CC BY
116
Медицинская Иммунология 2007, Т. 9, № 6, стр. 631-634 © 2007, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
молекулярно-генетический анализ полиморфизмов генов цитокинов -интерлейкина-1 в, рецептора антагониста интерлейкина-1 и интерлейкина-4 у Больных ревматоидным артритом башкирской этнической группы, проживающих в челябинской области
Бурмистрова А.Л.1, Сташкевич Д.С.1, Суслова Т.А.1, Девальд И.В.2, Исаканова А.О.3, Димчева О.Н.1
1 Научно-учебный центр Молекулярной иммуногенетики ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет»/ОГУП«Челябинская областная станция переливания крови»
2 ГОУ ВПО «Челябинская медицинская академия» Росздрава
3 Городская клиническая больница № 6, г. Челябинск
Резюме. Исследованы полиморфизмы в генах интерлейкина-1р, рецепторного антагониста интерлейкина-1 и интерлейкина-4 у больных ревматоидным артритом башкирской этнической группы, проживающих на территории Челябинской области. В ходе проведенной работы получено в группе больных повышение частоты генотипа, гомозиготного по высокопродуктивному аллелю гена интерлейкина-1р, обнаружена ассоциация между генотипом, гомозиготным по аллелю с двукратным повтором гена интерлейкина-4 и возрастом начала атаки заболевания.
Ключевые слова: полиморфизм, гены цитокинов, ревматоидный артрит.
Burmistrova A.L., Stashkevich D.S., Susslova T.A., Devald I.V., Issakanova A.O., Dimcheva O.N.
molecular biology analysis of IL-1P, IL-4, AND IL-1p RA GENE polymorphisms IN ETHNic bashkir patients with rheumatoid arthritis, living in chelyabinsk region
Abstract. Common polymorphisms of interleukin-1p, receptor antagonist interleukin-1, and interleukin-4 genes have been studied among the patients with rheumatoid arthritis of Bashkir origin, living in Chelyabinsk Region. As a result of study, an increased frequency of interleukin-1p homozygosity for a high-producer allele was found. An association has been revealed between the homozygosity for 2-repeat allele of interleukin-4, and
Адрес для переписки:
454021, г. Челябинск, ул. Братьев Кашириных, 129, биологический факультет.
Тел.: (351) 799-71-76.
Факс: (351) 742-09-25.
E-mail: stashkevich_dary@mail.ru
the age of disease onset. (Med. Immunol., 2007, vol. 9, N 6, pp 631-634)
Введение
Ревматоидный артрит (РА) является системным воспалительным заболеванием, аутоиммун-
ной природы, для которого характерен выраженный эрозивно-деструкивный полиартрит. В настоящее время РА относят к мультифактор-ным комплексным заболеваниям, чувствительность к которым определяется генетической составляющей и условиями окружающей среды. Основным генетическим фактором риска для РА являются гены классического иммунного ответа
II класса системы HLA [9, 11]. Ассоциация между генами комплекса HLA и развитием РА была показана еще в 1976 г. Stasny P. [9]. Однако генами HLA II класса обеспечивается лишь 30-50% общего семейного риска развития РА (по данным разных авторов). Скрининг генома показал наличие и других генов восприимчивости к РА, рассеянных по всему геному [9, 10]. Среди них большое внимание привлекают гены цитокинов и их рецепторов, продукты которых определяют поляризацию элементарных, локальных и системных цитокиновых полей. Данные о поляризации локальных цитокиновых полей (цитокиновый профиль синовиальной жидкости) чрезвычайно противоречивы, что возможно связано как с гетерогенностью заболевания, так и с полиморфизмом генов цитокинов [6, 10].
Тем не менее, большинство авторов считает, что гены цитокинов определяют не столько предрасположенность к РА, сколько клиническое течение заболевания: промоторные полиморфизмы в генах IL-1ß, IL-1Ra ассоциируются с более тяжелыми клиническими формами РА, а полиморфизм в экзоне IL-4 связан с выраженной деструкцией хряща [10]. Ранее группой авторов показано, что возраст начала заболевания, наличие системных проявлений и иммунологический вариант РА в башкирской популяции не зависят от генов HLA: локусов A, B, DRB1, DQA1, DQB1 [1]. Цель данной работы: оценить частоты встречаемости аллельных форм и генотипов генов цитокинов — IL-1ß, IL-^а, IL-4 у больных ревматоидным артритом башкирской этнической группы, проживающих на территории Челябинской области.
