CC BY
104
УДК 617.7-006.81-08
В.А. яРОВАя1, A.A. яРОВОЙ1, А.Р. ЗАРЕЦКиЙ23, л.В. ДЕмиДОВ4, В.В. НАЗАРОВА4, С.С. КлЕяНКиНА1,
а.и. сендерович4
1МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова МЗ РФ, 127486, г. Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59а
2ООО «Евроген», 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10
Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова,
117513, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1
4Росийский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, 115230, г. Москва, Каширское шоссе, д. 23
Молекулярно-генетический анализ увеальной меланомы при органосохраняющем лечении
Контактная информация:
яровая Вера Андреевна — врач-офтальмолог, аспирант отдела офтальмоонкологии и радиологии, тел. +7-916-234-45-52, e-mail: verandreevna@gmail.com
яровой Андрей Александрович — доктор медицинских наук, заведующий отделом офтальмоонкологии и радиологии, тел. (499) 488-89-43, e-mail: yarovoyaa@yandex.ru
Зарецкий Андрей Ростиславович — руководитель отдела молекулярной онкологии компании «Евроген», сотрудник НИИ трансляционной медицины, тел. +7-916-815-95-56, e-mail: zaretsky@evrogen.ru
Демидов лев Вадимович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий хирургическим отделением №10 (отделением биотерапии опухолей) НИИ Клинической онкологии, e-mail: demidov.lev@gmail.com
Назарова Валерия Витальевна — кандидат медицинских наук, специалист-онколог, научный сотрудник хирургического отделения №10 (отделения биотерапии опухолей) НИИ Клинической онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» МЗ РФ, тел. +7-903-666-91-23, e-mail: jezerovel@gmail.com
Клеянкина Светлана Сергеевна — кандидат медицинских наук, врач-онколог отделения офтальмоонкологии и радиологии, тел. +7-926-846-38-20, e-mail: k.sveta.z@mail.ru
Сендерович Анастасия ильинична — кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной патологии отдел патологической анатомии опухолей человека НИИ Клинической онкологии, тел. +7-926-608-30-31, e-mail: a.senderovich@mail.ru
Цель работы — представить первый отечественный опыт проведения биопсии увеальной меланомы (УМ) с прогностической целью («прогностической» биопсии) при органосохраняющем лечении.
Материал и методы. Проведено 60 «прогностических» биопсий УМ при проведении органосохраняющего лечения: брахитерапии и стереотаксического облучения на установке «Гамма-нож» (методом получения опухолевой ткани была тонкоигольная аспирационная биопсия (n=49)), эндорезекции опухоли (n=9) и транссклерального удаления опухоли (n=2).
После проведения цитологического исследования выполняли анализ моносомии 3 хромосомы, уровень экспрессии белка BAP1, а также исследовали мутации в генах GNAQ, GNA11, EIF1AX, SF3B1 и TERT в ДНК. Кроме того, методом FISH определяли амплификацию гена MYC и делецию гена PPARG.
Результаты и обсуждение. Во всех случаях полученного материала было достаточно для проведения тестирования. Единственным осложнением при проведении ТИАБ было витреальное кровоизлияние, занимающее оптическую ось, у 1 пациента.
Заключение. Биопсия УМ при проведении органосохраняющего лечения позволяет получить информативный материал опухоли для последующего цитологического и развернутого молекулярно-генетического анализа с прогностической целью.
Ключевые слова: увеальная меланома, молекулярно-генетическое тестирование, цитогенетическое тестирование.
