CC BY
79
© Т.Ю. САЛИНА, Т.И. МОРОЗОВА, 2013 УДК 579.873.21:579.25].083.1:577.21.08
Т.Ю. Салина, Т.И. Морозова МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИз ЮОНИАзИДРЕзИСТЕНТНЫХ
штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих на территории
САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ
Саратовский областной клинический противотуберкулезный диспансер; ГБОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России
Изучены распространенность и спектр мутаций в генах katG, inhA, ahpC, кодирующих лекарственную устойчивость к изо-ниазиду у 257 больных активным туберкулезом легких, проживающих на территории Саратовской области. Исследования проводили на биологических микрочипах с применением набора реагентов «ТВ-биочип-МДР» (Россия). Установлена большая распространенность (55,7%) штаммов Mycobacterium tuberculosis, имеющих лекарственную устойчивость к изониазиду. Среди изониазидрезистентных штаммов выявлены неблагоприятный спектр генетических мутаций, а именно большое количество (26,9%) сочетанных мутаций в двух и трех генах одновременно, преобладание мутации в гене katG Ser315-Thr1 (91,1%), что сопряжено с высоким уровнем лекарственной устойчивости к изониазиду. Чувствительность тест-системы "ТВ-Биочип-МДР" составила 88,2%, специфичность - 91,3%. Полученные данные указывают на необходимость разработки дополнительных мер по ограничению распространения изониазид-резистентных штаммов M. tuberculosis.
К л ю ч е в ы е с л о в а : туберкулез, лекарственная устойчивость, изониазид, мутации в генах
Распространение лекарственно-устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis является одной из наиболее важных проблем борьбы с туберкулезом, как во всем мире, так и в России [1, 5]. С момента открытия Ваксманом стрептомицина в 1943 г. лекарственная устойчивость (ЛУ) неотступно следует за антибактериальной терапией [5]. Внедрение в 50-х годах XX столетия в клиническую практику высокоэффективных лекарственных препаратов - изо-ниазида (INH) и его производных - также повлекло за собой появление случаев ЛУ к этой группе препаратов [5] и до настоящего времени регистрируется рост числа лекарственно-устойчивых штаммов МБТ к INH [1]. Молекулярно-генетические исследования позволили раскрыть некоторые генетические механизмы развития ЛУ Mycobacterium tuberculosis [3, 9, 10-12]. В основе ЛУ МБТ лежат хромосомные мутации в независимых генах МБТ, которые, как правило, происходят под воздействием неадекватной терапии и монотерапии [3, 6]. Устойчивость к INH кодируется несколькими генами: katG, inhA, ahpC [7-10]. Для INH характерен многоступенчатый процесс активации и превращения его в активное производное, способное ингибировать синтез миколовой кислоты [6]. Изониазид попадает в МБТ в качестве пролекарства, которое начинает действовать после его окисления ферментом каталазой-пероксидазой и превращения в активный промежуточный продукт, оказывающий неблагоприятное воздействие на микробную клетку [3, 6, 7, 9]. Мутации в гене katG, нарушающие способность каталазы окислять INH, приводят к формированию к нему ЛУ [3, 7, 9-11]. В присутствии интактной каталазы-пероксидазы генерируется активный агент, который подавляет работу фермента, участвующего в синтезе миколовой кислоты - еноил-кислой фос-
фатредуктазы, кодируемой геном inhA [6, 10]. Повышение содержания еноил-кислой фосфатредуктазы, возникающей в результате мутации в гене inhA, подавляет ингибирующее действие INH на микробную клетку, участвуя в процессе детоксикации его активного промежуточного продукта [6]. В этом же процессе детоксикации активного интермедиатора INH участвует и фермент алкилгидропероксидредуктаза, кодируемый геном ahpC [6, 8]. Мутации в генах inhA и ahpC также являются причиной устойчивости к INH у некоторых клинических изолятов [6, 8].
Цель настоящей работы - изучение спектра и распространенности мутаций в генах katG, inhA, ahpC в штаммах M. tuberculosis, циркулирующих на территории Саратовской области, с помощью метода биологических микрочипов.
