CC BY
40чески одинаковой степенью противогименолепи-дозной активности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дударев В.Г., Фридман И.А., Малахова А.Ю.,
Севбо Д.П.,Трусов С.Н., Гицу Г.А., Михайлицын Ф.С. Антигельминтик надинат (МСТ-02), полученный новым способом, и его противогименолепидозная актив-ность.//Мед. паразитол. 2016; 2: 34—37.
2. Михайлицын Ф.С., Севбо Д.П., Трусов С.Н, Гицу
Г.А., Малахова А.Ю. Получение и изучение противоги-менолепидозной активности соединения МСТ-31 // Мед. паразитол. 2011; 3: 42.
3. Михайлицын Ф.С., Архипов И.А., Архипова Д.
Севбо Д.П., Трусов С.Н., Гицу Г.А., Белова Е.Е., Садов К.М., Радионов А.В. Получение опытного образца антигельминтика митранокса (МСТ-31) и оценка его лечебной эффективности при мониезиозе и стронгилятозах овец.//Мед. паразитол. 2012; 2: 51.
4. Хабриев Р. У. (ред) Руководство по экспериментальному
(доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М. 2005: 626—628.
Поступила 28.06.17
ОБЗОР
© О.Ю.ЕРЕМИНА1, Ю.В.ЛОПАТИНА, 2017
О.Ю.Еремина1, Ю.В.Лопатина12 (O.Yu.Eremina1, Yu.V.Lopatina12)
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ИНСЕКТИЦИДАМ У НАСЕКОМЫХ (MOLECULAR GENETIC MECHANISMS OF INSECTICIDE RESISTANCE IN
INSECTS)
1ФБУН НИИ Дезинфектологии Роспотребнадзора, 2МГУ им. М.В.Ломоносова, г. Москва (Research Institute of Disinfectology, Russian Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Moscow;
2M.VLomonsov Moscow State University, Moscow)
В обзоре обобщены и проанализированы сведения об механизмах устойчивости насекомых к инсектицидам. Основные механизмы, лежащие в основе резистентности насекомых, рассмотрены преимущественно на примере рыжего таракана Blattella germanica, поскольку этот вид включен в число 12 наиболее устойчивых к инсектицидам видов членистоногих (база данных «Arthropod Pesticide Resistance Database», 2014), широко распространен и имеет большое значение для здоровья человека. Особое внимание уделено снижению чувствительности нервной системы насекомых к инсектицидам и усилению активности ферментных систем, участвующих в детоксикации инсектицидов — цитохром Р450-зависимых монооксигеназ, глутатион S-трансфераз и неспецифических эстераз.
This review summarizes and analyzes information on the mechanisms of insecticide resistance in insects. The basic mechanisms underlying the resistance in insects are considered using primarily an example of the German cockroach (Blattella germanica), as this species is included among 12 arthropod species that are most resistant to insecticides (Arthropod Pesticide Resistance Database, 2014), which is widely distributed and has a great impact on human health. Special attention is paid to reducing the sensitivity of the insect nervous system to insecticides and to enhancing the activity of enzyme systems involved in insecticide detoxification, such as cytochrome P450-dependent monooxygenases, glutathione-S-transferases, and non-specific esterases.
Проблема резистентности членистоногих к инсектицидам приобрела в настоящее время глобальный характер. Микроэволюционные процессы,
происходящие под действием пресса биоцидов, приводят к постоянному увеличению числа видов насекомых и клещей, устойчивых к различ-
ал
ным группам химических веществ — в 2014 г. их число достигла 386 [38]. Выделяют три основных пути формирования резистентности насекомых к инсектоакарицидам: 1) специфическая устойчивость молекулярных мишеней инсектицидов за счет точковых мутаций кодирующих их генов; 2) увеличение активности ферментных систем, участвующих в детоксикации ксенобиотиков (неспецифические эстеразы, монооксигеназы, глутатион-S-трансферазы); 3) изменение активности АТФ-зависимых ABC-транспортных белков за счет гиперэкспрессии генов. Возможны также снижение проницаемости кутикулы для инсектицидов и поведенческая устойчивость насекомых [38, 46].
В настоящем обзоре мы ограничимся рассмотрением двух первых механизмов. Поскольку литература, посвященная проблеме устойчивости членистоногих к инсектоакарицидам, крайне обширна, мы рассмотрим их преимущественно на примере рыжего таракана Blattella germanica (L.), который входит в число 12 наиболее устойчивых к биоцидам видов членистоногих [Arthropod Pesticide Resistance Database, 2014, цит. по 38]. Кроме того, B. germanica — один из наиболее широко распространенных и значимых для здоровья человека видов синантропных членистоногих. Этот вид является механическим переносчиком патогенных для человека вирусов, бактерий, грибов, гельминтов, простейших, в том числе возбудителей внутрибольничных инфекций, а также источником аллергенов [26, 29]. Показано, что у резистентных к циперметрину особей увеличена экспрессия белка Per a 3, известного как аллерген Periplaneta americana L. [47].
1. Устойчивость места (мишени) действия инсектицида. Мишени воздействия нейротоксичных инсектицидов — ферменты и рецепторы нервной системы членистоногих: аце-тилхолинэстераза, никотин-ацетилхолиновые рецепторы, потенциалзависимые натриевые каналы в межнейронных синапсах, хлорные каналы в нейроэффекторных синапсах, нарушение функционирования которых под действием инсектицидов приводит к параличу и гибели особей [14]. В основе резистентности данного типа лежат точковые мутации в генах, кодирующих белковые субъединицы, с которыми взаимодействуют молекулы инсектицида [8, 14].
