CC BY
3МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СОРТОВ ЗЕМЛЯНИКИ САДОВОЙ ПО ГЕНАМ АРОМАТА ПЛОДОВ FAOMT
И FAFAD1
Учреждение образования
«Белорусская государственная орденов Октябрьской Революции и Трудового Красного Знамени
сельскохозяйственная академия»
Республика Беларусь, 213410, г. Горки, ул. Мичурина, 5 e-mail: ekaterinakulik113@gmail.com
Представлены результаты молекулярно-генетического анализа 154 сортов земляники садовой различного происхождения по генам, контролирующим аромат плодов. Генетический анализ проводился по двум генам аромата: FaOMT, который контролирует содержание мезифурана и локализован в дистальном районе длинного плеча хромосомы VII-F.1, и FaFADl, который отвечает за синтез у-декалактона и локализован в дистальном районе длинного плеча хромосомы III2 генома F. х ananassa Duch. Маркер FaOMT-SI/NO позволяет различать активные и неактивные аллельные формы гена FaOMT на основании их размера при амплификации, 248 и 217 п. н. соответственно. Маркер FaFAD1 идентифицирует фрагмент размером 500 п. н., но он не позволяет различать доминантные гомозиготные и гетерозиготные линии. Активная аллельная форма гена FaOMT была идентифицирована у 90,9% из 154 проанализированных сортов земляники, в то время как неактивная аллельная форма гена была обнаружена у 28% образцов. Ген FaFADl был идентифицирован у 29,2% генотипов. Также были выделены сорта земляники садовой, совмещающие функциональный аллель гена FaFADl с гомозиготным состоянием активной аллельной формы гена FaOMT и сорта, характеризующиеся сочетанием функционального аллеля гена FaFADl с гетерозиготным состоянием аллельной формы гена FaOMT. В результате проведенных исследований были выделены наиболее перспективные для селекции на аромат плодов генотипы, сочетающие в своем геноме оба гена аромата (FaOMT+ и FaFADl): Alba, Antea, Brilla, Dahli, Destiny, Flair, Hademar, Honey, Hansalola, Joly, Korona, Limalexia, Olympia, Osiris, Pircinque, Salsa, Sapore, Sonata, Теа, Vicoda, Vima Tarda, Барокко, Классика, Торпеда.
Ключевые слова: аромат плодов, земляника садовая, сорта, мезифуран, у-декалактон, молекулярно-генетический анализ.
Введение
Земляника садовая является представителем семейства розоцветных, рода Fragaria. Она является самой высокоурожайной культурой среди ягодных с мировым объемом производства более девяти миллионов тонн в год [1]. Ее популярность обусловлена скороспелостью, десертным вкусом, неповторимым ароматом и богатым биохимическим составом плодов [2].
Аромат плодов относится к потребительскому признаку сортов земляники и является одним из самых сложных ароматических комплексов среди ягодных культур, который включает более 350 летучих соединений, в том числе сложные эфиры, фураноны, терпены, альдегиды, кетоны, серосодержащие соедине-
ния, спирты и др. [3]. К числу ключевых компонентов ароматического комплекса плодов земляники относятся мезифуран, имеющий фруктовый, карамельный аромат, и у-декалак-тон с персикоподобным, фруктовым, сладким ароматом, который представляет интерес для промышленности в качестве ароматизатора. Синтез мезифурана в плодах земляники контролируется геном FaOMT, у-декалактона — геном FaFADl [4].
В связи с тем, что аромат плодов является потребительским признаком и играет немаловажное значение в реализации продукции, изучение ароматического комплекса является актуальной задачей для селекции. Селекция земляники с использованием генетического
анализа позволяет ускорить отбор сложных признаков, таких как аромат, и с высокой надежностью определить присутствие в геноме необходимых генов и идентифицировать перспективные формы [5].
Цель настоящего исследования — проведение молекулярно-генетического анализа образцов рода Fragaria по генам аромата плодов FaOMT и FaFADl для выявления генотипов, перспективных для селекции на качество ягод.
Материалы и методы
Молекулярно-генетический анализ проводили в научно-исследовательской генетической лаборатории УО БГСХА.