Материал и методы
Обследовано 257 больных: 174 (67,7%) мужчины и 83 (32,3%) женщины с активным туберкулезом легких, находившихся на стационарном лечении в Саратовском областном клиническом противотуберкулезном диспансере в 2010-2011 гг. Из них 247 (96,1%) впервые выявленных больных и 10 (3,9%) больных с рецидивами. Клинические формы туберкулеза представлены преимущественно инфильтративным - у 196 (76,3%) и диссеминированным - у 32 (12,5%). Другие формы туберкулеза наблюдались в единичных случаях: очаговый туберкулез - у 4 (1,6%) больных, казеозная пневмония - у 2 (0,78%), фиброзно-кавернозный туберкулез легких - у 4 (1,6%), туберкулемы - у 19 (7,4%). Бактериовыделение выявлено у 132 (51,4%) больных, деструктивные изменения в легких - у 118 (45,9%). У всех пациентов наряду с традиционными методами микробиологической диагностики туберкулеза, выявление микобактерий туберкулезного комплекса, определение их лекарственной чувствительности к изониазиду и рифампицину, а также изучение спектра генетических мутаций ДНК M. tuberculosis проводили в образцах мокроты методом биологических микрочипов с использованием набора реагентов «ТВ-биочип MDR». Технология проведения исследований, набор реагентов и оборудования разработаны сотрудниками Института молекулярной биологии им. В.А. Эн-гельгардта РАН (ООО «Биочип-ИМБ»), Москва. Результаты реакции регистрировали на портативном анализаторе биочипов «Чипдетектор-01» с соответствующим программным обеспечением Imageware (Россия). Базовая методология проведения исследований основана на выделении ДНК МБТ из мокроты обследуемых, проведения двух последовательных мультиплексных полимеразных цепных реакций (ПЦР) со специфическими для МБТ праймерами и гибридизации продуктов амплификации 2-й стадии ПЦР с олигонуклеотидными зондами, помещенными в ячейках микрочипа [4]. В случае обнаружения мутаций в генах katG, inhA, ahpC штаммы M. tuberculosis относили к устойчивым к INH, при отсутствии мутаций - к чувствительным, при наличии одновременно мутаций еще и в гене rpoB, кодирующих лекарственную устойчивость к рифампицину - к штаммам с множественной ЛУ (МЛУ).
У 120 пациентов, выделенных из общего числа обследован-
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 1
Распространенность мутаций в генах, кодирующих ЛУ к INH
Гены, кодирующие ЛУ к INH Количество мутаций в генах
абс. %
katG 54 58,1
inhA 14 15,1
katG + inhA 22 23,7
katG + inhA + ahpC 3 3,2
Всего... 93 100
ных, проведено сравнительное изучение ЛУ к INH, выявленной методом биочипов, и методом абсолютных концентраций при посеве на твердые питательные среды.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием компьютерных программ Microsoft Excel для Windows XP и Statistica 6.0. Для сравнения достоверности различий в двух группах использовали х2-тест. В качестве критического уровня достоверности был принят критерий 0,05.
Результаты и обсуждение
Для проведения исследований ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в количестве, достаточном для определения ЛУ, была выделена из мокроты 167 (64,9%) из 257 пациентов с активным туберкулезом легких. Мутации в генах katG, inhA, ahpC, кодирующие ЛУ к изониазиду, обнаружены у 93 (55,7%) пациентов, включая МЛУ у 58 (62,4%) и изолированную ЛУ к INH у 35 (37,6%). Результаты представлены в табл. 1.
Как видно, мутации только в одном гене обнаружены в большинстве клинических образцов мокроты - в 68 (73,1%), из них в 54 (58,1%) в гене katG и в 14 (15,1%) в гене inhA; мутации в двух генах выявлены в 22 (23,7%) случаях, мутации в трех генах - в 3 (3,2%).
Среди всех мутантных к INH штаммов МБТ преобладали замены в гене katG у 79 (84,9%) пациентов, включая изолированные мутации в гене katG у 54 (58,1%) и в сочетании с мутациями в других генах у 25 (26,9%). Частота мутаций в гене katG в нашем исследовании существенно не отличалась от результатов других исследователей [2, 11]. Из 79 образцов мокроты, имеющих мутации в гене katG, в 72 (91,1%) случаях регистрировалась мутация Ser315->Thr1. По данным литературы [9, 12], мутация в гене katG (Ser315->Thr1) представляет наибольший интерес, так как устойчивые к INH штаммы с этой мутацией сохраняют полную вирулентность и обусловливают высокий уровень ЛУ, а также обладают наибольшим потенциалом широкого распространения в качестве изолятов МЛУ.
Изолированные мутации в гене inhA зарегистрированы нами у 14 (15,1%) пациентов. По данным ряда исследователей [3, 6], эти мутации обусловливают низкий уровень ЛУ к INH (менее 1 мкг/мл), однако у 22 (23,7%) пациентов установлено наличие одновременно мутации в генах katG и inhA и у 3 (3,2%) - в генах katG, inhA и ahpC. В литературе имеются сведения о том, что потеря активности каталазы (мутации в гене katG) в сочетании с мутациями гена inhA имеет кумулятивный эффект при формировании ЛУ к INH [10]. Мутации в гене ahpC имеют компенсаторный характер в ответ на потерю каталазной активности и встречаются редко [2, 8].
