CC BY
12DOI: 10.24412/2226-079X-2022-12426
Молекулярно-генетические особенности клеток мозговых органоидов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток больных спиноцеребеллярной атаксией 17-го типа
A.Н. Богомазова1, А.В. Давиденко1, 2, Л.Д. Беликова1, 2, К.С. Ануфриева1,
B.А. Вигонт3, К.А. Кутукова4, Н.М. Муджири4, А.М. Емелин5, Р.В. Деев5, В.С. Усатова6, О.С. Лебедева1, С.Н. Иллариошкин4, М.А. Лагарькова1
1 ФГБУ "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины" ФМБА России (Москва) 2 ФГБОУВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова" 3 ФГБУН "Институт цитологии"РАН (Санкт-Петербург) 4 ФГБНУ "Научный центр неврологии"(Москва) 5 ФГБОУВО " Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова"Минздрава России (Санкт-Петербург) 6 ФГБУ " Федеральный центр мозга и нейротехнологий" ФМБА России (Москва)
Введение
В настоящее время нейродегенеративные заболевания остаются одной из актуальных проблем медицины во всем мире. Несмотря на значительный прогресс в понимании механизмов их возникновения и развития, для многих из этих патологий до сих пор не существует эффективного лечения. Некоторые нейродегенеративные заболевания являются наследственными. В частности, к ним относятся полиглутаминовые болезни, при которых в последовательности некоторых генов аномально увеличена длина повтора из триплетов CAG, кодирующего полиглутами-новый тракт в белке. Это некоторые спиноцере-беллярные атаксии ^СА), болезнь Гентингтона, дентаторубропаллидолюисова атрофия, спи-нально-бульбарная мышечная атрофия. К поли-глутаминовым заболеваниям относится и SCA 17-го типа ^СА17) - самая редкая из полиглу-таминовых патологий. Она представляет собой весьма интересный объект для исследования ввиду того, что ген ТВР, мутация которого ее вызывает, из всех ассоциированных с полиглута-миновыми патологиями генов изучен наиболее полно. Исследование молекулярных механизмов патогенеза SCA17 может пролить свет на механизм развития других заболеваний этой группы,
а также дать ключ к разработке стратегий лечения [1].
Перспективным инструментом изучения молекулярных механизмов заболеваний центральной нервной системы в настоящее время являются индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные от пациентов с верифицированным диагнозом. Они способны к дифференцировке во все типы клеток, включая нейральные. Кроме того, дифференцирующиеся ИПСК способны к трехмерной самоорганизации с воспроизведением тканевой архитектоники, т.е. их также можно использовать для получения трехмерных структур - органоидов, в том числе мозговых органоидов [2].
В данной работе мы изучали ультраструктурные, функциональные и молекулярно-генетиче-ские особенности клеток мозговых органоидов, полученных из ИПСК от пациентов с диагнозом SCA17.
Результаты и обсуждение
Электронная микроскопия клеток мозговых органоидов, полученных из ИПСК 2 здоровых доноров и 2 линий ИПСК пациента со SCA17, показала, что в органоидах SCA17 в отличие от "здоровых" органоидов выявлены многочислен-
ные электронно-прозрачные вакуоли разной величины, представляющие собой, по-видимому, измененные митохондрии, так как они содержат двойную мембрану и едва заметные оставшиеся кристы.
Ультраструктурное исследование митохондрий в клетках и отростках при SCA17 в сравнении с нормой выявило очевидный полиморфизм с преобладанием патологически измененных ор-ганелл. Основную популяцию составляют мелкие и среднего размера митохондрии округлой и, реже, удлиненной формы с темным, осмиофиль-ным матриксом. Помимо таких митохондрий при SCA17 в клетках и отростках появлялись гигантские митохондрии разнообразной формы. Такие гигантские митохондрии обнаруживались и внутри аутофаголизосом. При морфометрии митохондрий было выявлено, что при SCA17 митохондрии в телах и отростках нейронов оказались достоверно крупнее, чем в контроле. Форма митохондрий в клетках органоидов с SCA17 была более вытянутой.
Таким образом, в клетках при SCA17 содержатся преимущественно митохондрии либо мелкие, темные, с единичными кристами, вероятно, функционально неактивные, либо гигантские и патологически значительно измененные митохондрии. Очевидно, что клетки, практически лишенные морфологически и функционально нормальных митохондрий, должны быть обречены на дегенерацию. Интересно, однако, что апоптотические клетки практически не встречались, что свидетельствует о наличии компенсаторных механизмов, позволяющих клеткам продолжать существование даже при столь тяжелых патологических изменениях митохондрий. По-видимому, патологические изменения митохондрий, заканчивающиеся либо митофагией, либо превращением их в вакуоли, компенсируются постоянным образованием новых митохондрий путем деления, о чем свидетельствует наличие признаков усиленной фрагментации митохондрий: обилие практически во всех клетках мелких митохондрий с темным матриксом и общее численное преобладание таких митохондрий.
Анализ транскриптома мозговых органоидов. Нами был проанализирован транскриптом клеток органоидов, полученных направленной диф-ференцировкой из ИПСК. Мозговые органоиды дифференцировали в течение 1—1,5 мес в ми-
ни-биореакторах [3]. Мозговые органоиды были получены из клеточных линий 2 здоровых пациентов и 2 пациентов с SCA17.