Объектами исследования являлись 154 образца земляники садовой из коллекции кафедры плодоовощеводства УО БГСХА, из
которых шесть сортов отечественной селекции (Барокко, 7.19-17/2 (Готика), Красный берег, Тарро, Татиус, Полли).
Экстракцию ДНК проводили из молодых листьев земляники с помощью набора для выделения ДНК K0512 Thermo Fisher Scientific, согласно протоколу производителя.
Для оценки аллельного состояния гена FaOMT использовали маркер FaOMT-SI/NO, гена FaFADl — маркер FaFADl [4].
Использованные для анализа праймеры были синтезированы ОДО «Праймтех» (Беларусь) (табл. 1).
Реакционная смесь для ПЦР объемом 20 мкл содержала: 1,5 мкл ДНК с концентрацией 20 нг/мкл; 0,2 мМ dNTPs; 0,25 мкМ каждого праймера; 0,2 U Tag-полимеразы и 1 мМ Tag-буфера (+(NH4)2SO4, KCl + MgCl2).
Характеристика использованных в работе праймеров
Таблица 1
Маркер Нуклеотидная последовательность праймеров Размер амликонов, п. н.
FaOMT-SI/NO F 5'CGATCATTTCGAAAAGGACTA3' R 5'AAGCAGGGTTAGTTGTGGAGA3' 217, 248
FaFAD1 F 5'CGGGATTAATGGTTTTGTTGTTGACCGACC3' R 5'GTAGAAGAGAGAGACCAAGACGAG3' 500
Амплификацию проводили в термоциклере C1000 производства фирмы Touch по следующим программам:
маркер FaOMT: денатурация: 94 °С — 2 мин, 10 циклов: 94 °С — 30 сек, 59,5 °С — 45 сек, 72 °С — 1 мин; 25 циклов: 94 °С — 30 сек, 55 °С — 45 сек, 72 °С — 1 мин; финальная элонгация: 72 °С — 5 мин;
маркер FaFAD1: денатурация: 94 °С — 4 мин, 25 циклов: 94 °С — 30 сек, 56 °С — 45 сек, 72 °С — 1 мин; финальная элонгация: 72 °С — 9,5 мин. Разделение ампликонов осуществляли методом электрофореза в 2%-ом агарозном геле. Для определения длины ам-плифицированных фрагментов использовали ДНК маркер молекулярного веса, M100bp (Праймтех).
Результаты и обсуждение
Содержание мезифурана в плодах земляни-
ки контролируется геном FaOMT, локализованным в дистальном районе длинного плеча хромосомы VII-F.1. Маркер FaOMT-SI/NO позволяет различать активные и неактивные аллельные формы гена FaOMT на основании размера их амплификации, 248 и 217 п. н. соответственно. По данным зарубежных исследований различие между функциональными и нефункциональными аллельными формами гена объясняется рядом однонуклеотидных инсерций/делеций общим размером 30 п. н. в промоторной области гена. Праймер FaOMT-SI/NO фланкирует район, содержащий указанные инсерции/делеции, позволяя идентифицировать активную аллельную форму размером 248 п. н. и неактивную аллельную форму размером 217 п. н. гена FaOMT [3, 4, 6].
По результатам наших исследований из 154 проанализированных сортов функциональную (активную) аллельную форму гена FaOMT
(FaOMT+) идентифицировали у 90,9% генотипов: Brilla, Fernando, Monterey, Olympia, Барокко, Витязь, Красный берег, Купчиха, Полли, Соловушка, Царица, Юния Смайдс и др. Нефункциональную (неактивную) аллельную форму (FaOMT-) выявили у 28% образцов: Braiton, Chandler, Eva, Evita, Garigoutte «Neuve», Gemil, Веснянка, Купчиха, Найдена добрая, Тарро и др.
При гетерозиготном сочетании аллелей гена FaOMT на электрофореграмме присутствуют оба целевых продукта. При наличии фрагмента 248 п. н. ампликон размером 217 п. н. может слабо визуализироваться, что может быть связано с недостаточным его синтезом. Сочетанием активной и неактивной аллельных форм гена
(гетерозигодный генотип FaOMT+FaOMT-) характеризуются 18,9% сортов, включенных в анализ: Aura, Christine, Premy, Rubis des Jardins, Sandra, Roksana, Дивная, Кокинская ранняя, Славутич, Сударушка и др.
