CC BY
14УДК 577.2:575:582.632.1(4-11)
П.С. Кирьянов1, О.Ю. Баранов1, А.А. Маслов2, А.В. Падутов1
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ИДЕНТИФИКАЦИИ МЕЖВИДОВЫХ И ВНУТРИВИДОВЫХ ГИБРИДОВ БЕРЕЗ ВОСТОЧНО-ЕВРОПЕЙСКОГО РЕГИОНА
Институт леса НАН Беларуси Республика Беларусь, 246001, г. Гомель, ул. Пролетарская, 71 e-mail: PKirjanov@yandex.ru 2Институт лесоведения РАН Россия, 143030, п/о Успенское, ул. Советская, 21 e-mail: amaslov@ilan.ras.ru
В статье представлены результаты молекулярно-генетических исследований представителей рода Betula (Береза), характеризующихся различным таксономическим статусом. Рассмотрены подходы к идентификации межвидовых и внутривидовых гибридов на основе использования SSR- и EST-маркеров. Показано, что наиболее информативным способом диагностики межвидовых гибридов березы повислой и пушистой (B. pendula^pubescens) является оценка SSR-спектров гетерозиготных растений. Приведены данные об особенностях распределения показателей генетического полиморфизма среди селекционных форм березы повислой (B. pendula Roth.) и карельской березы (B. pendula Roth. var. carelica Mercl.).
Ключевые слова: ДНК-маркирование, EST- и SSR-локусы, гетерозиготность, береза.
Введение
Гибридизация представляет собой процесс объединения генетического материала наследственно различающихся индивидов живых организмов. При этом в процессы гибридизации, протекающие в естественных условиях, могут быть вовлечены как индивиды, относящиеся к популяциям одного вида (внутривидовая гибридизация), так и к разным видам (отдаленная гибридизация) [1].
Гибридизация sensu lato является одним из естественных механизмов, обеспечивающих поддержание потока генов между популяциями или видами, и ее действие, согласно основным принципам популяционной генетики, направлено на снижение уровня генетической под-разделенности и дифференциации внутри или между видами соответственно. В то же время, в случае конкурентного преимущества гибридных индивидов над исходными родительскими формами, характер протекающих процессов в популяциях приобретает явно выраженные черты формирования микроэволюционных изменений и создает предпосылки для последующего видообразования. Согласно исследованиям различных авторов, гибридогенное видообразова-
ние отмечено для значительного числа систематических групп растительных организмов. При этом в особой степени данное явление выражено среди родовых таксонов, характеризующихся наличием полиплоидных рядов [2].
Изучение различных аспектов гибридизации имеет не только важное научное значение для решения широкого спектра вопросов в области филогении, систематики, таксономии, по-пуляционной и молекулярной генетики, но и представляет собой актуальную практическую задачу, направленную на создание, выявление и отбор генотипов с заданными показателями хозяйственно-ценных признаков. Важной методологической составляющей исследования процессов интрогрессии и интерградации, оказывающей значительное влияние на достоверность получаемых результатов, и, в частности, точность определения таксономического статуса гибридного потомства различных поколений, является информативность используемых аналитических подходов, что в свою очередь определяет необходимость постоянного совершенствования методов изучения, включая оптимизацию используемых диагностических признаков и маркеров [3].
Традиционными признаками, используемыми в таксономических исследованиях растительных организмов, являются качественные и количественные морфолого-анатомические характеристики генеративных и вегетативных органов. Несмотря на основополагающую роль морфолого-анатомических признаков в систематике растений, в случае идентификации близкородственных видов данный подход зачастую имеет ряд ограничений, что, как правило, связано с отсутствием дискретных критериев оценки, наличием модификацион-ной изменчивости, а также определенной доли субъективизма при выполнении анализа. Наличие данных проблемных аспектов делает невозможным проведение достоверного анализа гибридного потомства близкородственных видов даже в первом поколении. Для решения указанных спорных вопросов систематики, как правило, используют дополнительные методы исследования, основанные на применении альтернативных диагностических критериев: физиологических, репродуктивных, экологических, биохимических, цитологических, кариологических и др. Однако следует отметить, что все перечисленные подходы не являются универсальными и применимы только по отношению к определенным таксономическим группам. Развитие молеку-лярно-генетических технологий позволило разработать широкий спектр различных типов ДНК-маркеров, позволяющих проводить комплексные таксономические исследования, включая диагностику гибридных индивидов различного типа. Однако, несмотря на наличие значительного числа преимуществ молеку-лярно-генетических признаков перед другими типами систематических маркеров, в рамках текущей общепринятой концепции классификации живых организмов основной проблемной задачей является определение исходного эталонного генотипа вида для проведения последующего сравнительного анализа. Среди вариантов решений данного вопроса можно выделить популяционные, геногеографиче-ские, палеоботанические аспекты, направленные на установление центров происхождения видов и, соответственно, выбора наиболее типичного референсного генома. Дополнительные подходы, связанные с ранжированием по таксономической значимости тех или иных
участков генома, в настоящее время обсуждаются в литературе широким кругом исследователей, представляющих различные области молекулярной биологии, эволюционного учения и систематики [4].
