CC BY
127
УДК 616.24-002.5-07-085:008
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ
В. Ю. Журавлев, Л. И. Арчакова, О. А. Маничева, Т. И. Виноградова, А. В. Елькин,
Ю. Н. Левашев
Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии, г. Санкт-Петербург
Напряженная эпидемическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации обусловлена несколькими факторами, а именно поздней диагностикой специфического поражения, циркуляцией в популяции штаммов возбудителя с множественной резистентностью к противотуберкулезным препаратам, высокой заболеваемостью лекарственно-резистентными формами, недооценкой наследственной предрасположенности к туберкулезу и, как следствие, низкой эффективностью терапии.
Во фтизиатрии в настоящее время сложилась парадоксальная ситуация, когда для выявления патологического процесса у пациента все чаще используют самые современные лучевые методы, которые подкрепляют активным внедрением высокотехнологичных, малоинвазивных технологий получения диагностического материала, и при этом верификация диагноза туберкулезного поражения директивно основывается на применении методов этиологической диагностики конца XIX — начала XX века. При этом практически не учитываются индивидуальные «генетические» характеристики макроорганизма больного, что в итоге вносит негативный вклад в эффективность химиотерапии туберкулеза и нивелирует возможность раннего прогнозирования исхода заболевания.
Целью нашего исследования была оценка молекулярно-генетических методов в опти-100
мизации этиологической диагностики, химиотерапии туберкулезного процесса и изучении наследственной предрасположенности к туберкулезу органов дыхания.
Материал и методы
Нами изучены возможности использования трехмерных наночипов для экспресс-диагностики генетической характеристики лекарственной устойчивости у 483 больных туберкулезом. ДНК из клинического материала (мокрота, промывные воды бронхов) выделяли с использованием коммерческого набора проба-НК фирмы «ДНК-технология» (Москва, Россия) согласно рекомендациям производителя. Биологический микрочип «ТБ-БИОЧИП» (биочип), разработанный в Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН), позволяет одновременно определять ДНК (МБТ) Mycobacterium tuberculosis и идентифицировать мутации, ответственные за чувствительность возбудителя туберкулеза к изониазиду и рифампицину за максимально короткое время (24 ч). Тест-система «ТБ-БИОЧИП» зарегистрирована в Министерстве здравоохранения и социального развития в 2004 году (Регистрационное удостоверение № ФС 03262004/0889-04). Метод включает двух-этапную мультиплексную амплификацию генов, мутации в которых приводят к возникновению устойчивости, с включением флуо-
ресцентной метки. Полученные меченые ампликоны гибридизуют с иммобилизиро-ванными на микрочипе олигонуклеотидны-ми зондами в течение 6 часов. Дискриминирующие олигонуклеотиды, размещенные на биочипе (см. рис.), способны обнаруживать мутации в генах rpoB (для рифампицин-ре-зистентных штаммов), katG, inhA и межрегу-ляторной области генов ahpC-oxyR (для изо-ниазид-резистентных штаммов). Результаты гибридизации регистрируют на портативном анализаторе биочипов с соответствующим программным обеспечением «Биочип-ИМБ» (Россия).
Рис. Схема размещения дискриминирующих олигонуклеотидов для одновременного обнаружения возбудителя туберкулеза и выявления мутаций, приводящих к устойчивости к рифампицину и изониазиду. ТБ-БИОЧИП (МДР)
Проведено молекулярное генотипирова-ние аллелей локуса HLA — DRB1* с целью изучения наследственной предрасположенности к туберкулезу органов дыхания у 114 больных методом полимеразно-цепной реакции (PCR-SSP) с использованием панели отечественных праймеров фирмы «ДНК-технология» (Москва, Россия). Сравнительный анализ локуса HLA-DRB1* был осуществлен у 434 здоровых людей, при этом у 88 проведено одномоментное изучение аллельных вариантов гена HLA-DQВ1*. Больные туберкулезом легких, так же, как и здоровые люди, бы-
ли славянской национальности, проживали в северо-западном регионе России.
Результаты подвергнуты обработке с помощью непараметрического критерия %2 с поправкой Йетса. Показатель относительного риска развития заболевания (RR) определяли методом Вульфа. Показатель RR выше 1 принимали за значимый, если RR был меньше 0,5 — ассоциацию расценивали как достоверно отрицательную.
Результаты и их обсуждение
Наиболее опасными в клиническом и эпидемиологическом плане являются штаммы МБТ с множественной лекарственной устойчивостью, характеризуемые одновременным наличием лекарственной устойчивости к наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам первого ряда — рифам-пицину и изониазиду.