Гомозиготное состояние активной аллельной формы гена (генотип FaOMT+FaOMT+) выявлено у 72% образцов: Allegro, Asia, Vivara, Candiss, Marmolada, Malling Allure, Charlotte, Mariguette, Готика, Кокинская заря, Татиус, Троицкая и др., гомозиготное состояние неактивной аллельной формы гена (генотип FaOMT-FaOMT-) — у 9,1%: Aprica, Clery, Emi, Жемчужница, Лакомка, Найдена добрая и др. (пример идентификации фрагментов приведен на рисунке 1).
Рис. 1. Электрофоретический профиль маркеров FaOMT-SI/NO (a) 1 — Monterey; 2 — Marmolada; 3 — Malwina; 4 - Витязь; 5 — Полли; 6 — Дивная; 7 — Chandler; 8 — Vima Rina; 9 — Царица; 10 — Viktoriana; 11 — Vima Tarda; 12 — Спасская; 13 — Слоненок; 14 — Торпеда; 15 — Росинка; 16 — Laura; М — маркер молекулярного веса; и FaFAD1 (b) генотипов земляники: 1 — Monterey; 2 — Marmolada; 3 — Malwina; 4 — Барокко; 5 — Витязь; 6 — Полли; 7 — Дивная; 8 — Vima Rina; 9 — Царица; 10 — Viktoriana; 11 — Vima Tarda; 12 — Спасская; 13 — Садовый рубин; 14 — Слоненок; 15 — Торпеда; 16 — Росинка; М — маркер молекулярного веса
Содержание у-декалактона в плодах земляники контролируется геном FaFADl, локализованным в дистальном районе длинного плеча хромосомы III2 генома F. х ananassa Duch [3]. Маркер FaFAD1 является доминантным и идентифицирует фрагмент размером 500 п. н., что свидетельствует о наличии гена FaFADl, но не позволяет различать доминантные гомозиготные и гетерозиготные линии. У генотипов с отсутствием гена, кодирующего
у-декалактон, данный фрагмент не амплифи-цируется [6, 7, 8].
С помощью анализа была обнаружена основная вариация присутствия-отсутствия FaFADl среди 154 продуцентов и непродуцентов у-декалактона в сортах земляники. В результате ген FaFADl идентифицирован у 29,2% генотипов: Alba, Elly, Flair, Hademar, Sapore, Gemil, Osiris, Sonata, Vima Tarda, Барокко, Классика и др. По данным зарубежных
исследований подтверждена корреляция между наличием аллеля FaFADl и синтезом у-де-калактона в плодах земляники. Присутствие ампликона размером 500 п. н. было обнаружено исключительно в генотипах, у которых высокий уровень содержания у-декалактона [8].
Наиболее перспективными для селекции по признаку «аромат плодов» формами являются генотипы, совмещающие в геноме несколько генов аромата. Исходя из результатов молекулярно-генетического анализа, в анализируемой коллекции 154 генотипов земляники сочетание активной аллельной формы гена FaOMT и функционального аллеля гена FaFADl выявлено у 21,4% (табл. 2).
Следует отметить сорта земляники садовой, совмещающие функциональный аллель гена
FaFADl с гомозиготным состоянием активной аллельной формы гена FaOMT — Alba, Antea, Brilla, Dahli, Destiny, Flair, Hademar, Honey, Hansalola, Korona, Limalexia, Olympia и др., а также сорта, характеризующиеся сочетанием функционального аллеля гена FaFADl с гетерозиготным состоянием гена FaOMT — Elsanta, Eva, Geneva, Renaissance, Rubis des Jardins, Scala, Купчиха, Садовый рубин.