Береза (Betula L.) является одной из распространенных лесообразующих пород на территории Восточно-Европейского региона. Среди полнодревесных форм доминирующее положение занимают береза повислая (B. pendula Roth) и береза пушистая (B. pubescens Ehrh.). Среди кустарниковых форм можно выделить березу приземистую (B. humilis Schrank) и березу карликовую (B. nana L.). Широкое хозяйственное и декоративное значение нашли различные представители древесной флоры, отнесенные к роду Betula: карельская береза, далекарлийская береза, чернокорая береза, извилистая береза и др. Наличие широкого непрерывного спектра внутри- и межвидовой изменчивости делают березы одним из ценных объектов для изучения процессов интрогрессивной гибридизации и интерградации древесных видов. Среди вопросов, остающихся нерешенными до настоящего времени, наибольшую фундаментальную значимость представляют аспекты естественной гибридизации и филогенетических взаимоотношений березы повислой и пушистой, изучение процессов авто- и аллоплоидизации берез как источника видообразования, выяснение роли гибридогенных факторов в формировании габитуального разнообразия и анатомических особенностей древесины карельской березы и др. С практической точки зрения, особую актуальность представляет направление селекции берез, включая вопросы наследуемости и проявления полигенных признаков в гибридном потомстве, гетерозиса, особенности системы скрещивания и др. [5].
Как отмечалось ранее, окончательное решение данных вопросов является невозможным без применения дополнительных подходов к их изучению, позволяющих получить новые данные и расширить представление о процессах гибридизации видов рода Betula. Исходя из всего вышесказанного целью данной работы явилось использование различных молекулярно-генетических подходов для проведения идентификации межвидовых и внутривидовых гибридов берез ВосточноЕвропейского региона.
Материалы и методы
Экспериментальный материал для проведения молекулярно-генетических исследований берез (Б. повислая, Б. пушистая, Б. карликовая, Б. приземистая, Б. темнокорая и их межвидовые гибриды, вариатеты — карельская береза, дале-карлийская береза) был собран в насаждениях естественного и искусственного происхождения, лесных питомниках, а также отобран в ходе работ с коллекциями культур in vitro в период 2009-2015 гг. на территории Витебского, Калинковичского, Клецкого, Кобринского опытного, Минского, Могилеского, Молодечненско-го, Пинского, Речицкого, Чечерского специального, Жлобинского лесхозов, а также Двинской и Кореневской экпериментальной лесной базы и коллекции культур in vitro Института леса НАН Беларуси и Березинского биосферного заповедника, в испытательных культурах Института аграрных и лесных наук Литвы, на постоянных пробных площадях Института лесоведения РАН (ИЛАН) в Московской области. Всего проанализировано 527 образцов.
Экспериментальный материал представлял собой округлые высечки из листьев (d ~ 1 см) как с растений, для которых была проведена предварительная оценка таксономического статуса, так и с образцов с неустановленной видовой принадлежностью.
Выделение ДНК производилось на основании CTAB-протокола [6]. В ходе исследований были использованы следующие группы ДНК-маркеров: SSR, или микросателлиты (локусы L2.2, L1.10, L7.8, L022, L7.3, L5.4, L3.1) [7], и EST (экспрессируемые локусы ADH, ACT, TUB [8]. Полимеразную цепную реакцию выполняли с использованием коммерческих наборов согласно протоколам фирм-производителей. Секвенирование EST локусов и электрофоре-тический анализ SSR-маркеров проводили с применением генетического анализатора ABI Prism 310 (Applied Biosystems) в соответствии с алгоритмами, рекомендуемыми компанией-изготовителем. Нуклеотидная структура секвени-рованных ампликонов берез анализировалась с помощью сервиса BLAST в GenBank NCBI [9].