Ацетилхолинэстераза (АХЭ) является мишенью для инсектицидов из класса фосфорорганических соединений (ФОС) и производных карбаминовой кислоты (карбаматов). В основе механизма действия на членистоногих химических соединений из
этих групп инсектицидов лежит ингибирование активного центра АХЭ, которая отвечает за гидролиз ацетилхолина в холинергических синапсах нервных окончаний. Ингибирование АХЭ ФОС и карбаматами происходит в результате фосфори-лирования или карбамоилирования остатка сери-на в активном центре фермента и приводит к накоплению ацетилхолина в синапсе в результате его чрезмерного выделения холинергическими рецепторами [32].
Следует отметить, что ФОС приводят к необратимому ингибированию активного центра фермента, а карбаматы — к обратимому, причем процесс гидролиза карбамоилированной АХЭ зависит от гидролитической стабильности инсектицида: чем она выше, тем больше будет степень ингибирования фермента. Устойчивая к ФОС и карбаматам АХЭ была выявлена у насекомых из разных отрядов — Diptera, Homoptera, He-miptera, Lepidoptera, Coleoptera и др. Впервые ген, кодирующий ацетилхолинэстеразу насекомых, был клонирован у дрозофилы Drosophila melanogaster Meigen. В дальнейшем, были выявлены 14 мутаций, определяющие резистентность к ФОС и карбаматам [8].
У некоторых видов насекомых, например комара Anopheles gambiae Giles, были обнаружены два различных типа АХЭ, которые кодируются различными генами, AChEl и AChE2. Из них только AChEl ответственна за развитие резистентности к ФОС и карбаматам [43]. Исследования АХЭ резистентных к инсектицидам B. germanica также показали наличие двух АХЭ (BgAChEl и BgAChE2), из них BgAChE2, преобладающая в различных тканях насекомого, имеет более высокую каталитическую эффективность, но более низкую специфичность по отношению к субстрату, по сравнению с присутствующей только в центральной нервной системе BgAChEl. При этом BgAChEl в целом менее чувствительна к ингибиторам ферментных систем (за исключением параоксона и пропоксура), чем BgAChE2. На основании кинетических и молекулярных свойств, распределения и концентрации в тканях было показано, что важную роль в постсинаптической передаче нервного импульса играет BgAChEl [l9].
Биохимическое исследование четырех мульти-резистентных рас рыжего таракана B. germanica в Малайзии показало, что устойчивая к действию пропоксура АХЭ встречается редко [22]. Изучение тараканов на разных стадиях онтогенеза показало, что специфическая активность АХЭ уменьшается с увеличением возраста личинок — 6-недельные особи значительно более устойчивы к
ФОС по сравнению с 4-недельными (ПР к дихлор-восу — 18,55 и 4,98, соответственно) [32].
Потенциал-зависимые натриевые каналы (voltage-sensitive sodium channel, Vssc) мембран нервных клеток периферической и центральной нервной систем являются участками-мишенями для пиретроидов и ДАТ. Мутации, связанные с устойчивостью членистоногих к пиретроидам, в основном приводят к заменам аминокислотных остатков в I—III доменах -субъединицы натриевых каналов насекомых и клещей. Основная часть известных на сегодняшний день мутаций локализуется во II домене [11, 37]. Структурные изменения белка натриевых каналов влияют на характер их взаимодействия с пиретроидами, снижая т о к -
сическое действие инсектицидов этой группы. Нечувствительность натриевых каналов к действию ДАТ была впервые зарегистрирована в 1950-х годах у комнатной мухи Musca domestica L. и получила название «knockdown resistance» (kdr). Впоследствии было установлено, что у M. domestica мутация L1014F в шестом сегменте II домена гена Vssc, кодирующего -субъединицу натриевого канала приводила к образованию устойчивости к пиретроидам. Добавление второй замены, которая получила название «super-kdr» (M918T), приводило к образованию еще большей резистентности [7, 10, 36, 37]. Kdr-мутация L1014F была обнаружена у многих видов членистоногих, имеющих медицинское или санитарно-гигиеническое значение (например, кошачьей блохи Ctenocephalides felis (Bouché), комнатной мухи M. domestica, разных видов ко-маровродов Aedes, Anopheles и Culex), в том числе и у рыжего таракана. Мутация L1014F обнаружена и в резистентных к пиретроидам популяциях B.germanica из США, Германии, Индии, Ирана и Китая [15, 45]. Подробный перечень мутаций гена Vssc1, определяющих устойчивость членистоногих к пиретроидам, приведен в обзорной работе К. Донга с соавторами [11].
Наиболее полное токсикологическое и молеку-лярно-генетическое исследование резистентности рыжего таракана к пиретроидам проведено в США [25]. Наиболее часто у B. germanica встречается мутация L993F в 6 сегменте II домена (IIS6). В дополнение к этой основной мутации выявлены четыре дополнительные: E434K — замена глута-миновой кислоты на лизин, C764R — замена ци-стеина на аргинин, D58G — замена аспартата на глицин, P1880L — замена пролина на лейцин. Поскольку E434K и C764R были обнаружены
только у устойчивых к пиретроидам особей вместе с L993F, было высказано предположение, что они также вовлечены в механизм резистентности. Исследования функционального значения этих мутаций на ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus показало, что замена L993F приводит к снижению чувствительности натриевых каналов к пиретроидам в 5 раз. Мутации E434K и C764R, сами по себе не оказывают никакого воздействия, в то время как каждая из них в комбинации с L993F снижает чувствительность к дельтаметрину в 100раз. В случае наличия всех трех мутаций одновременно чувствительность к дельтаметрину снижается в 500 раз. На основании полученных результатов авторы сделали вывод, что в ходе развития устойчивости к пиретроидам у B. germanica в ходе селекции появилась первичная мутация L993F и две вторичные мутации E434K and C764R. Присутствие всех трех мутаций приводит к резкому изменению чувствительности к дельтаметрину. Предполагается, что исходно еще под воздействием ДДТ произошла селекция и закрепилась мутация L993F. Поскольку наличие E434K и C764R приводит к снижению проводимости канала, а насекомые несущие эти мутации, более чувствительны к дельтаметрину, то только присутствие L993F сделало возможным последующее закрепление этих дополнительных мутаций — E434K и C764R (так называемый механизм «последовательных мутаций») [39]. Следует заметить, что существует и другая точка зрения, проиллюстрированная на примере комнатной мухи M. domestica, согласно которой появление мутаций гена Vsscl происходит независимо [33].