V.A. YAROVAYA1, A.A. YAROVOY1, A.R. ZARETSKY23, L.V. DEMIDOV4, V.V. NAZAROVA4, S.S. KLEYANKINA1, A.V. SENDEROVICH4
1S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, 59a Beskudnikovsky Blvd., Moscow, Russian Federation, 127486
2Evrogen Laboratory LLC, 16/10 Miklukho-Maklaya Str., Moscow, Russian Federation, 117997
3Pirogov Russian National Research Medical University, 1 Ostrovityanov Str., Moscow, Russian Federation,
117513
4N.N. Blokhin National Medical Oncology Center, 23 Kashirskoye shosse, Moscow, Russian Federation, 115230
Molecular genetic testing of uveal melanoma in eye saving treatment
Contact information:
Yarovaya V.A. — ophthalmologist, postgraduate student of the Department of Ocular Oncology and Radiology, tel. +7-916-234-45-52, e-mail: verandreevna@gmail.com
Yarovoy AA — D. Med. Sc., Head of the Department of Ocular Oncology and Radiology, tel. (499) 488-89-43, e-mail: yarovoyaa@yandex.ru Zaretsky A.R. — Head of the Department of Molecular Oncology, researcher of Scientific-research Institute for Translational Medicine, tel. +7-916-815-95-56, e-mail: zaretsky@evrogen.ru
Demidov L.V. — D. Med. Sc., Professor, Head of the 10th Surgical Department (tumor biotherapy), e-mail: demidov.lev@gmail.com Nazarova V.V. — Cand. Med. Sc., oncologist of the 10th Surgical Department (tumor biotherapy), tel. +7-903-666-91-23, e-mail: jezerovel@gmail.com
Kleyankina S.S. — Cand. Med. Sc., oncologist of the Department of Ocular Oncology and Radiology, tel. +7-926-846-38-20, e-mail: k.sveta.z@mail.ru
Senderovich A.I. — Cand. Med. Sc., Reseacher of the Molecular Pathology Laboratory, Department of Pathology Anatomy of tumors in humans, tel. +7-926-608-30-31, e-mail: a.senderovich@mail.ru
Objective — to evaluate the clinical and laboratory results of the first Russian prognostic biopsy of uveal melanoma (UM) in eye-saving treatment (EST).
Material and methods. EST was performed in 60 patients aged from 10 to 84 years (mean — 52 years) with UM and included Ru-106 brachytherapy (47), gamma-knife radiosurgery (2), transscleral resection (2) and endoresection (9). After cytological research analysis of chromosome 3 was performed. Molecular testing was done in 45 cases and included detection of activating GNAQ and GNA11 hotspot mutations, EIF1AX and SF3B1 genes mutations in exons 1, 2, 6 and exons 14, 15 respectively, gene MYC and PPARG mutations and BAP1 inactivation.
Results and discussion. In all cases the obtained material was sufficient for the research. The only complication of FNAB was vitreous hemorrhage obscuring macula in one patient.
Conclusion. Our modified FNAB technique provided excellent tissue samples of UM for prognostic purposes suitable for all kinds of laboratory testing including cytology, cytogenetic, molecular analysis with wide spectrum of genetic features. Key words: uveal melanoma, molecular genetic testing, cytogenetic testing.
Введение
Увеальная меланома (УМ) — меланоцитарная внутриглазная опухоль, у 50% пациентов дающая отдаленные метастазы в течение 10 лет независимо от выбранного метода лечения [1]. Риск развития метастазов при УМ индивидуален и зависит от ряда факторов, таких как: локализация опухоли, размеры очага, наличие экстрабульбарного распространения [2], а также морфологические признаки — клеточный тип и степень дифференцировки [1]. В последнее десятилетие особое значение придается молекулярно-генетическому анализу УМ, проведение которого основано на исследовании как хромосомных аномалий,так и мутации в генах [3].
Диагностика молекулярно-генетических изменений и оценка их корреляции с вероятностью развития метастазов при УМ успешно проводится на
энуклеированных глазах [4-6]. В настоящее время лечение УМ, в том числе и больших размеров [7], имеет органосохраняющую направленность. Проведение молекулярно-генетических тестов с прогностической целью требует получения материала опухоли в достаточном количестве, что является определенной проблемой при сохранении глаза с УМ. Получение ткани опухоли возможно при хирургическом удалении УМ, а также, в основном, методом тонкоигольной аспирационной биопсии (ТИАБ) с последующей лучевой терапией [8]. В последние годы ТИАБ УМ используется в ряде клиник, приводятся доказательства безопасности и информативности ТИАБ [9, 10]. Сведений о проведении молекулярно-генетических исследований УМ при органосохраняющем лечении в отечественной практике нет.