Результаты и обсуждение
Основным принципом генетической идентификации гибридов является выявление у изучаемых индивидов промежуточных значе-
ний или одновременного сочетания наследуемых признаков исходных родительских особей. При этом использование большого числа ДНК-маркеров позволяет идентифицировать не только гибриды первого поколения, но и на основании анализа уровня сходства с рефе-ренсными генотипами определять потомство, образующееся в ходе возвратных скрещиваний. Для анализа процессов интрогрессивной гибридизации в качестве молекулярно-генетиче-ских маркеров выступают локусы, изменения в которых сопряжены с последовательностью этапов дивергенции видов. В большинстве случаев генетический полиморфизм ассоциирован со структурными преобразованиями внутри локусов и выражается в форме наличия видо-специфических аллельных вариантов. Таким образом, гибридное потомство от межвидовых скрещиваний будет представлено особями, генотип которых содержит аллели двух разных видов, долевое соотношение которых напрямую определяется таксономическим статусом родительских пар, участвующих в скрещивании. Тем не менее, данный подход может быть реализован только для видов, характеризующихся дискретными молекулярно-генетиче-скими отличиями по ряду ДНК-маркеров.
Как правило, явные генетические различия свойственны видам с аллопатрическим типам ареала, дивергенция которых произошла в хронологически давний период. В то же время изученные виды берез (Б. повислая, Б. пушистая, Б. приземистая и Б. карликовая), произрастающие в Восточно-Европейском регионе, характеризуются наличием симпа-трических ареалов, а время их дивергенции, с филогенетической точки зрения, является относительно недавним и не превышает 20 млн лет. Отличительной особенностью Б. пушистой от других видов берез является удвоенный набор хромосом (4п = 56), в то время как наиболее типичный кариотип Б. повислой, Б. карликовой и Б. приземистой представлен 2п = 28 хромосомами. Видообразование Б. повислой, Б. карликовой и Б. приземистой, по литературным данным, происходило путем расхождения группы особей предкового вида по экологическим признакам, а механизмы дивергенции Б. пушистой были основаны на полиплоидизации. При этом если в первом случае изменения накапливались постепен-
но, а сам процесс видообразования был значительно пролонгирован по времени, то во втором случае видообразование происходило сальтационно.
Таким образом, использование аллель-специфического подхода является, на наш взгляд, более информативным по отношению к сравниваемым парам Б. повислая - Б. карликовая, Б. повислая - Б. приземистая, Б. карликовая - Б. приземистая, а для анализа гибридного потомства Б. повислая х Б. пушистая, или Б. пушистая х Б. карликовая, Б. пушистая х Б. приземистая преимущество будут иметь подходы, основанные на оценке уровня пло-идности, в т. ч. и молекулярно-генетические.
К настоящему времени среди ДНК-маркеров выделяют несколько альтернативных методов, позволяющих производить оценку геномных вариаций и аберраций. Наиболее распространенным и воспроизводимым способом анализа является генотипирование на основе применения кодоминантных RFLP и SSR (микроса-теллитных) локусов. Данный подход широко используется в медицине для анализа молеку-лярно-генетической патологии «Потеря гете-розиготности» (111, или LOH), связанной с де-лецией фрагмента хромосомы или ее утратой целиком. В качестве RFLP-локусов используются непосредственно фрагменты самих генов (EST), SSR-маркеров — внутренние повторы в генах (EST-SSR), или сцепленные с генами микросателлитные локусы. Преимуществом последнего типа маркеров является значительная разрешающая сила анализа, определяемая высоким уровнем изменчивости. Для анализа микросателлитных локусов на современном этапе используют автоматизированные генетические анализаторы, характеризующиеся высокой чувствительностью детекции исследуемых
1
молекул ДНК и стандартизированными условиями электрофоретического фракционирования.
Исходя из проведенных ранее кариологиче-ских исследований берез было установлено, что Б. повислая является диплоидом, береза пушистая — тетраплоидом, Б. повислая х Б. пушистая — триплоидом. В то же время в ряде случаев, среди переходных морфотипов берез выявляют также диплоидные и тетрапло-идные формы, что может быть связано как с различными аномалиями, возникающими при гаметогенезе у исходных родительских особей, так и с наличием генного потока между видами за счет частичного восстановления фертильности у триплоидных гибридов.
