CC BY
102
A.M., Holmgren J. // Curr. Microbiol. - 1978. - Vol. 1. - P. 1923. - 12. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979. - Vol. 76, N 3. - P. 4350-4353.
S.P.Zadnova, O.A.Volokh, I.M.Krepostnova, E.Yu.Shchelkanova, L.F.Livanova, T.L.Zakharova, I.A.Shepelev, C.A.Yereomin, N.I.Smirnova
Studying the Main Pathogenicity and Immunogenicity Factors Production by Different Vibrio cholerae Strains While Cultured under the Production Conditions
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov Small-volume cultivation of previously constructed V. cholerae strains O1 (classical and eltor biovariants ), O139, and non-O1 / non O139
was undertaken under the productional conditions in order to obtain purified preparations of the main factors of pathogenicity and immunogenicity, i.e., I and II types of cholera toxins, B subunit of type II cholera toxin, toxin-coregulated adhesion pili, as well as O1 and O139 antigens. Protection anti-gens-overproducing strains preferable for the production were chosen as a result of this procedure, and optimal conditions for their cultivation were determined facilitating active expression of the proteins and lipopolysaccha-rides that should be used as a base for the development of a multi-component diagnostic test system.
Key words: V. cholerae overproducing strains, protective antigens, small-volume cultivation.
Поступила 28.12.06.
УДК 616.981.452:575.191(7/8)
Л.М.Куклева, Г.А.Ерошенко, Н.Ю.Шавина, А.И.Павлова, В.В.Кутырев
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА АМЕРИКАНСКОМ КОНТИНЕНТЕ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Изучены молекулярно-генетические особенности штаммов, выделенных на территории Северной и Южной Америки. Установлено, что они несут делецию размером 93 п.н. в гене глицерофосфатдегидрогеназы (glpD), что является «генетической меткой» восточного биовара чумного микроба. По данным ПЦР (ERIC) типирова-ния, большая часть изученных американских изолятов близка штаммам восточного биовара. Показано значительное разнообразие плазмидного состава изученных штаммов.
Ключевые слова: Yersinia pestis, американские штаммы, ферментация глицерина, плазмидный состав, ПЦР-типирование.
По мнению американских ученых чума была ввезена в США в 1900 г. в районе порта Сан-Франциско зараженными крысами и блохами на кораблях во время последней пандемии чумы, начавшейся в Юго-Восточной Азии и вызванной восточным биоваром Yersinia pestis. В течение последующих 25 лет вспышки чумы произошли и в других портах США, в том числе в городах вдоль побережья Мексиканского залива. Благоприятные экологические условия способствовали распространению чумы вглубь страны [3]. В восточных регионах США из-за разницы в природных условиях, в том числе и из-за отличий в видовом составе грызунов и паразитирующих на них блох укоренения чумы и формирования постоянно действующих очагов не произошло [3].
По мнению других, в том числе и отечественных исследователей, чума на территории Северной Америки носит эндемичный характер, а природные очаги могли сформироваться на этом континенте в древности [1, 2]. В пользу этой гипотезы свидетельствует общность биоценотической структуры природных очагов чумы, расположенных в ландшафтах сухих степей, полупустынь, пустынь США и России (СНГ). Для решения вопроса о происхождении чумы в Северной Америке необходимо изучение генетических особенностей изолятов Y. pestis, циркулирующих в этих очагах, и их сравнение со штаммами из Центральной и Юго-Восточной Азии, Африки и других регионов мира.
Данные о генетических особенностях северо-
американских штаммов в литературе очень ограничены [4]. Практически отсутствует также информация о генетических особенностях штаммов Y. pestis, выделяемых на территории Южной Америки и их филогенетических связях с изолятами из Северной Америки. Выявление молекулярных особенностей американских штаммов позволит определить их происхождение и в целом приблизить нас к пониманию общих закономерностей распространения и эволюции вида Y. pestis.
В связи с этим целью нашей работы было сравнительное изучение молекулярно-генетических особенностей штаммов, выделенных на Американском континенте.
Материалы и методы
Изученные в этой работе штаммы Y. pestis получены из ГКПБ «Микроб» (таблица). Изучение таксономически значимых признаков (редукция нитратов, ферментация арабинозы и глицерина) проводили, как это было описано ранее [5, 7]. ПЦР типирование штаммов осуществляли в ERIC ПЦР с праймерами на повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности энтеробактерий [6].