Исследования по изучению генов аромата земляники проводились в Англии, Испании и США. Там были созданы праймеры для идентификации генов FaOMT и FaFADl [4, 6, 8]. В последние годы похожая научная работа проводилась в Федеральном научном центре им. И. В. Мичурина на 43 разных сортах и дикорастущих видах земляники, по
Таблица 2
Аллельный состав генов FaOMT и FaFADl в исследуемых сортах земляники садовой
Генотип Количество, % Сорта
FaOMT+/+ FaFAD1 + 21,4 Alba, Antea, Brilla, Flavia, Flair, Hademar, Hansalola, Holiday, Honey, Elly, Dahli, Destiny, Joly, Korona, Limalexia, Olympia, Onda, Onega, Osiris, Pegasus, Pircinque, Salsa, Sapore, Sonata, Tecla, Теа, Vicoda, Rima Tarda, Verona, Барокко, Вега, Классика, Торпеда
FaOMT+/-FaFAD1 + 5,2 Elsanta, Eva, Geneva, Renaissance, Rubis des Jardins, Scala, Купчиха, Садовый рубин
FaOMT-/-FaFAD1 + 2,6 Gemil, Gigantella Maxim, Веснянка, Тарро
FaOMT+/+ FaFADl- 50,6 Allegro, Anabelle, Anais, Argentera, Asia, Bianca fregola, Candiss, Carmen, Charlotte, Cory, Crapo 10, Cambridge, Elianny, Fenella, Fernando, Flaminia, Florida Beauty, Fronteras, Fragolaurea, Hiku, Kent, Lia Sugar, Lord, Lycia, Magnus, Malling Allure, Malling Centenary, Malwina, Marmolada, Monterey, Murano, Naiad, Nandi, Pink Flamingos, Polka, Princess Diana, Queen Elizabeth 2, Quicky, San Andreas, Sandy, Sibilla, Sincerely, Sirius, Sweet Ann, Sunsation, Susy, Talia, Tecla, Tethis, Toros, Vivara, Viktoriana, Багряная, Вырицкая, Гелиос, 7.19-17/2 (Готика), Гренада, Дукат, Загадка, Кокинская заря, Красный берег, Мишутка, Московский деликатес, Полли, Польвина, Присвята, Ремонтантная розовая, Рубиновый кулон, Соловушка, Спасская, Студенческая, Татиус, Троицкая, Ударница, Фейерверк, Фестивальная, Царица
FaOMT+/- FaFADl- 13,7 Aura, Dely, Chandler, Garigoutte «Neuve», Cristina, Orly, Premy, Roxana, Sandra, Laura, Богота, Витязь, Дивная, Кокинская ранняя, Красная капелька, Россинка, Славутич, Слоненок, Сударушка, Сюрприз Олимпиаде, Юния Смайдс
FaOMT-/- FaFADl- 6,5 Aprrna, Braiton, Elvira, Emi, Clery, Rania, Vima Rina, Жемчужница, Лакомка, Найдена добрая
результатам анализа было выделено 16,3% наиболее перспективных генотипов для селекции на аромат плодов: Red Gauntlet, Marshall, Sonata, Tokado, Vima Tarda и дикорастущие виды F. orientalis Los., F. moschata Duch. [3].
Высокая точность прогнозирования присутствия этих важных летучих веществ делает генетический анализ эффективным инструментом для его внедрения в селекционные программы земляники для отбора новых сортов, перспективных для селекции.
Заключение
В результате проведенного молекулярно-генетического анализа из 154 сортов земляники были выделены наиболее перспективные генотипы для селекции на качество плодов, которые совмещают гомозиготное состояние активной аллельной формы гена FaOMT с функциональным аллелем гена FaFADl и мо-гут служить комплексными источниками высокого содержания мезифурана и у-декалактона в плодах: Alba, Antea, Brilla, Dahli, Destiny, Elly, Flair, Flavia, Hademar, Hansalola, Honey, Holiday, Joly, Korona, Limalexia, Olympia, Onda, Onega, Osiris, Pegasus, Pircinque, Salsa, Sapore, Sonata, Теа, Tecla, Vicoda, Vima Tarda, Verona, Барокко, Вега, Классика, Торпеда.
Высокое содержание мезифурана в ягодах земляники можно прогнозировать у 72% из 154 проанализированных сортов: Allegro, Asia, Vivara, Candiss, Marmolada, Malling Allure, Charlotte, Mariguette, 7.19-17/2 (Готика), Кокинская заря, Татиус, Троицкая и др., характеризующихся гомозиготным состоянием функционального аллеля (генотип FaOMT+FaOMT+).
Потенциальными источниками высокого содержания у-декалактона в плодах могут быть сорта Alba, Elly, Flair, Hademar, Vima Tarda, Sapore, Gemil, Osiris, Sonata, Барокко, Классика и др., характеризующиеся наличием гена FaFADl, которые в общем составляют 29,2% из 154 проанализированных генотипов.