В ходе проведенного анализа были изучены микросателлитные спектры образцов берез с различным таксономическим статусом:
Береза повислая. Электрофоретический спектр диплоидных образцов березы повислой был представлен одним или двумя пиками. В случае наличия одного пика проведение анализа плоидности не представлялось возможным, а его генотип обозначался как гомозиготный по данному локусу. Типичный спектр гомозиготного образца представлен на рис. 1 (образец 40-118-9).
В случае гетерозиготных образцов оба пика имели сравнительно одинаковую величину, указывая на равноценность генетического вклада отцовского и материнского деревьев при формировании генотипов потомства. Типичные спектры гетерозиготных образцов березы повислой показаны на рис. 1 (образцы ЦГ136 и ИЛАН19). В то же время в ряде случаев разница в интенсивности сигнала аллелей для некоторых образцов могла достигать 25-30%, что может быть связано как с вариацией коэффициента амплификации для аллельных вариан-
Рис. 1. Микросателлитные спектры березы повислой (диплоидная ткань) — образец 40-118-9, генотип L2.2133/133, 2 — образец ЦГ136, генотип L2.2131/138, 3 — образец ИЛАН19,
генотип L2.2131/135
тов с различной первичной структурой (рис. 1, образец ИЛАН19), так и с миксоплоидным характером исследуемых тканей (одновременное наличие клеток с нормальным и гетероплоид-ным набором хромосом).
Береза пушистая. В ходе анализа образцов с различных деревьев березы пушистой по используемому набору ДНК-маркеров были получены четыре основные варианта электро-форетических спектров, содержащих один, два, три и четыре пика ампликонов. При этом следует отметить, что двуаллельные варианты были отмечены в единичных случаях. Микро-сателлитные спектры березы пушистой изображены на рис. 2.
Межвидовые гибриды березы повислой и березы пушистой. Микросателлитные профили индивидов гибридного происхождения были представлены тремя основными вариантами: одно-, двух- и трехфракционными спектрами. Электрофореграммы локусов, находящихся в гомозиготном состоянии (рис. 3, образец М1), для проведения оценки таксономического статуса были неинформативны и идентичны результатам, получаемым как для березы повислой, так и для березы пушистой. Наибольшей презентативностью характеризовались генотипы, представленные альтернативными аллельными вариантами
(рис. 3, образец ИЛАН30), что на фореграм-мах выражалось в виде наличия трех относительно равных по высоте пиков, указывая на триплоидность данных образцов. Однако следует отметить, что среди проанализированных образцов такие варианты генотипов (как в разрезе локусов, так и индивидов) не выявлялись в доминирующем количестве. В случае двухфракционных спектров один из пиков, как правило, в 1,8-2,3 раза превосходил по высоте альтернативный вариант, что связано с двойной дозой содержания данного аллеля в генотипе.
В целом установление гибридного статуса образцов было основано на учете максимального количества выявляемых аллельных вариантов по совокупности анализа семи исследованных локусов. Наличие не более двух вариантов аллелей в локусе одновременно (х, у) соответствовало березе повислой, четырех (х, у, z, q) — березе пушистой, трех аллелей (х, у, z) — межвидовым гибридам. Дополнительным подтверждением таксономического статуса являлась количественная оценка соотношения высоты пиков в различных типах микросателлитных спектров, описание которых было представлено выше. Результаты ге-нотипирования образцов серии ИЛАН представлены в таблице.