В ходе селекции расы Marietta рыжего таракана (показатель резистентности (ПР) к циперме-трину у родительского поколения — 3,6х), к четвертому поколению ПР увеличился до 35х, среднее время наступления состояния нокдауна возросло за тот же период с 37 до 177 мин. Выявлена прямая зависимость между временем наступления нокдауна рыжих тараканов при контакте с циперметрином и наличием мутации L2979F [41].
Изучение двух рас B. germanica, резистентных к пиретроидам — Bpyr-R и Cpyr-R (показатель резистентности к перметрину 54х и 46х, дельтаметрину 50х и 47х, соответственно), показало, что устойчивость определяется мутацией F2996S [30].
В нервно-мышечных синапсах насекомых передача нервного импульса осуществляется двумя нейротрансмиттерами — глутаминовой кислотой ( Г л у К ) — медиа-
тором в возбуждающих синапсах и гам-ма-аминомасляной кислотой (ГАМК) — в тормозящих. ГАМКрецептор насекомых — олигомерный протеин с молекулярным весом 220—400 kD представлена пятью субъединицами: , , , и . Каждая субъединица состоит четырех трансмембранных доменов (TM1, TM2, ТМ3 и TM4). ГАМК-рецепторы являются мишенью для инсектицидов диенового синтеза (хлорорганические соединения, ХОС) и фенилпиразолов [38].
Длительное применение хлорорганических соединений диенового синтеза (дилдрин, алдрин, гептах-лор), гексахлорциклогексана и его гамма изомера
— линдана привело к возникновению популяций насекомых, устойчивых к инсектицидам, действующим на ГАМК-зависимые хлор-ионные каналы [14]. Впервые ген Rdl (resistance to dieldrin), определяющий резистентность к дилдрину, был описан у высокорезистентной к циклодиенам и пикроток-сину (4000х и 22000*, соответственно) линии D. melanogaster. С резистентностью к дилдрину различных видов насекомых, имеющих медицинское и ветеринарное значение, связаны две аминокислотные замены — A302S и A302G во втором трансмембранном домене субъединицы, кодируемой геном Rdl [34, 44]. Исследования, проведенные на культивируемых нейронах дрозофилы D. melanogaster, показали, что присутствие ала-нина имеет решающее значение для связывания дилдрина с нервным синапсом, и что замена этой аминокислоты на серин может привести к резистентности. В дальнейшем выявили, что мутация A302S является ключевой для формирования Rdl
— фенотипа у многих видов насекомых, в том числе B. germanica, различных видов комаров (Aedes aegypti (L), Anopheles stephensi Liston и др.) [4, 14, 44], что может служить примером параллельной эволюции. Резистентность к фипронилу (группа фенилпиразолов) в популяциях рыжих тараканов может быть обусловлена широким использованием ранее циклодиеновых инсектицидов, как следствие — увеличением доли особей, несущих Rdl-резистентный аллель.
Устойчивость насекомых к дилдрину, как правило, превышает устойчивость к фипронилу. Это неоднократно показано для разных географически изолированных популяций рыжего таракана: высоко устойчивые к дилдрину насекомые (1270х— 17000 х), проявляли невысокий уровень устойчивости к фипронилу (8х). Из четырех популяций рыжих тараканов исследованных в Дании, две оказались высокорезистентными к дилдрину (1270х и 2030х) и перекрестно резистентными к фипронилу (14х и 15х), а две умеренно резистентные к
дилдрину (13х и 15х) демонстрировали низкую толерантность к фипронилу (2х и 3х). По устойчивости к дилдрину Rdl-гомозиготные и гетерозиготные особи различались в 20раз (>1000 и 50х, соответственно), к фипронилу — в 3,8раза (>15хи 4х, соответственно). Частота резистентного Rdl-аллеля у высоко устойчивых и умеренно устойчивых к дилдрину насекомых составляла 0,97—1,0 и 0,38, соответственно [20].
Только при слабо выраженной толерантности уровень устойчивости к фипронилу и дилдрину может быть сходен: обнаруженные популяции рыжего таракана в Сингапуре проявляли толерантность к фипронилу и дилдрину (4,1 х и 3,0х, соответственно). Толерантность в данном случае можно связать с неспецифическим механизмом резистентности — усилением активности ферментных систем, участвующих в детоксикации ксенобиотиков, но не с Rdl-геном [4].
Различия в чувствительности насекомых, несущих Rdl-мутацию, к дилдрину и фипро-нилу связывают с их различным характером действия на ГАМК-рецепторы насекомых: ингибиро-вание хлорных каналов под действием фипронила было частично обратимым, дилдрина — необратимым [48].