Результаты и обсуждение
В работе изучены штаммы Y. pestis, выделенные на Американском континенте, а также штаммы из других регионов мира, в том числе России и сопредельных государств (таблица). У изученных штаммов исследовали признаки, важные в таксоно-
Штаммы Y. pestis
| Штамм, биовар, подвид | Место и объект выделения |
С621 , основной подвид Россия, Центрально-Кавказский очаг, блохи гнезда горного суслика
65/23, восточный биовар Вьетнам, г. Нячанг
231 (14), средневековый биовар Монголия, от человека
Kenya 102, античный биовар Кения
EV Мадагаскар, от человека
М23 США, Калифорния
Hawai США, Г авайские острова
А-1122 США, производный штамма, выделенного от калифорнийского суслика
14 Argentina Аргентина
Sonche Бразилия
Exu 21 Сев.-вост. Бразилия, от крысы
Exu 33 Сев.-вост. Бразилия, от камышового хомячка
мическом отношении - способность редуцировать нитраты, ферментировать арабинозу и глицерин, а также их генетическая детерминированность (гены парА, агаА и glpD). Проявление этих свойств лежит в основе современной схемы внутривидовой классификации У. рвъиъ и делении основного подвида на три биовара - античный, средневековый и восточный. Восточный биовар У. рвъиъ редуцирует нитраты и ферментирует арабинозу, но в отличие от античного и средневекового биоваров не способен ферментировать глицерин. Отсутствие ферментации глицерина у штаммов восточного биовара связано с наличием делеции в 93 п.н. в структурном гене гли-церофосфатдегидрогеназы glpD [5]. У штаммов античного и средневекового биоваров glpD не нарушен, и они сохраняют способность утилизировать глицерин.
Проведенное нами исследование свойств американских штаммов по таксономически значимым признакам показало, что все они содержат структурные гены парА и агаА, кодирующие нитратре-дуктазу и регулятор арабинозного оперона, и, следовательно, редуцируют нитраты и ферментируют арабинозу. Способность американских штаммов к редукции нитратов отличает их от штаммов средневекового и античного биоваров, тогда как ферментация арабинозы является признаком, общим для
всех трех биоваров возбудителя чумы. В то же время изучение третьего таксономического признака -ферментации глицерина показало, что как североамериканские, так и южноамериканские штаммы не ферментируют глицерин и несут в структурном гене glpD делецию в 93 п.н., характерную для восточного биовара (рис. 1). Поскольку эта делеция является надежной «генетической меткой» восточного био-вара и присутствует у всех изученных нами американских штаммов, не возникает сомнения в том, что исследованные изоляты, выделенные в Северной и Южной Америке, относятся к восточному биовару.
С помощью праймеров на повторяющиеся меж-генные последовательности энтеробактерий (ERIC) проведено ПЦР типирование штаммов Y. pestis (рис. 2). Из всех изученных американских штаммов идентичные ПЦР-профили имели штаммы, выделенные в Бразилии - Exu 21 и Exu 33, которые были очень близки штамму 65/23 восточного биовара из Вьетнама. ПЦР-профили штаммов М-23 и 193 Ha-wai из США были идентичны между собой и близки штаммам Exu 21, Exu 33 и 65/23, но все же отлича-
Рис. 1. ПЦР-анализ гена glpD у штаммов Y. pestis:
1 - Kenya 102 (античный б/в); 2 - 65/23 (восточный б/в);
3 - 231 (14) (средневековый б/в); американские штаммы (4 - Exu 33, 5 - A-1l22, 6 - 193 Hawai, 7 - 14 Аргентина, 8 - Exu 21, 9 - М23, 10 - Sonche); 11 - С621 (основной п/вид)
Рис. 2. ПЦР (ERIC) типирование штаммов Y. pestis:
американские штаммы (1 - Exu21, 2 - Exu 33, 3 - 14 Аргентина, 4 - М-23, 5 - A-1122, 6 - Sonche, 7 - 193 Hawai);
8 - Kenya 102 (античный б/в), 9 - 231 (14) (средневековый б/в), 10 - 65/23 (восточный б/в), 11 - С621 (основной п/вид)
123456789
pFra (ЮОт.п.м.) pCad (70Т-П-К)
pPet(10T.n.H.)