Мы сравнили спектр генетических мутаций в об-
Таблица 2
Сравнительная распространенность одиночных и комбинированных мутаций в генах katG, inhA, ahpC в группах пациентов с изолированной ЛУ к INH и МЛУ
Мутации в генах Изолированная ЛУ к INH (n = 35) Устойчивость одновременно к INH и рифампи-цину (МЛУ) (n = 58) Р
абс. % абс. %
Одиночные 32 91,4 36 62,1 0,0021
Двойные 2 5,7 20 34,5 0,0021
Тройные 1 2,9 2 3,5 0,8031
разцах мокроты, имеющих изолированную ЛУ к ШН и МЛУ Результаты представлены в табл. 2, из которой видно, что в группе пациентов с изолированной устойчивостью к ШН (п = 35) преобладали мутации в одном гене - у 32 (91,4%). В то же время у пациентов с МЛУ (п = 58) достоверно чаще наблюдались двойные мутации, представляющие собой сочетание мутации в генах каЮ и ^А, - у 20 (34,5%) против 2 (5,7%) в группе с изолированной устойчивостью к ШН (р = 0,0021). Эти данные подтверждают ранее высказанное предположение [10] о возможном кумулятивном эффекте устойчивости при сочетании мутации в генах katG и inhA, что вызывает усиление резистентности к ГЫН. Спектр генетических мутаций к ШН представлен в табл. 3. Изолированные мутации в гене inhA зарегистрирова-
Таблица 3
Мутации в генах katG, inhA, ahpC, кодирующие ЛУ к INH
Мутации в генах Изолированная ЛУ к INH (n = 35) (абс/%) ЛУ одновременно к INH и рифампи-цину (МЛУ; n = 58) (абс/%) Р
1. katG 24/68,6 30/51,7 0,1106
1.1. Ser315->Thr1 21/87,5 27/90 0,8262
1.2. Ser315->Arg 1/4,2 1/3,3 0,8019
1.3. Ser315->Gly 1/4,2 1/3,3 0,8019
1.4. Ser 315->Arg+Trp328->Gly 1/4,2 1/3,3 0,8019
2. inhA 8/22,9 6/10,3 0,09
2.1. inhA-G16 2/25 0
2.2. inhA-G8 2/25 0
2.3. inhA-A8 1/12,5 0
2.4. inhA-T15 3/37,5 0
3. katG+inhA 2/5,7 20/34,5 0,021
3.1. Ser315->Thr1+inhA-A8 1/4,2 9/45 0,0001
3.2. Ser315->Thr1+inhA-T15 1/4,2 11/55 0,0001
4. katG+inhA+ahpC 1/2,9 2/3,5 0,8752
4.1. Ser315->Thr1 + inhA-G16+ahpC-A10 0 1
4.2. Ser 315->Thr1+ inhA-T15+ ahpC-T12 0 1
4.3. Ser315->Arg+ Trp328->Leu+ inhA- 1 0
G16 +ahpC-A10
Таблица 4
Сравнительные результаты исследования ЛУ M. tuberculosis к изо-ниазиду бактериологическим методом абсолютных концентраций и методом биочип-анализа
Тестирование методом Число обследованных Анализ с применением ТВ-биочип (n) Чувстви- Специ-фич- ность, %
абсолютных концентраций (посев) INH- устойчивые INH- чувствительные тельность, %
Идентифи- 51 45 6 88,2
цированы
как устойчивые к ШН
Идентифи- 69 6 63 91,3
цированы
как чувстви-
тельные к
МН
Всего... 120 52 68
Чувствительность метода биочип-анализа при выявлении резистентных к ШН штаммов по сравнению с таковой метода абсолютных концентраций составила 88,2%, специфичность - 91,3%, т. е. тест-система ТВ-биочип по чувствительности и специфичности не уступает стандартному бактериологическому методу исследования.
10
ны у 14 (15,1%) пациентов. По данным ряда исследователей [3, 6], эти мутации обусловливают низкий уровень устойчивости к INH (менее 1 мкг/мл), однако у 22 (23,7%) пациентов установлено наличие одновременно мутаций в генах katG и inhA и у 3 (3,2%) - в генах katG, inhA и ahpC. В литературе имеются сведения о том, что потеря активности каталазы (мутации в гене katG) в сочетании с мутациями в гене inhA имеет кумулятивный эффект при формировании устойчивости к INH [10]. Мутации в гене ahpC имеют компенсаторный характер в ответ на потерю каталазной активности и встречаются редко [2, 8].