Цель — представить первый отечественный опыт проведения молекулярно-генетических исследований УМ при органосохраняющем лечении.
Материал и методы
«Прогностическая» биопсия УМ была проведена у 60 пациента: у 47 выполнялась ТИАБ перед бра-хитерапией (БТ), у 2 — перед стереотаксическим облучением на установке «Гамма-нож», у 9 материал получали при эдорезекции (ЭР) опухоли, у 2
— при транссклеральном удалении опухоли.
Средний возраст пациентов при проведении органосохраняющего лечения составил 52 года (от 10 до 84 лет). При этом мужчин было 25 (41%), женщин — 35 (59%). Высота опухоли варьировалась от 2,6 до 10,3 мм (средняя — 6,7 мм), протяженность составила 12,5 мм (от 7,6 до 18 мм). Трансвитре-альную биопсию через parsplana с использованием длинных игл 25G (n=23) и 27G (n=21) проводили при опухолях, имеющих постэкваториальную локализацию (n=44). При преэкваториальном расположении опухолей (n=5) выполняли забор опухолевой ткани транссклерально с использованием короткой иглы 30G. Техника выполнения ТИАБ различными доступами была описана нами ранее [8].
При ЭрУм материал удаленной опухоли забирался и обрабатывался отдельно по описанной нами ранее технике [11]. Опухоли, удаленные транссклераль-но, проходили гистологическую обработку.
Забранный материал помещали в специализированный консервант для его сохранения и транспортировки в лабораторию.
После проведения цитологического исследования проводили FISH-реакцию на мазке отпечатке для определения моносомии 3 хромосомы. Использовали флуоресцентную пробу Uro Vysion Bladder Cancer Kit (Abbot Molecular, USA). Оценку результатов проводили на флуоресцентном микроскопе Axioscop2 Plus. Кроме того, методом FISH определяли амплификацию региона 8q24.21 (MYC) и де-лецию региона 3p25.2 (PPARG).
Поиск мутаций в генах GNAQ (экзон 5), GNA11 (экзон 5), EIF1AX (экзоны 1, 2 и 6), SF3B1 (экзоны 14 и 15) и TERT (промоторная область) в ДНК, выделенной из цитологического или гистологического материала, проводили методом ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР. Кроме того, уровень экспрессии белка BAP1 оценивали иммуноци-тохимическим или иммуногистохимическим методом с использованием моноклонального антитела C-4 (Santa Cruz Biotechnology, США).
Результат и обсуждение
При проведении ТИаБ во всех случаях объем материала был достаточен для выполнения цитологического анализа как при пункции опухоли иглами размером как 25G, так и иглами меньшего диаметра
— 27G и 30G.
После забора материала УМ 60 пациентам было проведено как цитологическое, так и молекулярно-генетическое исследование. Еще в 9 случаях было выполнено лишь цитологическое исследование, т.к. на начальном этапе отработки технология сохранения материала условия его хранения были нарушены, и был получен поврежденный материал УМ, что не позволило выполнить молекулярно-ге-нетический анализ.
У 15 пациентов на основании цитологического материала методом FISH определяли потерю одной копии 3 хромосомы, что является неблагопри-
ятным прогностическим признаком [12]. У 3 пациентов (20%) обнаружили клетки УМ с нормальным набором хромосом. Моносомия 3 хромосомы была представлена у 7 пациентов (47%). Кроме того, у 5 (33%) пациентов при проведении флуоресцентной гибридизации было выявлено увеличении 3 хромосомы до 3-4 копий на ядро, что требует дальнейшего анализа.
Мутации генов, которые, по данным литературы, имеют особое значение в развитии и поведении Ум, определяли у 45 пациентов. Мутация белка G генов GNAQ и GNA11 является триггерным для развития УМ в 85%, но не влияет на риск диссеминации опухоли [13]. Мутация гена GNAQ была выявлена у 20 (44%) человек (в том числе «экзотические» мутации — у 2 человек), а GNA11 — у 15 (33%). Мутация гена EIF1AX, наличие которой резко снижает риск развития метастатического процесса [13], имела место у 9 (20%) пациентов. Мутация гена SF3B1, выявленная в 10 (22%) случаях, может свидетельствовать о способности УМ метаста-зировать в печень и легкие в равных соотношениях в сроки свыше 10 лет [13]. Отсутствие экспрессии белка ВАР1 было обнаружено у 5 (11%) пациентов. Инактивация белка BAP1 говорит о высоком риске раннего развития метастатического процесса [13]. Ни в одном случае не была отмечена мутация гена TERT. Таким образом, показана пригодность материала ТИАБ для метода FISH, ПЦР-анализа и для иммуноцитохимического исследования.