2. Изменения активности ферментов, участвующих в детоксикации ксенобиотиков. Существенный вклад в механизм формирования устойчивости насекомых к инсектицидам вносят неспецифические системы детоксикации ксенобиотиков — ферментные системы, являющиеся членами больших мультигенных семейств неспецифических эстераз (НЭ), оксидаз (моноокси-геназ, МО) и глутатион-S-трансфераз (^Т). В метаболизме ксенобиотиков различают три фазы, которые приводят к увеличению гидрофильности молекулы, снижению активности и токсичности. Первая фаза метаболизма чужеродных веществ заключается в модификации, создающей или высвобождающей функциональные группы, которые во второй фазе конъюгируют с другими группами или молекулами. Третья фаза — связывание и выведение ксенобиотиков и их метаболитов из клетки и из организма [46].
Поскольку МО катализируют протекание множества реакций и характеризуются широкой субстратной специфичностью, они принимают участие в метаболизме практически всех классов инсектицидов и определяют развитие резистентности к ним у насекомых. Всего у насекомых найдено более 300 МО, которые идентифицированы и отнесены к 27 CYP семействам. Оксидазы ци-тохромы Р450 семейства 1 (CYP1) вместе с
альдегиддегидрогеназами, алкогольдегидрогеназами, пероксидазами, флавопротеин-редуктазами, эпоксидгидролазами, эстеразами и амидазами отнесены к ферментам фазы I биотрансформации ксенобиотиков. На их долю приходится свыше 80% от общего числа энзимов, задействованных на этой фазе метаболизма [цит. по 1].
Во второй фазе биотрансформации ксенобиотиков продолжается увеличение гидрофильности и снижение токсичности чужеродных соединений за счет конъюгации промежуточных продуктов метаболизма с эндогенными молекулами, такими как глутатион, глицин, глюкуроновая кислота, метильные, ацетильные или сульфогруппы и т. д. Ферменты, катализирующие эти реакции, обнаружены во всех организмах. Как и ферменты первой фазы метаболизма ксенобиотиков, ферменты, участвующие во второй фазе, обладают слабой субстратной специфичностью и катализируют превращения большой группы химических веществ. Главными среди них выступают трансферазы [2].
Для оценки вклада ферментных систем в механизм детоксикации инсектицидов используют ингибирующие их активность вещества — ингибиторы монофенолмонооксигеназ пиперонилбуток-с и д ( П П Б )
и N-октил-бициклогептен-карбоксимид (МГК-264); ингибитор неспецифических эстераз S,S,S трибутилтритиофосфат (ТБТФ); ингибитор rST диэтилмалеат (ДЭМ). Некоторые исследователи характеризуют ТБТФ как ингибитор эстераз и rST, а ДЭМ — как ингибитор оксидаз и эстераз [46].
У устойчивых к инсектицидам рас рыжих тараканов обнаружено увеличение активности неспецифических эстераз, алдрин-эпоксидазы, форат-сульфоксидазы, метоксирезоруфин-О-диэтилазы, Г S Т , к о м -
плекса МО (цитохром Р450-, цитохром b5- и цитохром с-оксидоредуктазы) и др. [22].
Повышенная экспрессия генов, в результате которой в организме резистентной особи вырабатывается большее количество ферментов по сравнению с чувствительной — широко распространенный механизм неспецифической резистентности, обнаруженный у представителей отрядов Homoptera, Hemiptera, Lepidoptera, Díptera и др. В ряде случаев мутации в кодирующем фермент гене могут приводить к ускорению детоксикации инсектицида. Так, например, показано, что определенные мутации гена карбоксилэстеразы у представителей отрядов Hymenoptera и Lepidoptera, приводят к повышенному гидролизу молекул ФОС и/или их разрушению [18, 36].
Однако не во всех случаях усиление активности ферментов или увеличение их количества можно связать с резистентностью, поскольку они могут обладать разной субстратной специфичностью. Так, у резистентных к перметрину популяций головных вшей Pediculus humanus capitis De Geer отмечено увеличение активности неспецифических эстераз (субстраты фенилтиоацетат, 1- и 2-нафтилацетат, пара-нитрофенилацетат), однако корреляции активности специфических эстераз (субстрат 7-кумарил-перметрат) с резистентностью к перметрину не найдено [5].
Монооксигеназы МО являются одной из наиболее важных ферментных систем, определяющих как токсичность инсектицида для конкретного вида насекомого, так и развитие резистентности к инсектицидам. Вследствие того, что МО катализируют протекание множества реакций и характеризуются широкой субстратной специфичностью, они принимают участие в метаболизме хлорорганических и фосфорорганических инсектицидов (ФОС), карбаматов и пиретроидов. Основным путём метаболизма пиретроидов является окисление трансметильной группы в кислотной части молекулы, происходящее при участии МО [46].
Многочисленные исследования механизма действия инсектицидов с применением синергистов и в частности ингибитором МО — пиперонилбу-токсида (ППБ) — показывают, что усиление активности МО часто отмечают у многих резистентных к инсектицидам видов членистоногих из разных отрядов (Diptera, Coleoptera, Homoptera, Phthiraptera и др.). Механизм резистентности к инсектицидам был неоднократно исследован при помощи синерги-стов в разных популяциях рыжего таракана и на лабораторных культурах, устойчивых к инсектицидам. Показано, что МО участвуют в механизме устойчивости к пиретроидам. Так при предобработке тараканов ППБ и последующем контакте со стеклом, обработанном перметрином, смертность насекомых увеличивалась. Полное поражение (100%) насекомых чувствительной расы SUS наступало в результате 5 минутного контакта. Для толерантных к перметрину рас для достижения аналогичного эффекта требовалось 25 минут (раса GIR) и 60 минут (раса BOY2) [21]. Аналогичные данные были получены и для другого инсектицида из группы пиретроидов — дельтаметри-на: применение ППБ значительно снижало уровень резистентности (97х 17х) [30]. Обработка тараканов ППБ в 1,5—2,5раза повышала активность цифлутрина для резистентных насекомых
[12]. В Индонезии обнаружена популяция рыжих тараканов, у которой увеличение активности МО играло основную роль в механизме резистентности к перметрину (95 х) — коэффициент синергиче-ского действия был равен 70 [3]. Для ФОС и карбаматов также показан вклад МО: толерантность рыжих тараканов к хлорофосу и пропоксуру снижалась при применении ППБ в 1,1—2,7 раз [32], к бендиокарбу — в 1,3—3,6 раз [35].