Мишенью рифампицина (R) является РНК-полимераза. В присутствии рифампицина РНК-полимераза не в состоянии удлинять дочернюю цепочку РНК после присоединения нескольких первых рибонуклеотидов. Таким образом, синтезируются только очень короткие олигомеры. Мутации, вызывающие устойчивость к рифампицину, расположены в гене rpoB [9]. Несмотря на довольно значительный размер белка — 1172 аминокислоты,— у M. tuberculosis почти все мутации происходят в сегменте гена rpoB, состоящем из 81 основания и кодирующем аминокислоты 507—533.
Мутации в гене rpoB определены в 323 (67%) случаях. При этом чаще всего определяли замену в кодоне 531 у 164 (50,8%), в том числе Ser531-Leu — у 136 (42,3%) пациентов. Данная мутация наиболее распространена среди устойчивых к R штаммов в мире и чаще всего связана с генотипом Beijing [5].
Другие вариации мутаций в этом кодоне встречались значительно реже (p<0,05):
Ser531-Cys (5), Ser531-Gln (14), Ser531-Trp (9). На второй позиции — замена в кодоне: 526 (43), 533 (41), 513 (24), 516 (21), 512 (19) и 511 (11). Мутации в кодонах 531, 526 и 513 обеспечивают высокий уровень (более 50—64 мкг/мл), а в кодонах 516 и 533 — средний и низкий уровни резистентности к ри-фампицину и его производным in vitro.
Изониазид попадает в бактерию в качестве про-лекарства, которое не действует, пока его не окислит katG, бифункциональная ка-талаза/пероксидаза. Любая мутация, нарушающая способность katG окислять изониазид, приводит к устойчивости к изониазиду. Лекарственная устойчивость к Н, обусловленная мутациями в гене katG, выявлена в 250 (51,7%) случаях. Преобладала замена в 315 кодоне: в изолированном варианте — у 107 (42,8%), или в сочетании с заменой в кодоне 328 — у 17 (6,8%), или в сочетании с заменой в 335 кодоне — у 4 (1,6%) больных. Однако потеря активности katG не проходит для бактерии даром; штаммы, не обладающие активностью каталазы/пероксидазы, менее вирулентны [11], и для бактерии выгодно вносить небольшие изменения, «точечные» мутации, которые бы приводили к возникновению устойчивости к изониазиду, но при этом не сопровождались бы потерей активности фермента. Именно это и наблюдается при мутации Ser315-Thr [10]. Замена katG315AGC-ACC (Ser-Thr) была отмечена у 92 (36,8%) больных.
Преобладание штаммов с сочетанием мутаций rpoB531 и katG315 еще раз подтверждает поддержание резервуара резистентных и мультирезистентных штаммов генотипа Beijing на территории северо-запада России в условиях широкого применения R и H [5].
Изониазид ингибирует синтез миколо-вых кислот. Белок inhA участвует в синтезе миколовых кислот и придает устойчивость к изониазиду при мутациях или повышенной 102
экспрессии [7]. В гене inhA были обнаружены замены нуклеотидов у 84 (17,4%) больных. Мутации в inhA также придают устойчивость к этионамиду. Ген inhA является мишенью препарата триклозана, часто используемого местного противомикробного средства. Возможно, в быстроте развития лекарственной устойчивости к изониазиду играет роль широкое использование данного вещества в быту и формирование ассоциированных мутаций.
В гене ahpC выявлено наименьшее количество мутаций — 26 (5,4%), и идентифицированы в положении -6 и -10 относительно сайта инициации транскрипции. Ген ahpC кодирует алкилгидропероксидазу и отвечает за дополнительную защиту микробной клетки от пероксидов. Следует отметить, что среди исследуемых штаммов МБТ выявлено только 9 (1,8%), имеющих мутации во всех изучаемых генах. В 3 генах мутации имели 77 (15,9%) штаммов, в 2 генах — 203 (42%); штаммов с мутациями в одном гене было 91 (18,8 %); штаммов без выявленных мутаций выявлено только 103 (21,3%).
Технологический подход на основе определения мутаций, ответственных за множественную лекарственную устойчивость, с помощью наночипов при сравнении результатов, полученных в традиционном микробиологическом исследовании на плотных питательных средах, оказался более чувствительным методом. У 75 (15,5%) пациентов были выявлены мутации, не получившие фе-нотипического отображения при посеве на плотные или жидкие питательные среды. Параллельно выполненные исследования на 127 штаммах M. tuberculosis подтвердили ранее полученные результаты при работе с клиническим материалом.