Рис. 2. Микросателлитные спектры березы пушистой (тетраплоидная ткань) 1 — образец М2, генотип L2.2128/128/128/128, 2 — образец К17, генотип L2.2132/132/134/134, 3 — образец К4, генотип L2.2130/130/132/133, 4 — образец К2, генотип L2.2128/132/134/136
Рис. 3. Микросателлитные спектры межвидовых гибридов березы повислой и березы пушистой (триплоидная ткань) 1 — образец М1, генотип L2.2133/133/133, 2 — образец ЕГ17, генотип L2.2129/134/134, 3 — образец ИЛАН30,
генотип L2.2130/132/134
Таблица
Данные о количестве аллельных вариантов, выявляемых в генотипах SSR-локусов образцов берез, и соответствующий им таксономический статус
Образец L2.2 L5.4 L7.8 L3.1 L7.3 L022 L1.10 Таксономический статус
1 1 2 2 2 1 1 2 Б. повислая
16 2 2 1 2 2 2 1 Б. повислая
17 4 4 3 4 3 4 1 Б. пушистая
30 3 2 3 3 1 3 2 Б. повислая х Б.пушистая
31 4 4 4 4 2 3 4 Б. пушистая
42 2 3 3 3 1 2 3 Б. повислая х Б.пушистая
Спектр выявляемого аллельного разнообразия может также указывать на гибридный характер исследуемых растений. Несмотря на то, что в перекрывающихся частях ареала березы повислой и березы пушистой перечень выявляемых аллельных вариантов и их представленность в популяциях были в целом относительно сходными (рис. 4), ряд алломорфов с частотой встречаемости <10% был специфичен по отношению только к одному из видов. Исходя из этого выявление у отдельных растений березы повислой аллелей, специфичных для березы пушистой, по всей видимости, служит свидетельством генного потока посредством формирования различного типа промежуточных гибридных форм. В то же время наличие явления «гомоплазии» у SSR-локусов, т. е. разнотипность происхождения сходных по размеру и обозначению аллельных вариантов, делает данный подход к оценке гибридогенности не абсолютным с точки зрения его объективности и диагностической точности. Использование менее полиморфных маркеров, например, кодирующих или неповторяющихся последовательностей, с данной точки зрения, является более достоверным критерием при установлении характера происхождения особей. Это связано с тем, что генетическая структура популяций, при использовании умеренно полиморфных маркеров, как правило, характеризуется наличием одного доминирующего по частоте встречаемости аллельного варианта, одного-двух альтернативных вариантов и, в ряде случаев, дополнительных одного-двух редких алло-
морфов. При этом частотные характеристики данных аллельных вариантов применительно к другим систематически близким видам могут отличаться в значительной степени, что является основой для проведения таксономической диагностики на уровне как отдельных индивидов, так и популяций, представляющих различные части видовых ареалов, включая и зоны гибридизации.
Так, например, в ходе секвенирования второго интрона гена, кодирующего фермент алкогольдегидрогеназу, в генотипах ряда образцов березы пушистой, наряду с доминирующим видоспецифическим мотивом — аллель Adhpubescens, была выявлена минорная (с долевым участием порядка 25%) последовательность, соответствующая березе повислой — аллель Adhpendula, что, по всей видимости, указывает на присутствие в геноме данных растений березы пушистой аллельных вариантов (генома) березы повислой, т. е. их гибридное происхождение (рис. 5).
Кроме анализа процессов потока между симпатрическими видами берез, идентификация гибридного потомства имеет важное практическое значение для проведения селекционного отбора хозяйственно-ценных форм деревьев, получаемых в результате внутривидовых скрещиваний. Среди актуальных задач, связанных с селекцией берез, следует отметить развитие направления ранней диагностики в посадочном материале индивидов с аномальной — «узорчатой» текстурой древесины, определяемых в большинстве случаев как карельская береза — Betula pendula Roth var.
\\ШШ\\
Рис. 4. Частота встречаемости основных для Б. повислой аллельных вариантов у Б. пушистой
Рис. 5. Нуклеотидная последовательность фрагмента второго интрона Adh гена растений березы повислой (А)
и березы пушистой (Б)
carelica (Merci.) Hamet-Ahti). Необходимость проведения типирования сеянцев карельской березы связана с наследственными особенностями данной породы — расщеплением признаков узорчатости древесины и типа габитуса в семенном потомстве и, как следствие, формированием смешанных (по хозяйственной ценности) групп индивидов в получаемых партиях сеянцев. Наличие постоянного расщепления признаков в семенном потомстве карельской березы указывает на гетерозиготное («гибридное») состояние селектируемых локусов у растений с «узорчатым» фенотипом, что может служить методологической основой (типирование гетерозиготного состояния генов) ранней диагностики форм карельской березы с помощью методов молекулярно-ге-
нетического маркирования. С данной точки зрения, в качестве наиболее информативных ДНК-маркеров могут выступать локусы только с кодоминантным характером проявления аллельных вариантов (SSR, EST, CAP и др), что дает возможность проводить идентификацию гомозиготных и гетерозиготных генотипов.