Проведенные в США исследования устойчивых к пиретроидам тараканов (раса Aves) показали, что показатель резистентности к циперметрину под воздействием ППБ снизился в 3,2раза (с 93х до 29х), что указывает на усиление активности МО у устойчивых особей [40].
ППБ повышал токсичность фипронила и снижал резистентность рыжих тараканов с 36х до 18х. По-видимому, это связано с основным путем деградации фипронила в организме насекомых — окислением молекулы и превращением в биологически активные сульфоновые метаболиты [16].
Различия в действии ингибитора могут быть связаны с наличием множества изоформ МО с разной степенью сродства к субстрату (в данном случае субстратом является инсектицид) и как следствие — избирательным ингибированием только некоторых изоформ. Также известно, что в некоторых случаях применение синергиста изменяет проницаемость кутикулы насекомого для инсектицида [30].
Согласным данным сайта NCBI, у рыжего таракана были найдены гены цитохрома Р450 — CYP6L1, CYP6J1, CYP6K1, CYP9E2P1, CYP9E2P2, CYP4C21P1, CYP4C21P2, CYP4C21P3 и CYP4G19. Наиболее детально исследован ген CYP4G19. Установлено, что у чувствительных к инсектицидам B. germanica на всех стадиях онтогенеза (яйцо, личинка, нимфа, взрослые особи) экспрессия этого гена была слабо выражена. У резистентных насекомых она увеличивалась, причем на стадии яйца по уровню экспрессии устойчивые особи слабо отличалась от чувствительных, у личинок она возрастала в 1,7 раза, у взрослых особей — в 5 раз [17, 31].
В некоторых случаях устойчивость тараканов к имидаклоприду, пропоксуру и пиретроидам не сопровождалась повышением активности моно-оксигеназ, т. е. окисление инсектицидов МО играло малую роль в формировании резистентности. Это свидетельствует о наличии других ведущих механизмов формирования устойчивости в таких популяциях B. germanica [23, 30].
Неспецифические эстеразы. Неспецифические эстеразы — неоднородная группа ферментов, от-
личающихся друг от друга по субстратной специфичности. Они участвуют в гидролизе ксенобиотиков (фосфорорганических веществ, пиретроидов, сложных эфиров, амидов, гидрокса-мовых кислот, гидразидов и др.). В литературе имеются многочисленные сведения о роли эстераз в метаболизме и детоксикации инсектицидов у различных групп насекомых [2, 27]. Резистентность, обусловленную неспецифическими эстераза-ми, часто наблюдают у членистоногих, устойчивых к ФОС и пиретроидам. Рост активности эстераз может сопровождаться кросс-резистентностью к соединениям из разных химических классов [6, 18].
В Сингапуре вклад эстераз в резистентность рыжих тараканов к пиретроидам (дельтаметри-ну, бета-цифлутрину) установлен только в 5 популяциях из 22 исследованных, в то время как к карбамату пропоксуру — во всех 22 популяциях. В резистентности к хлорпирифосу вклад эстераз выявлен во всех исследованных 6 популяциях [9]. Повышенная активность эстераз найдена у резистентных к перметрину (13х), циперметрину (17х) и пропоксуру (15,7х) тараканов расы Crawford в сравнении с чувствительными насекомыми [28]. В Китае у резистентных к пиретроидам рыжих тараканов (ПР к перметрину 3,9) уровень эстераз по сравнению с лабораторной чувствительной расой был в 8 раз выше [17].
В экспериментах с насекомыми из природных популяций и инсектарных чувствительных к инсектицидам культур рыжего таракана неоднократно показано усиление активности неспецифических эстераз при развитии устойчивости к инсектицидам. Так, приблизительно двукратное замедление проявления состояния нокдауна при контакте с отложениями перметрина, дельтаме-трина и циперметрина были выявлены у двух резистентных к пиретроидам рас рыжего таракана из Ирана. По сравнению с лабораторной чувствительной культурой у резистентных тараканов уровень эстераз был в восемь раз выше [24]. У толерантной расы Marietta ТБТФ увеличил токсичность циперметрина в 2,4 раза, а резистентность снизилась с 4,7х до 2,9х [42]. В шести из семи популяций тараканов в Иране установлено достоверное повышение КСД при использовании ингибитора эстераз ТБТФ, что свидетельствует о значительном вкладе эстераз в механизм резистентности к пиретроидам в этих популяциях
[13]
ТБТФ значительно увеличивал инсектицидную активность пиретроидов по отношению к рези-стентнойрасе Apyr-R (США) и снижалрезистент-
ность к перметрину в 4,4раза (97х 22х), дельта-метрину — в 5,9 раз (480х 81х) [30]. Аналогичные исследования другой резистентной расы Aves (США) показали, что под воздействием ТБТФ показатель резистентности к циперметри-ну снизился с 92,8хдо 17,7х [40]. Роль неспецифических эстераз в формировании устойчивости тараканов к пиретроидам и карбаматам показана также в исследованиях, поведенных в Сингапуре [9].