Robertson [14] было предложено разделение УМ на 4 прогностических класса с учетом результатов молекулярно-генетического тестирования: хороший, средний, плохой и очень плохой. 1 класс («хороший» прогноз), при котором риск возникновения метастазов крайне низок, предполагает наличие в опухоли мутации гена EIF1AX при условии отсутствия моносомии 3 хромосомы, инактивации белка ВАР1, амплификации 8q и мутации SF3B1. 2 класс («средний» прогноз), при котором метаста-зирования УМ следует ожидать в 30%, имеет место при наличии амплификация 8q и/или мутации SF3B1 и при отсутствии моносомии 3 и инактивации BAP1. Опухоли 3 класса («плохой» прогноз) должны иметь моносомию 3 и/или инактивацию белка BAP1, при этом увеличения количества копий длинного плеча 8 хромосомы и мутации гена SF3B1 быть не должно. 3 класс характеризует УМ как опухоль, способную к метастазированию в 80%. «Очень плохой» прогноз (4 класс) устанавливается при выявлении моносомии 3 и/или инактивации белка BAP1, а так же при увеличении количества копий длинного плеча 8 хромосомы и/или мутации гена SF3B1. На основании полученных нами результатов моле-кулярно-генетического тестирования планируется их оценка и соотнесение с предложенной классификацией.
С учетом результатов молекулярно-генетическо-го тестирования проводится уточнение имеющейся схемы наблюдения [15] и разработка дифференцированных подходов к ведению пациентов с УМ после проведенного лечения.
Среди осложнений при выполнении ТИАБ нами было отмечено занимающее оптическую ось витре-альное кровоизлияние (n = 1,2%), которое потребовало выполнения витрэктомии для улучшения зрительных функций пациента. По предварительным наблюдениям, вероятность возникновения кровоизлияния увеличивается при опухолях большего размера. Shields C.L. [10] отмечают наличие гемор-
рагий в 46% случаев, что, однако, включает все виды кровоизлияний при проведении ТИАБ, в том числе и транзиторные. Претуморальные витреаль-ные кровоизлияния, самостоятельно рассасывающиеся в течение 14 дней, были расценены нами как «ожидаемые» последствия ТИАБ и не были включены в группу осложнений. Описанные рядом авторов более редкие осложнения ТИАБ, такие как отслойка сетчатки, эндофтальмит, диссеминация опухоли в стекловидное тело и прогрессия опухоли [16] нами отмечены не были.
Mashayekhi [17] был описан случай распространения опухоли по каналу ТИАБ спустя 18 месяцев после проведения манипуляции, что в свою очередь, составило 0,2% от общего числа выполненных биопсий. Нами видимых признаков имплантации опухоли в склеральный канал и/или признаков экстрабульбарного роста отмечено не было, однако стоит учитывать малые сроки наблюдения пациентов (от 3 до 19 мес.).
Выводы
1. Впервые в отечественной практике выполнены молекулярно-генетические исследования опухоли на материале биопсии УМ при проведении органо-сохраняющего лечения.
2. Доказана пригодность материала, полученного при проведении ТИАБ УМ, для метода FISH, ПЦР-анализа и для иммуноцитохимического исследования
3. Выполнен весь спектр генов, имеющих прогностическое значение, мутации в которых наиболее полно отвечают современному уровню изучения УМ.
4. Требуется дальнейший как ретроспективный, так и проспективный анализ корреляции мутаций в генах с вероятностью развития метастатического процесса у пациентов с Ум.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kaliki S., Shields C.L., Shields J.A. Uveal melanoma: Estimating prognosis // Indian J. Ophthalmol. — 2015. — 63. — P. 93-102.