Развитие туберкулеза связано не только с биологическими свойствами микроорганизма, но и зависит от степени напряженности клеточного иммунитета больного и во мно-
гом определяется генетическими факторами [1, 2, 3, 6].
К настоящему времени известно более 4000 моногенных болезней, являющихся следствием мутаций единичного гена, и более 600 хромосомных болезней, обусловленных изменением числа или структуры хромосом, однако доля их неизмеримо мала среди всей патологии у человека в сравнении с мультифакториальными заболеваниями, при которых пожизненный риск (lifetime risk) достаточно высок. Туберкулезную инфекцию можно отнести к этой группе заболеваний. Система HLA генов II класса является наиболее значимым звеном генетического контроля восприимчивости к инфекционным заболеваниям вообще и к туберкулезу в частности, так как в ней расположены гены иммунного ответа, ответственные за распознавание инфекта, кооперацию клеток и дальнейшее развитие иммунного ответа [4, 8].
Определение групп риска по параметрам возникновения и неблагоприятного течения туберкулеза органов дыхания очень важно и связано с идентификацией генов, от которых зависит восприимчивость или резистентность организма человека к туберкулезной инфекции, в частности генов II класса главного комплекса гистосовместимости локусов HLA-DRB1* и HLA-DQB1*.
Для локуса HLA-DRB1* известно 13 типов аллелей, распределение которых изучено у пациентов с туберкулезом легких (n=114) и здоровых доноров (n=434). Анализируя результаты, полученные при проведении исследования, можно констатировать, что 16 аллель достоверно более часто фиксировался у больных туберкулезом органов дыхания (17,5% против 6,9% у здоровых; р<0,05). Относительный риск (RR) заболеть туберкулезом у здоровых лиц — носителей 16 алле-ля равен 2,9.
Для локуса HLA-DQB1* известно 5 типов аллелей. Сопоставление результатов показа-
ло, что у больных туберкулезом легких значительно чаще встречается 05 аллель (42,0%; р<0,05) по сравнению со здоровыми лицами (29,5%), относительный риск (КК) заболеть туберкулезом у здоровых лиц — носителей 05 аллеля равен 3,3. Реже фиксировали 03 аллель (44,7% против 62,5%; р<0,05, КК=0,3).
Таким образом, с наличием в генотипе 16 аллеля ИЬА DКB1* и 05 аллеля ША^В1* связан риск развития туберкулеза органов дыхания (КК=2,9 и КК=3,3). Определена отрицательная ассоциация туберкулезной инфекции с 03 аллелем локуса ИLA-DQВ1* (КК=0,3)
Изучение межлокусных взаимосвязей выявило, что для больных, имеющих в генотипе сочетание 05 аллеля ИLA-DQВ1* и 16 аллеля ИLA-DКB1*, отмечены достоверные различия частот встречаемости сочетания данных маркеров (36,7% против 11,5% у здоровых лиц), при риске развития туберкулеза органов дыхания (КК) равному 4,3.
Анализ клинической картины специфической инфекции показал, что на фоне проводимого комплексного лечения при всех одинаковых клинических условиях и индивидуально подобранной химиотерапии выделялась группа больных (48 из 114) с замедленными темпами конверсии мазка мокроты, улучшения рентгенологической динамики, нередко с прогрессированием туберкулезного процесса и формированием фиброзно-кавернозной формы.
У больных с неблагоприятным развитием заболевания фиксировали увеличение частоты встречаемости сочетания 05 аллеля HLA-DQВ1* и 16 аллеля ША£КВ1* до 48,0% при риске развития неблагоприятной динамики туберкулезной инфекции (КК) равному 6,8, против 25,0% (КК=2,4) у пациентов с благоприятным течением и 11,5% — у здоровых лиц.
Анализ клинической картины больных с наличием 05 аллеля ИLA-DQВ1* в сочетании
с 16 аллелем ИLA-DКB1* установил наиболее неблагоприятный вариант развития заболевания: у 83,3% пациентов сформировался фиброзно-кавернозный туберкулез легких, нередко на фоне лечения отмечалось обострение специфического процесса.
Выводы
Использование инновационных технологий на основе трехмерных наночипов позволяет в очень короткие сроки (до 24 ч) проводить одновременно этиологическую диагностику туберкулезного поражения на основе специальных маркеров, специфичных для микобактерий туберкулезного комплекса, и определять наличие или отсутствие мутаций в генах, ответственных за реализацию резистентности к основным противотуберкулезным препаратам. Данный подход позволяет назначать адекватный режим химиотерапии.