ТБТФ повышал также и токсичность фипро-нила для рыжих тараканов (показатель резистентности снижался с 36х до 18х), хотя в молекуле фипронила отсутствуют связи, которые могут быть подвергнуты эстеразному гидролизу. Возможно, выявленный факт связан с неспецифическим ингибированием ТБТФ цито-хром Р450 МО, вовлеченных в детокси-кацию фипронила. Таким образом, ТБТФ может конкурентно ингибировать ферменты Р450, окисляющие тиоэфирную группу молекулы фипронила, потенциально лимитируя образование сульфонов (более активных метаболитов) [16].
Вместе с тем, в литературе приведены сведения о слабом подавлении ТБТФ резистентности к перметрину, что свидетельствует о малой роли в механизме резистентости в этих случаях эсте-разного гидролиза [30].
Глутатион-S-трансферазы. Глутатион-S-трансферазы (rS^ — ферменты, ответственные за конъюгацию сульфгидрильной SH2-группы с электрофильными атомами углерода, азота, серы и кислорода в молекулах ксенобиотиков. ГST катализирует реакцию глутатиона с различными алифатическими, ароматическими, эпоксидными и гетероциклическими радикалами экзогенных повреждающих веществ. Это семейство ферментов, катализирующих конъюгацию различных ксенобиотиков, с отщеплением глутатиона. Каталитическая активность ГST обеспечивает клетку механизмом защиты от вредного воздействия этих веществ. ГST участвуют в детоксикации инсектицидов и могут играть важную роль в формировании метаболической устойчивости членистоногих [46].
Проведенное в Малайзии исследование выявило усиление активности ГSTу двух из четырех муль-тирезистентных рас рыжих тараканов, что объясняют резистентностью к ДДТ, в метаболизм которого вовлечена трансфераза известная ранее как ДДТ-дехлориназа [22]. Менее выраженные по сравнению с неспецифическими эстеразами, но статистически достоверные различия в активности ГST (1,2—1,8 раз) выявлены иранскими
исследователями у двух рас рыжих тараканов, устойчивых к пиретроидам (перметрину, ципер-метрину и дельтаметрину) [13].
Комплексные механизмы устойчивости членистоногих к инсектицидам. Устойчивость членистоногих к инсектицидам, как правило, обусловлена несколькими механизмами, которые могут быть представлены в различных сочетаниях и в разной степени даже в одной популяции конкретного вида. В последние десятилетие появляется все больше работ, в которых исследуют комплексные меха-н и з м ы у с т о й ч и -
вости насекомых к инсектицидам. Наиболее детально на молекулярном уровне исследованы основы формирования устойчивости к инсектицидам у постельного клопа Cimex lectularius L., у которого может проявляться разнообразное сочетание практически всех механизмов — 1^г, усиление активности ферментов детоксикации (МО, эстераз), снижение проницаемости кутикулы, усиление эксперессии белков АВС-транспортеров. При этом сочетание двух механизмов встречается в 4,8% случаев, трех — 4,8%, четырех в 19% случаев, и пяти — в 71,4% случаев [49]. В популяциях рыжего таракана также выявлены несколько различных механизмов резистентности — модифицированная А Х Э и у с и -ление активности ферментных систем, которые могут встречаться одновременно [22, 24, 30].
Обобщая вышесказанное, можно заключить, что насекомые, испытывая жесткий пресс инсектицидов, выработали в ходе микроэволюции, которая продолжается и в настоящее время, целый спектр адаптивных приспособлений. Изменения произошли в разных направлениях, в том числе снизилась чувствительность мишеней к действию инсектицида и возросла активность ферментных систем, участвующих в детоксикации. Исследования участков-мишеней воздействия инсектицидов показало, что одинаковые мутации могут происходить у широкого ряда видов насекомых из разных таксономических групп. Идентичность этих мутаций, по-видимому, связана с необходимостью устойчивости систем для поддержания жизнеспособности популяции в природе, и, следовательно, может быть допустимо ограниченное число аминокислотных замен в генах рецепторов или ферментов, для того чтобы популяция оставалась жизнеспособной. Другие механизмы формирования резистентности у насекомых — изменение проницаемости покровов, роль АВС-транспортеров и другие — будут рассмотрены в следующем обзоре.
Работа поддержана грантом РФФИ 16-04-01337а.
ЛИТЕРАТУРА
1. Смирнов Л.П., Суховская И.В., Борвинская Е.В.
Этоксирезоруфин О-деэтилаза — систематическая принадлежность и функциональные особенности как фермента фазы I биотрансформации ксенобиотиков (обзор).//Ученые записки Петрозаводского государственного университета. 2015; 4:18—22.
2. Хрунин А.В. Биохимические и молекулярные аспекты мета-
болической устойчивости насекомых к инсектицидам.//Агро-химия. 2001; 7: 72—85.
3. Ahmad I., Sriwahjuningsih, Astari S, Putra R.E.,
Permana A.D. Monitoring pyrethroid resistance in field collected Blattella germanica Linn. (Dictyoptera: Blattellidae) in Indonesia.//Entomol. Res. 2009; 39:114—118.
4. AngL.-H, Nazni W.A., Kuah M.-K.., Shu-Chien A.C.,
Lee C.-Y. Detection of the A302S Rdl mutation in fipronil bait-selected strains of the German cockroach (Dictyoptera: Blattellidae).//]. Econ. Entomol. 2013; 106 (5): 2167—2176.
5. Barrios S, Zerba E, Picollo M.I., Audino P.G. Activ-
ity of increased specific and non-specific esterases and glutathione transferases associated with resistance topermethrin in Pediculus humanus capitis (Phthiraptera: Pediculidae) from Argentina.// Parasitol. Res. 2010; 106 (2): 415—421.
6. Bass C., Field L.M. Gene amplification and insecticide resist-
ance.//Pest. Manag. Sci. 2011; 67: 886—890.