Дифференциально экспрессированными генами признавали гены, отвечающие следующим 2 критериям: значение p-value с порогом отсечения меньше 0,05 и абсолютное значение ^2-кратного изменения экспрессии между группами с порогом отсечения больше 1. Всего выявлено 409 генов, экспрессия которых в органоидах SCA17 была выше по сравнению с контролем, и 531 ген, экспрессия которого была снижена. Анализ обогащения показал, что среди сверхэкспрессированных генов в мозговых органоидах SCA17 достоверно чаще встречаются гены, которые относятся к 2 функциональным путям KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) [4]: пути взаимодействия нейроактив-ных лигандов с рецепторами (hsa04080) и кальциевому сигнальному пути (hsa04020).
При анализе транскриптома особое внимание было уделено генам, кодирующим митохондри-альные белки, а также генам митохондриальной ДНК. Разница между контрольными органоидами и органоидами SCA17 по экспрессии генов, кодирующих митохондриальные белки, была выявлена при анализе обогащения по функциональной принадлежности GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) [5]. Анализ обогащения был выполнен с использованием пакетов msigdbr/Bioconductor и clusterprofiler/Bioconductor на основе списков KEGG и Reactome. В результате анализа GSEA обнаружено, что при использовании наборов генов KEGG первые 4 позиции занимают наборы, связанные с окислительным фосфорилировани-ем и нейродегенеративными протеинопатиями -болезнями Гентингтона, Альцгеймера и Паркин-сона. Эти генные наборы в значительной степени пересекаются по составу, т.е. их попадание на первые позиции в GSEA в основном обеспечено небольшим повышением экспрессии группы генов, кодирующих элементы цепи окислительного фосфорилирования. Некоторые другие наборы получили высокие оценки в GSEA тоже в основном за счет присутствия в них генов, кодирующих белки - элементы цепи окислительного фосфо-рилирования. Помимо генов, связанных с окислительным фосфорилированием, есть и другие связанные с митохондриями группы генов, которые проявились при анализе наборов генов Reactome [6]. Так, установлено достоверное обо-
é № 2 * 2022
19
гащение по наборам, связанным с циклом Кребса, трансляцией в митохондриях, импортом в митохондрии. Это повышение экспрессии является незначительным, поэтому ни один из генов указанных наборов не относится к дифференциально экспрессированным по выбранным критериям.
Если говорить об экспрессии генов, локализованных в митохондриальной ДНК, то наблюдаемые различия связаны не с диагнозом или генотипом, а с индивидуальными образцами. Так, у одного контрольного образца экспрессия генов митохондрий оказалась в целом ниже, чем во всех остальных образцах, а у образца SCA17, наоборот, выше.
Сравнение митохондриального потенциала и митофагии в нейронах, дифференцированных из ИПСК здоровых доноров и пациентов с SCA17. Нами было проведено измерение митохондри-ального потенциала в 2 линиях нейронов, дифференцированных из ИПСК здоровых доноров, и 3 линиях нейронов, дифференцированных из ИПСК 2 пациентов с SCA17. Для измерения ми-тохондриального потенциала за 3 ч до измерения к части клеток добавляли разобщитель цепи окислительного фосфорилирования карбонил-цианианид-м-хлорфенилгидразоном (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone, СССР), эти лунки использовали в качестве контроля ("нулевой потенциал"). За 1 ч до измерения к клеткам добавляли митохондриальные красители MitoTracker Deep Red и TMRM, являющиеся потенциалнезависимым и потенциалзависимым красителями соответственно. Для измерения на проточном цитофлуориметре клетки снимали с подложки, смешивали с ядерным красителем DAPI и измеряли интенсивность флуоресценции всех красителей на проточном цитофлуориметре. Условные значения митохондриального потенциала вычисляли по следующей формуле, используя интенсивности флуоресценции мито-хондриальных красителей (MeanX):
ММР = (TMRM/MtDR) -- (TMRM CCCP/MtDR CCCP).
В результате такого анализа показано, что мито-хондриальный потенциал достоверно повышен в нейронах, дифференцированных из ИПСК пациентов с SCA17.
Заключение
Ультраструктурный анализ с помощью электронной микроскопии выявил множественные аномалии митохондрий в нейрональных клетках мозговых органоидов SCA17. Проточная цитоме-трия с применением потенциалзависимых флуоресцентных красителей митохондрий продемонстрировала, что митохондрии в нейронах SCA17 обладают аномально повышенным потенциалом. Структурные и функциональные нарушения, наблюдаемые в митохондриях нейронов SCA17, сопровождаются небольшим, но достоверным повышением экспрессии группы генов, кодирующих белки митохондрий, в частности тех генов, которые кодируют белки цепи окислительного фосфорилирования. Таким образом, тремя разными методами нами получены свидетельства в пользу гипотезы, что митохондрии нейронов являются одной из основных мишеней патогенетической реализации мутации в гене TBP при SCA17.
Работа выполнена при поддержке РНФ (грант 19-15-00425), секвенирование проведено с использованием оборудования центра коллективного пользования центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГБУ "ФНКЦ ФХМ" ФМБА России.
Список литературы
1. Polyglutamine disorders. Nobrega C, Pereira de Almeida L, eds. Cham, Switzerland: Springer; 2018. 774 c.
2. Eremeev AV et al. Cerebral organoid — challenges to establish a brain prototype. Cells. 2021;10(7):1790.
3. Еремеев А.В. и др. "Голь на выдумки хитра", или дешевый, надежный и воспроизводимый способ получения органоидов. Биохимия. 2019;84(3):448-56.
4. Kanehisa M et al. KEGG for integration and interpretation of large-scale molecular data sets. Nucleic Acids Res. 2012;40(Database issue):D109-14.
5. Shi J, Walker MG. Gene set enrichment analysis (GSEA) for interpreting gene expression profiles. Curr. Bioinform. 2007;2(2):133-7.
6. Jassal B et al. The reactome pathway knowledgebase. Nucleic Acids Res. 2020;48(D1):D498-503.