Так, значимые результаты были получены при анализе генетической структуры форм карельской березы с использованием микро-сателлитных (SSR) маркеров. Установлено, что наибольшее количество гетерозиготных генотипов (70-72%) приходилось на «узорчатые» растения, отнесенные к высокоствольным и низкоствольным формам, включая, в особенности, и переходные между ними типы габитуса (маркер L2.2.). Наименьшее
Рис. 6. Распределение значений показателей наблюдаемой гетерозиготности среди форм карельской березы
по локусу L2.2
БУ — безузорчатая (полнодревесная) форма, УВ — узорчатая высокоствольная, УК — узорчатая короткоствольная, УКВ — узорчатая кустовидная
число гетерозигот (45-50%) было выявлено в крайних по габитусу формах — безузорчатой (полнодревесной) и узорчатой кустовид-ной (рис. 6). Следует отметить, что показатели ожидаемой гетерозиготности среди всех форм имели сходные значения — 71-79%.
Отсутствие 100% наблюдаемой гетерози-готности по данному локусу у высокоствольной, короткоствольной и переходной между ними форм может быть объяснено удаленным расположением (и, соответственно, наличием рекомбинации) в хромосоме микросателлит-ного маркера от генов, детерминирующих га-битуальные признаки, а также их полигенным наследованием анализируемого признака.
Анализ степени генетической дифференциации среди форм карельской березы выявил наличие градиентного ряда в соответствии с изменением габитуса — от полнодревесных форм к кустарникам: безузорчатая (полнодревесная) форма ^ узорчатая высокоствольная форма ^ узорчатая короткоствольная форма
^ узорчатая кустовидная форма (рис. 7), что также можно использовать в качестве диагностического критерия при проведении селекционных мероприятий.
Гибридный характер генотипов может выступать не только в качестве критерия определяющего формирование морфолого-анатоми-ческих аномалий, но и являться отражением общего уровня фенотипического разнообразия, включая степень адаптационного потенциала вида. Экологическая пластичность фенотипи-ческих признаков в последнее время рассматривается в качестве одного из актуальных направлений в лесной селекции, что связано как с оценкой влияния отдельных абиотических факторов на степень реализации генетической информации индивидов, так и с изучением адаптационного потенциала растений в условиях изменяющегося климата, интенсификации процессов природопользования, увеличения числа инвазивных видов патогенов и вредителей. Проведенный анализ полусибсового потомства
Рис. 7. Схематическое изображение структуры дендрограммы, иллюстрирующей степень генетической дифференциации среди форм березы карельской по данным SSR-анализа БУ — безузорчатая (полнодревесная) форма, УВ — узорчатая высокоствольная, УК — узорчатая короткоствольная, УКВ — узорчатая кустовидная
Рис. 8. Распределение значений параметра наблюдаемой гетерозиготности среди групп семей березы повислой, различающихся уровнем пластичности по локусам L5.4 и L2.2 0 — отсутствие пластичности, 1 — пластичность по 1 признаку, 2 — пластичность по 2 признакам,
3— пластичность по 3 признакам
березы повислой показал, что по ряду локусов (рис. 8) выявлено соответствие увеличения значений параметра наблюдаемой гетерозигот-ности с увеличением степени экологической пластичности полусибсовых семей.
В ходе детального изучения генетической структуры потомства было установлено, что увеличение общего уровня наблюдаемой ге-терозиоготности обусловлено как более высокими показателями генотипического полиморфизма исходных материнских особей и пыльцевого пула, так и возрастанием параметра генетической дифференциации между генотипами материнских деревьев и «метаге-нотипом» пыльцевого пула.
Заключение
Проведенный анализ ЗБЯ-спектров деревьев в насаждениях, сформированных с участием березы повислой и березы пушистой, показал наличие трех основных вариантов генотипов, содержащих одновременно два (Б. повислая), четыре (Б. пушистая) и три (Б. повислая х Б. пушистая) аллеля в каждом локусе. При этом оценка таксономического статуса производилась на основании совокупных результатов анализа нескольких ядерных ББК-локусов, что в значительном числе случаев было связано с одновременным наличием одинаковых аллель-
ных вариантов в генотипе, затрудняющих достоверную интерпретацию полученных молеку-лярно-генетических данных. Альтернативным способом диагностики межвидовых гибридов Б. повислой и Б. пушистой в зоне их совместного произрастания является учет гетерозиготных (по видоспецифичным аллелям) генотипов при анализе «генов домашнего хозяйства» и, в частности, алкогольдегидрогеназы. Данные подход является эффективным и в случае диагностики результатов попарного скрещивания Б. пушистой, Б. приземистой и Б. карликовой.