7. Burton M.J., Mellor I.R., Duce I.R., Davies T.G.,
Field L.M., Williamson M.S. Differential resistance of insect sodium channels with kdr mutations to deltamethrin, permethrin and DDT.//Insect. Biochem. Mol. Biol. 2011; 41: 723—732.
8. Casida J.E., Durkin K.A. Neuroactive insecticides: targets,
selectivity, resistance, and secondary effects.//Annu. Rev. Entomol. 2013; 58: 99—117.
9. Chai R.-Y., Lee C.-Y. Insecticide resistance profiles and syn-
ergism infield populations of the German cockroach (Dictyoptera: Blattellidae) from Singapore.//]. Econ. Entomol. 2010; 103 (2): 460—471.
10. Davies T.G.E., O'Reilly A.O., Field L.M, Wallace
B.A., Williamson M.S. Knockdown resistance to DDT and pyrethroids: from target-site mutations to molecular modeling.//Pest Manag. Sci. 2008; 64: 1126—1130.
11. Dong K, Du Y., Rinkevich F, Nomura Y., Xu P.,
Wang L., Silver K., Zhorov B.S. Molecular biology of insect sodium channels and pyrethroid resistance.//lnsect. Biochem. Mol. Biol. 2014; 50:1—17.
12. Doroudgar A., Paksa A., Vatandoost H., Sanei-De-
hkordi A., Salim-Abadi Y. Detection of cyfluthrin resistance mechanisms among German cockroach strains in vivo in Kashan during 20112012.//Feyz, ]. Kashan University of Medical Sciences. 2014; 17 (6): 590—596.
13. Enayati A.A., Haghi F.M. Biochemistry of pyrethroid resist-
ance in German cockroach (Dictyoptera, Blatellidae) from hospitals of Sari, lran.//lranian Biomed.]. 2007; 11 (4): 251—258.
14. Ffrench-Constant R.H., Daborn P.J., Le Goff G. The
genetics and genomics of insecticide resistance.//Trends Genet. 2004; 20:163—170.
15. Gholizadeh S., Nouroozi B., Ladonni H. Molecular detection of knockdown resistance (kdr) in Blattella germanica (Blattodea: Blattellidae) from Northwestern lran.//]. Med. Entomol. 2014; 51 (5): 976—979.
16. Gondhalekar A.D., Scharf M.E. Mechanisms underlying fipronil resistance in a multiresistant field strain of the German
cockroach (Blattodea: Blattellidae).//J. Med. Entomol. 2012; 49 (1): 122—131.
17. Guo G.-Z, Geng Y.-J., Huang D.-N, Xue C.-F, Zhang R.-L. Level of CYP4G19 expression is associated with pyrethroid resistance in Blattella germanica.//J. Parasitol. Res. 2010; pii: 517534, 7 p. doi:10.1155/2010/ 517534.
18. Hotelier T., Nègre V., Marchot P., Chatonnet A. In-
secticide resistance through mutations in cholinesterases or car-boxylesterases: data mining in the ESTHER database.//J. Pest. Sci. 2010; 35: 315—320.
19. Kim Y.H., Choi J.Y, Je Y.H., Koh Y.H., Lee S.H.
Functional analysis and molecular characterization of two acetylcholinesterases from the German cockroach, Blattella germani-ca.//lnsect. Mol. Biol. 2010; 19 (6): 765—776.
20. Kristensen M., Hansen K.K., Jensen K.-M.V. Cross-
resistance between dieldrin and fipronil in German cockroach (Dictyoptera: Blattellidae).//J. Econ. Entomol. 2005; 98 (4): 1305—1310.
21. Ladonni H. Permethrin resistance ratios compared by two methods of testing nymphs of the German cockroach, Blattella germanica.//Med. Vet. Entomol. 2000; 14:213—216.
22. Lee C.Y., Hemingway J., Yap H.H., Chong N.L. Bio-
chemical characterization of insecticide resistance in the German cockroach, Blattella germanica, from Malaysia.//Med. Vet. Entomol. 2000; 14:11—18.
23. Limoee M., Enayati A.A., Khassi K., Salimi M., Ladonni H. lnsecticide resistance and synergism of three field-collected strains of the German cockroach Blattella germanica (L.) (Dictyoptera: Blattellidae) from hospitals in Kerman-shah, lran.//Trop. Biomed. 2011; 28 (1): 111—118.
24. Limoee M., Enayati A.A., Ladonni H., Vatandoost
H., Baseri H., Oshaghi M.A. Various mechanisms responsible for permethrin metabolic resistance in seven weld-collected strains of the German cockroach from lran, Blattella germanica (L.) (Dictyoptera: Blattellidae).//Pestic. Biochem. Physiol. 2007; 87:138—146.
25. Liu Z., Valles S.M., Dong K. Novel point mutations in the
German cockroach para sodium channel gene are associated with knockdown resistance (kdr) to pyrethroid insecticides.//lnsect. Biochem. Mol. Biol. 2000; 30: 991—997.
26. Moges F., Eshetie S., Endris M., Huruy K., Muluye
D., Feleke T., Silassie F., Ayalew G., Nagappan R. Cockroaches as a source of high bacterial pathogens with multid-rug resistant strains in Gondar town, Ethiopia.//Biomed. Res. Int. 20 16; 2 82 50 56. doi: 10.1155/ 2016/2825056.
27. Montella I.R., Schama R., Valle D. The classification of
esterases: an important gene family involved in insecticide resistance — A review.//Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. 2012; 107 (4): 437—449.
28. Park N.J., Kamble S.T. Comparison of esterases between life stages
and sexes of resistant and susceptible strains of German cockroach (Dictyoptera: Blattellidae).//J. Econ. Entomol. 1998; 91 (5): 1051—1058.