Материалы и методы
По данным сайта Всемирной Географии WGEO в Челябинской области по переписи 2002 года проживает 166 372 башкир, что составляет 4,62% от общей популяции (http://www.wgeo.ru/). В нашем исследовании было обследовано 60 пациентов с диагнозом РА башкирской этнической группы, проживающих в Челябинской области. Отбор пациентов проводили ассистенты кафедры госпитальной терапии Челябинской Государственной Медицинской Академии вне зависимости от стадии, клинического варианта течения заболевания и возраста начала РА. Средний возраст больных составил 46,5 лет, и сред-
ний возраст заболевания — 38,4 года. У 49 человек обнаруживался ревматоидный фактор (РФ), а у 11 человек был серонегативный РА. У 59 больных было отмечено поражение суставов в форме полиартрита, и только у одного человека был олигоартрит [1]. Контрольную группу составляли кадровые доноры ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови»: 89 человек. Этническая принадлежность больных РА и здоровых лиц определялась согласно рекомендациям Международного Уоркшопа (1980 г., Лос-Анджелес, США).
Характеристика исследуемых полиморфизмов. Гены IL-1 ß и IL-Жа расположены на второй хромосоме в районе 2q12 [4, 7]. Для исследования полиморфизма по одному нуклеотиду (SNP) в 5 экзоне гена IL-1ß (положение +3953) использовали разновидность ПЦР — ПДРФ — анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В основе метода лежит ПЦР с последующей обработкой ампликонов ферментом рестрикции Taq I для IL-1ß (+3953).
При гидролизе амплификационного фрагмента гена IL-1 ß эндонуклеазой рестрикции Taq I выявлялось три фрагмента размером 550 п.н., 146 п.н. и 404 п.н. Фрагмент 550 п.н. соответствует амплификационному фрагменту, не подвергнувшемуся гидролизу, что указывает на наличие аллеля IL-1 ß (+3953) Т, гомозиготное состояние обозначено m/m (сокращение от mutant — мутантный аллель). При наличии аллеля C происходит разрезание ампликона на два фрагмента 146 п.н. и 404 п.н., гомозиготность по этому аллелю обозначена w/w (сокращение от wild — аллель дикого типа), а гетерозиготное состояние С/Т в данном исследовании обозначено как w/m [4]. Для определения полиморфизма типа варьирующего числа тандемных повторов (VNTR) в гене IL-1Ra использовали ПЦР с праймерами, фланкирующими полиморфный регион в пределах второго интрона, в котором находится VNTR участка длиной 86 п.н. В результате амплификации мы идентифицировали фрагменты ДНК размером 438, 524, 610, и 696 н.п, соответственно, с 2, 3, 4 и 5 копиями тандемных повторов [4]. Эти аллели были обозначены как 2R, 3R, 4R и 5R в данном исследовании.
Ген IL-4 расположен на длинном плече 5 хромосомы [6]. Для исследования VNTR IL-4 проводили ПЦР с праймерами, фланкирующими полиморфный регион в пределах 3-го интрона, в котором находится вариабельное количество тандемных повторов размером 70 н.п. В результате амплификации идентифицировали фрагменты ДНК размерами 255 и 325 н.п., соответственно, с 2 и 3 копиями тандемных повторов. Эти аллели были обозначены как 2R и 3R [4]. Наборы для типирования генов цитокинов любезно предоставлены группой фармакогеномики инсти-
2007, Т. 9, № б
Полиморфизм генов цитокинов при РА
тута Химической Биологии и Фундаментальной Медицины (ИХБФМ СО РАН). Детекция полученных ампликонов проводилась методом вертикального электрофореза в 8% полиакриламидном геле.
Статистическая обработка результатов. Параметрами для определения служили: частоты аллельных вариантов генов цитокинов и их генотипов.
Для оценки частот аллельных вариантов использовался критерий Пирсона, который рассчитывался по формуле [2]:
N(ab -be)2
(a + b)(e + d)(a + e)(b + d)
При расчете достоверности распределения генотипов для каждого полиморфизма данные о частотах встречаемости генотипов сводили в таблицу сопряженности с двумя входами: генотип, состояние здоровья (больной РА, здоровый). Полученную таблицу обрабатывали в ходе иерархического логлинейного анализа, который позволяет рассчитать критерий максимального правдоподобия ^ или %2Мь) и критерий Пирсона (X2) [12]. Поскольку в таблицах имелись частоты меньше 5, то ко всем ячейкам добавляли константу 8 = 0,5. В иерархическом логлинейном анализе мы использовали отклонения Фримана-Тьюки, которые позволяют определить, за счет каких ячеек комбинаций «генотип — состояние здоровья» образуется общий статистически значимый результат или тенденция к различиям [12]. Для оценки вероятности возникновения заболевания в зависимости от возраста у носителей различных генотипов использовали анализ отношения шансов (шанс — отношение вероятности того, что событие произойдет, к вероятности того, что событие не произойдет) [3]. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р < 0,05, незначимыми при р > 0,10; для промежуточных значений р (0,05 < р < 0,10) обсуждали тенденцию к различиям.
