous transluminal coronary angioplasty / M. Osada, S. Takeda, R. Ogawa // J Interferon Cytokine Res. — 2001. — Vol. 21. — P. 219-221.
5. Woods A. Genetics of inflammation and risk of coronary artery disease : the central role of interleukin-6 / A. Woods [et al.] // Eur. Heart J. — 2000. — Vol. 21. — P. 1574-1583.
6. Hollegaard M. V. Cytokine gene polymorphism in human disease : on-line databases. Supplement 3 / M. V. Hollegaard, J. L. Bidwell // Genes Immun. — 2006. — Vol. 7 (4). — P.269-276.
7. Aggarwal B. Cytokines : from clone to clinic / B. Aggarwal, E. Pocsik // Arch. Biochem. Biophys. — 1992. — Vol. 292. — P. 335-345.
8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp
9. Serum levels of the anti-inflammatory cytokine interleukin-10 are decreased in patients with unstable angina / D. A. Smith, S. D. Irving, J. Sheldon [et al.] // Circulation. — 2001. — Vol. 104. — P. 746-749.