29. Pomés A., Arruda L.K. Investigating cockroach allergens: aiming to improve diagnosis and treatment of cockroach allergic patients.//Methods. 2014; 66 (1): 75—85.
30. Pridgeon J.W., Appel A.G, Moar W.J., Liu N. Vari-
ability of resistance mechanisms in pyrethroid resistant German cockroaches (Dictyoptera: Blattellidae).//Pestic. Biochem. Physiol. 2002; 73:149—156.
31. Pridgeon J.W., Zhang L., Liu N. Overexpression of CY-
P4G19 associated with a pyrethroid-resistant strain of the German cockroach, Blattella germanica (L.).//Gene. 2003; 314: 157—163.
32. Qian K., Wei X.Q., Zeng X.P., Liu T., Gao X.W.
Stage — dependent tolerance of the German cockroach, Blattella germanica for dichlorvos and propoxur.//J. Insect. Sci. 2010; 10:201 available online: insectscience.org/10.201.
33. Rinkevich F.D., Hedtke S.M., Leichter C.A., Harris
S.A., Su C., Brady S.G., Taskin V., Qiu X., Scott J.G. Multiple origins of kdr-type resistance in the house fly, Musca domestica.//PLoS One. 2012; 7 (12): e52761.
34. Rust M.K., Vetter R., Denholm I., Blagburn B.,
Williamson M.S., Kopp S., Coleman G., Hostetler J., Davis W., Mencke N., Rees R., Foit S., Böhm C., Tetzner K.. Susceptibility of adult cat fleas (Siphonaptera: Pulicidae) to insecticides and status of insecticide resistance mutations at the Rdl and knockdown resistance loci.//Parasitol. Res. 2015; 114 (Suppl. 1): P. 7—18.
35. Salehi A., Vatandoost H., Hazratian T., Sanei-De-
hkordi A., Hooshyar H., Arbabi M., Salim-Abadi Y., Sharafati-Chaleshtori R., Gorouhi M.A., Paksa A. Detection of bendiocarb and carbaryl resistance mechanisms among German cockroach Blattella germanica (Blattaria: Blattellidae) collected from Tabriz hospitals, East Azerbaijan Province, Iran in 2013.//J. Arthropod Borne Dis. 2016: 403— 412.
36. Scott J.G. Evolution of resistance to pyrethroid insecticides in Musca domestica.//Pest Manag. Sci. 2016; doi: 10.1002/ ps.4328.
37. Soderlund D.M. Sodium channels. In Insect Pharmacology, ed.
L.I. Gilbert, S.S. Gill. London: Academic Press. 2010:1—24.
38. Sparks T.C., Nauen R. IRAC: Mode of action classification
and insecticide resistance management.//Pestic. Biochem. Physi-ol. 2015; 121:122—128.
39. Tan J, Liu Z, Tsai T.D., Valles S.M., Goldin A.L,
Dong K. Novel sodium channel gene mutations in Blattella germanica reduce the sensitivity of expressed channels to del-tamethrin.//Insect. Biochem. Mol. Biol. 2002; 32: 445—454.
40. Valles S.M., Dong K., Brenner R.J. Mechanisms responsible for cypermethrin resistance in a strain of German cockroach, Blattella germanica.//Pestic. Biochem. Physiol. 2000; 66: 195—205.
41. Valles S.M., Perera O.P., Strong C.A. Relationship between the para-homologous sodium channel point mutation (g c at nu-cleotide 2979) and knockdown resistance in the German cockroach using multiplex polymerase chain reaction to discern genotype.//J. Econ. Entomol. 2003; 96 (3): 885—891.
42. Valles S.M., Strong C.A. A microsomal esterase involved in cypermethrin resistance in the German cockroach, Blattella germanica.//Pestic. Biochem. Physiol. 2001; 71: 56—67.
43. Weill M., Fort P., Berthomieu A., Dubois M.P., Pasteur N. et al. A novel acetylcholinesterase gene in mosquitoes codes for the insecticide target and is non-homologous to the ace gene in Drosophila.//Proc. R. Soc. Lond. 2002; 269: 2007— 2016.
44. Wondji C.S., Dabire R.K., Tukur Z., Irving H., Djouaka R. et al. Identification and distribution of a GABA receptor mutation conferring dieldrin resistance in the malaria vector Anopheles funestus in Africa.//Insect. Biochem. Mol. Biol. 2011; 41: 484—491.
45. Xu Q., Wang H., Zhang L., Liu N. Sodium channel gene
expression associated with pyrethroid resistant house flies and German cockroaches.//Gene. 2006; 379: 62—67.
46. Yu S.J. The toxicology and biochemistry of insecticides. Taylor and Francis Group, LLC. 2008.276p.
47. Zhang F., Wang X.J., Huang Y.H., Zhao Z.G., Zhang
S.S., Gong X.S., Xie L., Kang D.M., Jing X. Differential expression of hemolymph proteins between susceptible and insecticide-resistant Blattella germanica (Blattodea: Blattel-lidae).//Environ. Entomol. 2014; 43 (4): 1117—1123.
48. Zhao X., Salgado V.L., Yeh J.Z., Narahashi T. Dif-
ferent actions of fipronil and dieldrin insecticides on GABA-gated chloride channels in cockroach neurons.//]. Pharmacol. Exp. Ther. 2003; 306: 914—924.
49. 49. Zhu F., Gujar H, Gordon J.R., Haynes K.F., Potter M.F., Palli S.R. Bed bugs evolved unique adaptive strategy to resist pyrethroid insecticides.//Sci. Rep. 2013; 3:1456.
Поступила 28.11.16