Сравнительные результаты определения ЛУ к INH методом биочипов и методом абсолютных концентраций при посеве на плотные питательные среды представлены в табл. 4. Методом абсолютных концентраций устойчивость к INH была обнаружена у 51 (42,5%) пациента из 120 обследованных. Среди этих устойчивых к INH штаммов методом биочип-анализа устойчивость к INH определена в 45 случаях и чувствительность тест-системы биочипов составила 88,2%, а 5 образцов были идентифицированы методом биочипов как чувствительные. В то же время среди 69 образцов, которые методом абсолютных концентраций были идентифицированы как чувствительные к INH, методом биочип-анализа выявлено 6 (8,7%) устойчивых; таким образом, специфичность биочип-анализа составила 91,3%.
Таким образом, показано, что на территории Саратовской области циркулирует большое (55,7%) количество штаммов M. tuberculosis, имеющих мутации в генах, кодирующих ЛУ к INH.
Среди устойчивых к INH штаммов МБТ регистрируется неблагоприятный спектр генетических мутаций, а именно большое (26,9%) количество штаммов, имеющих сочетанные мутации в двух и трех генах, преобладание мутаций Ser315->Thr1, что, по данным литературы, сопряжено с высоким уровнем ЛУ.
Установлено, что указанный вид мутаций Ser315->Thr1 достоверно чаще (84,5%) встречается среди штаммов с МЛУ по сравнению с образцами, в которых выявлена изолированная устойчивость к INH (65,7%; p = 0,0352).
Сведения об авторах:
Салина Татьяна Юрьевна - д-р мед. наук, доц. каф. фтизиатрии ФПК и ППС ГБОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздрава России, е-таЛ: SalinaTU@rambler.ru;
Морозова Татьяна Ивановна - д-р мед. наук, проф., гл. врач Саратовского областного клинического противотуберкулезного диспансера, зав. каф. фтизиатрии ФПК и ППС ГБОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздрава России, е-шай: dispans@san.ru
ЛИТЕРАТУРА
Воробьева О.А. Сибирский медицинский журнал. 2008; 2: 5-8. ИсаковаЖ.Т. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2008; 4: 36-8.
Коровкин В.С. Медицинские новости. 2003; 9: 8-13. Михайлович В.М., Лапа С.А., Грядунов Д.А. и др. Бюллетень экс-пеиментальной биологии и медицины. 2001; 1: 112-7. СамойловаА.Г., Марьяндышев А.О. Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2005; 7: 3-8.
Степаншин Ю.Г., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Антибиотики и химиотерапия. 1999; 4: 39-43.
Pym A.S., Domeneech P., Honore N., Song J., Deretic V., Cole S.T. Mol. Microbiol. 2001; 40 (4): 879-89.
Streevatsan S., Pan X., Zhang Y., Deretic V, Musser J. M. Antimi-crob. Agents Chemother. 1997; 41 (3): 600-6. Saint-Joanis B., Souchon H., Wilming M., Johnsson K., Alzari P.M., Cole S.T. Biochem. J. 1999; 338: 753-60.
Wilson T.M., de Lisle G.W., CollinsD.M. Mol. Microbiol. 1995; 15 (6): 1009-15.
11. Wu X., Zhang J.,Zhuang Y., Zhang X., Lig G., He X. Clin. Med. J. 1999; 112 (6): 524-8.
12. WengenackN.L., Uhl J.R., St. Amand A.L. et al. J. Infect. Dis. 1997; 176: 722-7.
Поступила 10.07.12
MOLECULAR GENETIC ANALYSIS OF THE
ISONIAZID-RESISTANT STRAINS OF M. TUBERCULOSIS CIRCULATING OVER THE SARATOV REGION
T. Yu. Salina, T. I. Morozova
Saratov Regional Clinical Antituberculosis Dispensary, Saratov State Medical University, Saratov, Russia
257 patients with active lung tuberculosis in the Saratov region were tested for distribution and mutation spectrum of the genes katG, inhA, ahpC encoding Isoniazid-resistance. The tests were implemented using the biological microchips with pharmacological kits TV-Biochip MDR (Russia). The rate of the Isoniazid-resistant M. tuberculosis strains incidence was found to be 55.7%. The Isoniazid-resistant strains demonstrated high rate (26.9%) of combined mutations in 2 and 3 genes simultaneously, domination in the katG ser315->Thr1 (91.1%), thereby inducing high resistance to Isoniazid. The sensitivity of the TV-Biochip MDR test-system was 88.2%; the specificity, 91.3%. The results of this work show that the incidence of the Isoniazid-resistant strains should be limited using additional measures.
Key words: tuberculosis, drug resistance, Isoniazid, gene mutations