2. Onken M.D., Worley L.A., Char D.H., et al. Ocular Oncology Group Report No. 1: Prospective Validation of a Multi-Gene Prognostic Assay in Uveal Melanoma // Ophthalmology. — 2012. — 119. — P. 1596-1603.
3. Onken M.D., Worley L.A., Char D.H., et al. Ocular Oncology Group Report No. 1: Prospective Validation of a Multi-Gene Prognostic Assay in Uveal Melanoma // Ophthalmology. — 2012. — 119. — P. 1596-1603.
4. Саакян С.В., Цыганков А.Ю., Амиряг А.Г., и др. Выживаемость при увеальной меланоме: роль молекулярно-генетических факторов // Вестник офтальмологии. — 2016. — 132. — С. 3-9.
5. Horsthemke B., Prescher G., Bornfeld N., Becher R. Loss of chromosome 3 alleles and multiplication of chromosome 8 alleles in uveal melanoma // Genes Chromosomes Cancer. — 1992. — 4. — P. 217-221.
6. Horsthemke B., Prescher G., Bornfeld N., Becher R. Loss of chromosome 3 alleles and multiplication of chromosome 8 alleles in uveal melanoma // Genes Chromosomes Cancer. — 1992. — 4. — P. 217-221.
7. Яровой А.А., Магарамов Д.А.. Меланома хориоидеи стадии Т2 высотой более 6,0 мм: органосохраняющее с использованием брахитерапии и транспупиллярной термотерапии или энуклеация? Анализ выживаемости // Вестник офтальмологии. — 2011. — 127. — С. 43-5.
8. Яровая В.А., Клеянкина С.С., Яровой А.А., и соавт. «Прогностическая» биопсия меланомы хориоидеи: техника, морфологическая и молекулярно-генетическая диагностика // Современные технологии в офтальмологии. — 2017. — 1. — C. 375-377.
9. Sellam A., Desjardins L., Barnhill R., et al. Fine Needle Aspiration Biopsy in Uveal Melanoma: Technique, Complications, and Outcomes // Am. J. Ophthalmol. — 2016. — 162. — P. 28-34.
10. Shields C.L., Ganguly A., Materin M.A., et al. Chromosome 3 Analysis of Uveal Melanoma Using Fine-Needle Aspiration Biopsy at the Time of Plaque Radiotherapy in 140 Consecutive Cases // Trans. Am. Ophthalmol. Soc. — 2007. — 105. — С. 43-53.
11. Яровой А.А., Горшков И.М., Голубева О.В. Эндовитреальное удаление увеальной меланомы: пятилетний опыт. Эффективная фармакотерапия // Онкология, гематология и радиология. Спецвыпуск «Меланома». — 2016. — 39. — С. 64-68.
12. Shields C.L., Say E.AT., Hasanreisoglu M., et al. Personalized Prognosis of Uveal Melanoma Based on Cytogenetic Profile in 1059 Patients over an 8-Year Period: The 2017 Harry S. Gradle Lecture // Ophthalmology. — 2017. — 124. — P. 1523-1531.
13. Amaro A., Gangemi R., Piaggio F., et al. The biology of uveal melanoma // Cancer Metastasis Rev. —2017. — 36 (1). — P. 109-140.
14. Robertson A.G., Shih J., Yau C. et al. Integrative Analysis Identifies Four Molecular and Clinical Subsets in Uveal Melanoma // Cancer Cell. — 2017 Aug 14. — 32. — P. 204-220.
15. Увеальная меланома: локальная форма. Клинические рекомендации. — 2017.
16. Singha A.D., Biscotti C.V. Fine needle aspiration biopsy of ophthalmic tumors // Saudi J. Ophthalmol. — 2012. — 26. — P. 117-123.
17. Mashayekhi A., Lim R.P., Shields C.L., Eagle R.C. Jr, Shields J.A. Extraocular Extension of Ciliochoroidal Melanoma After Transscleral Fine-Needle Aspiration Biopsy // Retin Cases Brief Rep. — 2016. — 10. — P. 289-92.