Рис. 3. Анализ плазмидного состава штаммов Y.pestis:
1 и 9 - EV; американские штаммы (2 - М23, 3 - Exu 33, 4 - Exu 21,
J - 14 Аргентина, 6 - 193 Hawai, 7 - Sonche, 8 - A-1122)
лись от них (рис. 2). Уникальные ПЦР-фингерприн-ты имели штаммы 14 Аргентина, A-1122 и Sonche, которые отличались от других американских штаммов, а также от изолятов античного и средневекового биоваров (рис. 2). Таким образом, по данным ПЦР (ERIC) типирования, большая часть американских штаммов близка штамму восточного биовара 65/23, выделенному в Юго-Восточной Азии. В то же время наличие среди американских изолятов штаммов с отличающимися ПЦР-фингерпринтами -14 Argentina (Аргентина), А-1122 (США) и Sonche (Бразилия) позволяют высказать предположение о том, что эти штаммы представляют различные филогенетические линии Y. pestis восточного биовара.
У американских штаммов Y. pestis нами также изучен плазмидный состав, который характеризовался значительным разнообразием (рис. 3). Бразильские штаммы Exu21 и Sonce имели типичный набор плазмид - pFra, pCad и pPst характерного размера, совпадающих с референтным штаммом EV. Третий бразильский штамм Exu 33 содержал pCad, pPst и был лишен плазмиды pFra. Штамм 23 (США) имел лишь плазмиду пестициногенности pPst, а штамм 14, выделенный в Аргентине, содержал лишь родоспецифическую плазмиду pCad. Штамм А-1122 (США) был также моноплазмидным, несущим только плазмиду pFra. Штамм 193 (Hawai) имел типичный плазмидный состав, но плазмида pPst отличалась сниженной молекулярной массой. Значительное разнообразие плазмидного состава американских штаммов может быть вызвано либо тем, что в различные регионы Америки попали и укоренились различные штаммы восточного биова-
ра, либо изменением генома штаммов в процессе их интродукции.
Полученные данные свидетельствуют о том, что все изученные американские штаммы относятся к восточному биовару (делеция в 93 п.н. в гене glpD и данные ERIC типирования). Однако наличие различных профилей ПЦР-типирования и вариабельность плазмидного состава изученных американских штаммов позволяют сделать предположение о том, что они могли быть завезены на Американский континент из различных очагов чумы. Небольшое количество имеющихся в нашем распоряжении штаммов, выделенных на Американском континенте, не позволяют сделать однозначного вывода о происхождении штаммов, циркулирующих в природных очагах Северной и Южной Америки, однако полученные результаты свидетельствуют в пользу предположения, что чума была занесена туда на кораблях крысами (восточный биовар), после чего она укоренилась в различных сообществах грызунов и их переносчиков.
Работа поддержана грантом РФФИ ОФИ № 0б-04-08152.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
І. Козакевич В.П., Варшавский С.Н., Лавровский А.А. // Пробл. особо опасных инф. - 1970. - Вып. 4 (14). - С. б3-71. - 2. Козакевич В.П., Варшавский С.Н., Лавровский А.А. // Пробл. особо опасных инф. - 1970. -Вып. б (1б). - С. 110-119. - 3. Gage K.L., Townsend Peterson A., Enscore R.E. et al. II 9 th International Symposium on Yersinia. - Lexington, Kentucky, October 10-14, 200б. - P. 20. -4. Huang X.Z., Chu M.C., Engelthaler D.M. et al. II J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40. - P. 11б4-1173. - 5. Motin V., Georgescu A., Elliott J. et al. II J. Bacteriol. - 2002. -Vol. 184, N 4. - P. 1019-1027. - б. Rivera G.I., Chowdhury M. A . R. , Huq A . et al. II Appl. Environ. Microbiol. - Vol. б1. -P. 2898-2904. - 7. Zhou D., Tong Z., Song Y. et al. II J. Bacteriol. - 2004. - Vol. 18б, N 15. - P. 5147-5152.
L.M.Koukleva, G.A.Yeroshenko, N.Yu.Shavina, A.I.Pavlova, V.V.Kutyrev
Molecular and Genetic Peculiarities of Yersinia pestis Strains Isolated in the American Continent
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
Studied were molecular and genetic peculiarities of the strains, isolated in the territory of the North and South America. It was elucidated that they carry the 93 b.p. deletion in the glycerolphosphate-dehydrogenase gene (glpD), the latter being "the genetic sign" of Yersinia pestis Eastern biovar. PCR-typing (ERIC) showed the greater number of American isolates studied to be similar to the Eastern biovar strains. Demonstrated was the essential variability of the studied strains plasmid content.
Key words: Yersinia pestis, American strains, glycerol fermentation, plasmid content, PCR-typing.
Поступила 5.02.07.