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы была проведена оценка распределения частот аллелей и генотипов в группах здоровых лиц и больных РА башкирской этнической группы, проживающих в Челябинской области. Было установлено, что частоты аллельных вариантов исследуемых полиморфизмов оказались малоинформативны. Поэтому на следующем этапе мы изучали распределение частот генотипов в группах здоровых лиц и больных РА, для чего применяли иерархический логлиней-ный анализ. В ходе анализа было показано наличие статистически достоверного взаимодействия между SNP (+3953) ^-1р и состоянием здоровья (больной РА — здоровый, общий G = 9,16, р =
0,01; х2 = 8,95, p = 0,01 для 2 степеней свободы). При использовании отклонений Фримана-Тьюки обнаружено, что статистически значимый эффект достигался за счет изменений частот генотипов m/m (T/T) и w/m (C/T) в исследуемых выборках. В группе здоровых лиц снижена частота генотипа m/m (гомозиготного по высокопродуктивному аллелю Т), а в группе больных РА частота этого генотипа была высокой (11,7% против 2,3%, %2 = 4,07, р < 0,04 для одной степени свободы). Кроме того, выборка больных РА характеризовалась сниженной частотой гетерозиготного генотипа w/m (15% против 31,5% в выборке здоровых лиц, X2 = 6,12, р < 0,02 для одной степени свободы).
Для частот генотипов гена IL-4 не получено статистически значимых отличий между выборками здоровых лиц и больных РА.
Группа больных РА башкирской этнической группы характеризовалась повышенной частотой аллельного варианта 2r VNTR полиморфизма в гене IL-1Ra, но результаты не достигали статистической значимости (в группе контроля гомо-зиготность по этому аллелю не обнаружена).
Литературные данные по оценке распределения аллельных форм и генотипов генов IL-1 ß, IL-1Ra, IL-4 между выборками здоровых лиц и больных РА различных этнических групп противоречивы: в работе Cantagrel A. еt al. [6], проведенной на больных РА европеоидного происхождения, обнаружено достоверное повышение частоты встречаемости аллеля с 2-кратным повтором гена IL-4 у больных РА, а по полиморфизмам генов IL-1ß, IL-1Ra не было различий. Высокопродуктивный аллельный вариант Т SNP полиморфизма +3953 в гене IL-1 ß связан с выраженным эрозивным артритом только в сочетании с наличием HLA-DR общего эпитопа [6].
Группой исследователей во главе с Carreira P.E. при обследовании испанской популяции показано повышение частоты аллельного варианта с 2-кратным повтором VNTR гена IL-1Ra в группе больных РА по сравнению с группой здоровых лиц, кроме того, гомозиготное состояние по аллелю 2r было ассоциировано с большим числом пораженных суставов в течение первого года заболевания [7].
На втором этапе работы мы провели анализ частот встречаемости генотипов генов IL-1ß, IL-1Ra, IL-4 и возможной ассоциации полиморфизмов IL-1ß, IL-1Ra, IL-4 с наличием системных проявлений, иммунологическим вариантом РА и возрастом начала РА. Считают, что аллельные варианты генов цитокинов во многом определяют выраженность локальной или системной воспалительной реакции и ее исход, включая тканевое повреждение и репарацию [8, 10]. Мы не обнаружили ассоциации между распределением генотипов и такими показателями, как: наличие или отсутствие рев-
матоидного фактора и количество пораженных суставов. Однако была обнаружена ассоциация между возрастом дебюта РА (до и после 40 лет) и частотой встречаемости полиморфизма типа VNTR в гене IL-4 (общий G = 6,74, р = 0,03; X2 = 6,99, р = 0,03 для 2 степеней свободы). Продолжая изучение связи двух параметров «VNTR полиморфизм в гене IL-4 — возраст начала РА», используя отклонения Фримана-Тьюки, было установлено повышение частоты генотипа 2г/2г в группе больных с возрастом начала заболевания после 40 лет (35% против 7,7% в группе с ранним РА, X2 = 9,08, р < 0,005). При использовании анализа отношения шансов установлено, что шанс возникновения РА после 40 лет для носителей генотипа 2r/2r IL-4 в 6,5 раз выше, чем для других генотипов (3r/2r, 3r/3r) IL-4 (0 = 6,46, 95% ДИ = 1,204 - 42,94; р = 0,026).