Список использованных источников
1. Продовольственная и сельскохозяйственная статистика [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://faostat.fao.org. - Дата доступа: 18.09.2023.
2. Genetic analysis of Methyl anthranilate, mesifurane, linalool and other flavor compounds in cultivated strawberry Fragaria x ana-nassa / C. R. Barbey [et al.] // Front Plant Sci. - 2021. - Vol. 12. - P. 1-16.
3. Лыжин, А. С. Полиморфизм сортов и дикорастущих видов земляники генетической коллекции Федерального научного центра им. И. В. Мичурина по генам аромата плодов FaOMT и FaFADl / А. С. Лыжин, И. В. Лукъянчук, Е. В. Жбанова // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2020. - Т. 24, № 1. - С. 5-11.
4. Validation of a PCR test to predict the presence of flavor volatiles mesifurane and y-decalactone in fruits of cultivated strawberry (Fragaria x ananassa) / E. Cruz-Rus [et al.] // Mol. Breed. - 2017. - Vol. 37, № 10. - P. 131.
5. Rey-Serra, P. Inheritance of esters and other volatile compounds responsible for the fruity aroma in strawberry / P. Rey-Serra, M. Mnejja, A. Monfort // Front Plant Sci. - 2022. - Vol. 13.
- P. 1-14.
6. Genetic analysis of strawberry fruit aroma and identification of O-methyltransferase FaOMT as the locus controlling natural variation in mesifurane content / Y. Zorrilla-Fontanesi [et al.] // Plant Physiological. - 2012. - Vol. 159, № 2. -P. 851-870.
7. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses / JF. Sanchez-Sevilla [et al.] // BMC Genomics. -2014. - Vol. 15, № 1. - P. 218.
8. Identification of a strawberry flavor gene candidate using an integrated genetic-genomic-analytical chemistry approach / A. H. Chambers [et al.] // BMC Genomics. - 2014. - Vol. 15, № 1.
- P. 217.
E. M. Kulik, T. N. Kamedzko, R. M. Pugachev
MOLECULAR GENETIC ANALYSIS OF GARDEN STRAWBERRY VARIETIES BY FaOMTAND FaFADl FRUIT AROMA GENES
Educational Institution “Belarusian State Agricultural Academy”
5 Michurin St., 213410 Gorki, the Republic of Belarus e-mail: ekaterinakulik113@gmail.com
The results of a molecular genetic analysis of 154 garden strawberry varieties of different origin by the genes that control fruit aroma are presented. The genetic analysis was carried out by two aroma genes: FaOMT, which controls mesifuran content and is localized in the distal region of the long arm of chromosome VII-F.1; and FaFAD1, which is responsible for the synthesis of y-decalactone and is localized in the distal region of the long arm of chromosome III2 of the F x ananassa Duch genome. The FaOMT-SI/NO marker allows distinguishing between active and inactive allelic forms of the FaOMT gene based on their amplification size, 248 and 217 bp respectively. The FaFAD1 marker identifies a 500 bp fragment, but it does not distinguish between dominant homozygous and heterozygous lines. An active allelic form of the FaOMT gene was identified in 90.9% of 154 strawberry varieties analyzed, while an inactive allelic form was found in 28% of the samples. The FaFADl gene was identified in 29.2% of genotypes. Strawberry varieties that combine the functional allele of the FaFADl gene with the homozygous state of an active allelic form of the FaOMT gene, and varieties that are characterized by a combination of the functional allele of the FaFADl gene with the heterozygous state of the FaOMT gene were identified. As a result of the study conducted, the most promising fruit aroma genotypes were identified for breeding, combining both aroma genes in their genome (FaOMT+ and FaFADl): Alba, Antea, Brilla, Dahli, Destiny, Flair, Hademar, Honey, Hansalola, Joly, Korona, Limalexia, Olympia, Osiris, Pircinque, Salsa, Sapore, Sonata, Tea, Vicoda, Vima Tarda, Barocco, Classic and Torpeda.
Keywords: fruit aroma, strawberries, varieties, mesifuran, y-decalactone, molecular genetic analysis.
Дата поступления в редакцию: 28 января 2024 г.