Наиболее информативным способом идентификации гибридных особей на внутривидовом уровне является использование в качестве генетических маркеров высоковариабельных локусов, например, микросателлитных последовательностей, что связано с высокой вероятностью выявления в выборке гетерозиготных генотипов. Данный подход является наиболее востребованным при проведении направленных скрещиваний в ходе реализации различных селекционных мероприятий. Так, проведенное изучение коллекционных культур карельской березы выявило закономерности формирования типа габитуса и признака узорчатости древесины от степени гетерозиготности и частоты встречаемости основных аллельных вариантов по ряду ББК-локусов. Перспективным направ-
лением, с точки зрения молекулярно-генетиче-ской диагностики, является изучение явления экологической пластичности фенотипических признаков, что позволит разработать ряд новых стратегических направлений в плюсовой селекции лесных древесных пород.
Список использованных источников
1. Инге-Вечтомов, С.Г. Генетика с основами селекции: Учеб. для биол. спец. унтов / С.Г. Инге-Вечтомов. — М.: Высш. шк., 1989. — 591 с.
2. Алтухов, Ю. П. Генетические процессы в популяциях / Ю. П. Алтухов. — М.: Наука, 1989. — 328 с.
3. Марков, М.В. Популяционная биология растений / М.В. Марков. — М.: КМК, 2012 г. — 387 с.
4. Санников, С.Н. Очерки по теории лесной популяционной биологии / С.Н. Санников, Н.С. Санникова, И.В. Петрова. — Екатеринбург: РИО Уро РАН, 2012. — 270 с.
5. Гроздова, Н.Б. Береза / Н.Б. Гроздова. — М.: Лесная промышленность, 1979. — 81 с.
6. Падутов, В.Е. Методы молекулярно-генетического анализа / В.Е. Падутов, О.Ю. Баранов, Е.В. Воропаев. — Мн.: Юнипол, 2007. — 176 с.
7. Gurcan, K, Mehlenbacher, S.A. Transferability of microsatellite markers in the Betula-ceae / K. Gurcan, S.A. Mehlenbacher // Journal of the American Society for Horticultural Science. — 2010. — Vol. 135, № 2— P. 159-173.
8. Phylogenetic relationships of Betula species (Betulaceae) based on nuclear ADH and chloroplast matK sequences Jarvinen, Pia [et al.]. — 2004. — Vol. 91, № 11. — P. 18341845.
9. Basic local alignment search tool (BLAST NCBI) [Электронный ресурс]. — Режим доступа: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi. — Дата доступа: 21.01.2019.
10. 10. Маслов, А.А., Баранов, О.Ю., Сирин, А.А. Идентификация видов берез в заболоченных лесах Центра Русской равнины по результатам молекулярно-генетического анализа // Лесоведение. — 2019. — № 3. — С.177-187
P.S. Kiryanov1, O.Yu. Baranov1, A.A. Maslov2, A.V. Padutov1
MOLECULAR-GENETIC APPROACHES TO THE IDENTIFICATION OF INTER- AND INTRASPECIES BIRCH HYBRIDS OF THE EASTERN
EUROPEAN REGION
forest Research Institute of NASB Gomel, 246001, the Republic of Belarus 2Institute of Forestry, RAS Uspenskoye, 143030, Russia
The Article presents the results of molecular-genetic studies of Betula (birch) individuals characterized by different taxonomic status. Approaches to the identification of inter- and intraspecies hybrids based on the use of SSR and EST markers are considered. It has been shown that the most informative method for the identification of interspecies silver and downy birch hybrids (B. pendula x pubescens) is to estimate the SSR spectra of heterozygous plants. The features of genetic polymorphism parameters among breeding forms of silver birch (B. pendula Roth.) and curly birch (B. pendula Roth. var. carelica Mercl.) are presented.
Key words: DNA markers, EST and SSR loci, heterozygosity, birch.
Дата поступления статьи: 24 января 2019 г.