Наши данные не противоречат данным литературы о наличии связи между 2R аллелем гена IL-4 и возрастом начала заболевания и (или) выраженностью клинических симптомов некоторых наследственно-обусловленных заболеваний: Vandenbroeck К. показал ассоциацию между частотой встречаемости 2R аллеля гена IL-4 и поздней атакой множественного склероза у больных рассеянным склерозом (РС), коренных жителей Сардинии [13], Buchs N. [5] продемонстрировал, что 2R аллель IL-4 может быть протективным фактором тяжести деструкции суставов при РА (пациенты с недеструктивным артритом имели повышенную частоту встречаемости 2R аллеля).
Полученные в нашем исследовании результаты подтверждают участие полиморфизмов генов IL-1ß, IL-4 в развитии предрасположенности и вариабельности течения некоторых наследственно-обусловленных заболеваний, в том числе и РА.
Заключение
1) Показано, что у больных РА башкирской этнической группы повышена частота гомозиготного варианта по высокопродуктивному аллелю Т и снижена частота гетерозиготного варианта гена IL-1 ß (С/Т) полиморфизма типа SNP в положении +3953.
2) Установлена ассоциация между частотой гомозигот 2r/2r гена IL-4 и возрастом начала заболевания: аллель 2r является маркером замедленного старта РА, а шанс возникновения РА после 40 лет у больных, носителей генотипа 2r/2r, возрастает в 6,5 раз.
Таким образом, полиморфизм SNP +3953 гена IL-1ß можно рассматривать как маркер предрасположенности к ревматоидному артриту, а гомозиготный генотип 2r/2r гена IL-4 может являться маркером позднего (после 40 лет) начала заболевания у башкир.
Список литературы
1. Бурмистрова А.Л., Девальд И.В., Череш-нев В.А., Суслова ТА., Празднов А.С. Иммуноге-нетический анализ башкирской этнической группы Южно-уральского региона и ассоциация генов HLA I и II классов с ревматоидным артритом у башкир // Иммунология. — 2005. — № 2 . — С. 68-71.
2. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика. — М.: Медицина, 1983. — 208 с.
3. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных: Применение пакета прикладных программ STATISTICA. — М.: МедиаСфера, 2002. - 312 с.
4. Шабалдин А.В., Филипенко М.Л., Воронина Е.Н., Глушков А.Н., Симонова Т.А. Полиморфизм генов антагониста рецептора интерлейкина-1 и интерлейкина-4 при репродуктивных нарушениях // Иммунология. — 2005. — № 1. — С. 6-9.
5. Buchs N., Silvestri T, di Giovine F.S., Chabaud M., Vannier E., Duff G. W, Miossec P. IL-4 VNTR gene polymorphism in chronic polyarthritis. The rare allele is associated with protection: against destruction // Rheumatology. — 2000. — Vol. 39.— P. 1126-1131.
6. Cantagrel A., Navaux F. Interleukin-1p, Interleukin-1 receptor Antagonist, Interleukin-4, and Interleukin-10 gene polymorphisms relationship to occurrence and severity of rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. — 1999. — \bl. 42. — P. 1093-1100.
7. CarreiraP.E., Gonzalez-CrespoM. R., CirueloE., Pablos J.L., Santiago B., Gomez-Camara A., Gomez-Reino J.J. Polymorphism of the Interleukin-1 Receptor antagonist gene a factor in susceptibility to rheumatoid arthritis in a Spanish population // Arthritis Rheum. — 2005. — Vol. 52. — P. 3015-3019.
8. Choy Ernest H.S. Cytokine pathways and joint inflammation in rheumatoid arthritis // N. Engl. Med. — 2001. — Vol. 344, № 12. — P. 907-916.
9. Dieude P., Cornelis F. Genetic basis of rheumatoid arthritis // Jt. Bone Spine. — 2005. — Vol. 9. — P. 3-7.
10. Harney S., Wordsworth B.P. Genetic epidemiology of rheumatoid arthritis // Tis. Antigens. — 2002. — Vol. 60. — P. 465-473.
11. Lee D.M., Winblatt M.E. Rheumatoid arthritis // Lancet. — 2001. — Vol. 358. — P. 903-911.
12. Sokal R.R., Rolf F. The principles and practice of statistics in biological research // J. Biometry. — N.Y: Freeman & Co, 1995. — 850 p.
13.Vandenbroeck K., Martino G., Marrosu M., Consiglio A., ZaffaroniM., Vaccargiu S., Franciotta D., Ruggeri M., Comi G., Grimaldi L.M. Occurrence and clinical relevance of an Il-4 gene polymorphism in patients with multiple sclerosis // J. Neuroimmunol. — 1997. — ЛЫ. 76. — P. 189-192.
поступила в редакцию 24.04.2007 принята к печати 30.05.2007