Включение в комплекс первичного обследования пациента диагностики наследственной предрасположенности к развитию туберкулезного процесса позволит на раннем этапе сформировать группы с повышенным риском неблагоприятного исхода специфического поражения, целенаправленно проводить усиленную, индивидуализированную терапию с использованием резервных противотуберкулезных препаратов широкого спектра патогенетического воздействия и возможно раннего использования хирургических методов лечения.
Библиографический список
1. Апт А С. Генетические аспекты выявления групп риска по туберкулезу/А. С. Апт// Проблемы туберкулеза.— 2001.— № 7.— С. 65—68.
2. Еремеев В. В. Взаимодействие макрофаг — микобактерия в процессе реакции микро-
организма на туберкулезную инфекцию/ В. В. Еремеев, К. Б. Майоров//Проблемы туберкулеза.- 2002.- № 3.- С. 54-57.
3. Кондакова М. Н. Аллельный полиморфизм гена HLA-DRB1* у подростков и его роль в выборе режима химиотерапии туберкулеза органов дыхания/М. Н. Кондакова, М. В. Павлова, Л. А. Скворцова// Актуальные вопросы выявления, диагностики и лечения внелегочного туберкулеза: науч. труды Всерос. науч.-практ. конф.- СПб., 2006.- С. 274-277.
4. Маянский Н. А. Номенклатура и функции главного комплекса гистосовместимости человека/Н. А. Маянский, А. Н. Маянский// Иммунология.- 2006.- № 1.- С. 43-46.
5. Нарвская О. В. Характеристика циркулирующих на северо-западе России штаммов Mycobacterium tuberculosis с использованием сполиготипирования/ О. В. Нарвская, И. В. Мокроусов, Е. В. Ли-мещенко и др.//Проблемы туберкулеза.-2002.-№ 4.- С. 44-47.
6. Новицкий В. В. Особенности функциональной активности лимфоцитов крови у больных туберкулезом легких/В. В. Новицкий, А. К. Стрелис, О. И. Уразов и др.// Иммунология. - 2006.- № 2.- С. 76-79.
7. Banerjee A. inhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium tuberculosis/A. Banerjee, E. Dub-nau, A. Quemard et aL//Science.- 1994.— Vol. 263.- P. 8235-8241.
8. Dubaniewicz A. Molecular subtypes of the HLA-DRB1* antigens in pulmonary tuberculosis/A. Dubaniewicz, B. Lewko, G. Moszkowska et al.//lnt. J. Infec. Diseases.- 2000.- Vol. 4.- № 3.- P. 129-133.
9. Jin D. J. Mapping and sequencing of mutations in the Escerichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance/D. J. Jin, C A Gross//J. Mol. Biol.- 1988.- Vol. 202.-P. 45-58.
10. Soolingen van D. Mutation at amini acid position 315 at the katG gene are associated with high-level resistance to isoniazid, other drug resistanse and successful transmission of Mycobacterium tuberculosis in the Netherlands/D. van Soolingen, P. E. W. de Haas, H. van Doorn et al.//J. Infec. Dis— 2000.- Vol. 182.— P. 1788—1790.
11. Wilson T. M. Effect of inhA and katG on isoniazid resistance and virulence of Mycobacterium bovis/T. M. Wilson, G. W. de Lisle//Mol. Microbiol.— 1995.— Vol. 15— P. 1009—1015.
V. Yu. Zhuravlev, L. I. Archakova, O.A. Manicheva, T. I. Vinogradova, A. V. Elkin, Yu. N. Levashev
MOLECULAR GENETIC METHODS IN DIAGNOSIS AND THERAPY
OF PULMONARY TUBERCULOSIS
The opportunity of using three-dimensional nanochips for express diagnosis of drug resistance of M. tuberculosis to isoniazid (in katG, inhA genes, in interregulatory regions of
ahpC-oxyR genes), and rifampicin (rpoB gene) was studied. Hereditary predisposition to tuberculosis of the lungs on the basis of molecular genetic typing of class II genes of the main HLA-DRB1* and HLA-DQB1* loci histocompatibility complex was investigated. Application of molecular genetic technologies permits to identify simultaneously mutations responsible for sensitivity of tuberculosis agent to the basic antituberculous preparations, to form the groups with elevated risk of unfavourable effect of tuberculous lesion, to fulfill intensive individualized therapy and to raise efficiency of treatment.
Keywords: tuberculosis, diagnosis, nano-chips, resistance, HLA-typing, hereditary predisposition.
Контактная информация: Журавлев Вячеслав Юрьевич, канд. мед. наук, доцент, зав. лабораторией молекулярно-генетических исследований Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии, 191036, г. Санкт-Петербург, Лиговский пр, 2/4, тел. 8 (812) 950-25-84
Материал поступил в редакцию 07.06.2009
