CC BY
59
Раздел - обзоры
Молекулярно-генетические маркеры радиочувствительности, позволяющие прогнозировать появление радиационных повреждений у больных, проходящих лучевую терапию
Шайхаев Е.Г.
ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства Здравоохранения Российской Федерации, г. Москва 117997, ГСП-7, ул. Профсоюзная, д. 86 (ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России) Информация об авторе
Шайхаев Евгений Гаджирамазанович - к.б.н, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и цитогенетики ФГБУ РНЦРР
Контактное лицо: Шайхаев Евгений Гаджирамазанович. ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства Здравоохранения Российской Федерации, г. Москва 117997, ГСП-7, ул. Профсоюзная, д. 86 (ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России), е-шаП: евИаКИаеу^шаП .ги Резюме
Данная работа посвящена новому направлению в радиационной генетике -радиогеномике, основной целью которой является изучение молекулярно-генетических маркеров, ответственных за развитие лучевых реакций и повреждений у больных, проходящих лучевую терапию. Описаны молекулярные механизмы, активирующиеся в клетке в ответ на действие ионизирующего излучения и влияющие на развитие побочных эффектов. Представлены основные подходы, значимые на сегодняшний день результаты и проблемы радиогеномных исследований.
Ключевые слова: лучевая терапия, лучевые реакции, генетические маркеры, БКР, радиогеномика
Molecular genetic markers of radiosensitivity, allowing to predict the occurrence of radiation damage in patients undergoing radiation therapy
Shaikhaev E.G.
Federal State Budgetary Institution Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR) of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation (Russian Scientific Center of Roentgenoradiology), 117997, Moscow, Profsoyuznaya str., 86 Summary
This work is devoted to a new direction in radiation genetics - radiogenomics, the main purpose of which is to study molecular genetic markers responsible for the development of radiation reactions and damage in patients undergoing radiation therapy. Molecular mechanisms that are activated in the cell in response to ionizing radiation and affecting the development of side effects are described. The main approaches, significant for today results and problems of radiogenomic studies are presented.
Key words: radiation therapy, adverse reactions, genetic markers, SNP, radiogenomics Введение
В настоящее время радиотерапия является одним из основных способов лечения онкологических больных. Применение лучевой терапии приводит к хорошим результатам при лечении опухолей головы, шеи, шейки матки, мочевого пузыря и других локализаций. В некоторых случаях, в результате лучевой терапии могут возникать лучевые реакции и повреждения здоровых органов и тканей [1]. Данные реакции могут быть ранними, возникающими в течение первых трех месяцев лечения и влияющими на его ход, а также поздними, которые могут возникать в течение нескольких лет после лечения и оказывать влияние на качество жизни пациентов [4].
В целом, умеренные лучевые реакции — частое явление для пациентов, проходящих лучевую терапию. Однако в некоторых случаях наблюдаются более выраженные
повреждения, которые могут представлять серьезную угрозу для пациента [5]. Развитие таких радиационных повреждений определяется многими факторами: дозой облучения, мощностью дозы, объемом облучаемого участка, типом источника облучения, использованием химиотерапии, наличием сопутствующих заболеваний, возрастом пациента. Однако при идентичных клинических условиях, при использовании стандартных радиотерапевтических протоколов, у больных могут наблюдаться заметные различия в характере и степени выраженности лучевых реакций [22]. Выявление радиочувствительных пациентов, у которых высока вероятность развития выраженных повреждений (на основании соответствующих предиктивных маркеров) еще до начала лечения, с целью коррекции их радиотерапевтических протоколов, а именно выбора оптимальной толерантной дозы, позволяющей получить локальный контроль над опухолью и снизить риск повреждений, является важной клинической задачей. Соответственно, исследования, направленные на поиск маркеров, с помощью которых станет возможным предсказывать появление радиационных повреждений, имеют большое значение [14].
Молекулярно-генетические аспекты патогенеза радиационных повреждений
На сегодняшний день все большая роль в развитии лучевых реакций и повреждений отводится наследственным факторам. Например, в ранних исследованиях, у пациентов с синдромами, характеризующимися повышенной радиочувствительностью, такими как атаксия телеангиэктазия, синдром повреждения Неймегена и LIG4-синдром, обнаружены мутации в генах репарации ATM, NBN, LIG4, соответственно [11]. Однако стоит отметить, что данные мутации, приводящие к серьезным нарушениям функций соответствующих белков - замены нуклеотидов, приводящие к образованию стоп-кодона (нонсенс-мутации) или инсерции/делеции, приводящие к сдвигу рамки считывания, встречаются очень редко (менее 1%) и в большинстве случаев не объясняют различий в радиочувствительности среди пациентов [19]. Поэтому большее значение, по сравнению с
редкими мутациями, отводится более частым генетическим изменениям, например однонуклеотидным заменам - SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Частота их встречаемости в популяции превышает 5%. В кодирующих регионах гена они приводят к аминокислотным заменам в белке, в регуляторных регионах гена - к изменению регуляции экспрессии гена, а в сайтах сплайсинга - к нарушению сплайсинга. SNP относятся к менее пенетратным, т.е. менее патогенным изменениям, однако суммарно (за счет нескольких десятков и сотен таких полиморфизмов) могут определять радиочувствительность пациентов [9,12].
Для поиска данных генетических маркеров радиочувствительности, в первую очередь, необходимо иметь представление о том, какие молекулярные механизмы в клетке активируются в ответ на действие ионизирующего излучения. Основным компонентом в клетке, на который воздействует радиация, является ДНК. Такое воздействие может иметь либо прямой повреждающий характер за счет ионизации связей в молекуле ДНК, либо косвенный за счет образования свободных радикалов - молекул и атомов с неспаренными электронами. В результате такого прямого или косвенного действия в ДНК образуются одно- и двунитевые разрывы [29]. Однонитевых разрывов образуется больше, чем двунитевых, которые при этом репарируются тяжелее. Именно двунитевым разрывам отводится основная роль в повреждении ДНК. Двунитевые разрывы распознаются MRN -комплексом, в состав которого входят белки MRE11, NBS, RAD50, что в дальнейшем способствует активации серин-треониновой киназы ATM [13]. ATM посредством фосфорилирования активирует эффекторную киназу CHEK2, которая в свою очередь активирует ингибиторы циклин зависимых киназ CDKN1A и CDKN1B, что в итоге приводит к остановке клеточного цикла. Остановка клеточного цикла в данном случае необходима для осуществления процесса репарации. Репарация может осуществляться двумя путями: в случае остановки клеточного цикла в точке G2-M, репарация идет по пути гомологичной рекомбинации с участием белков RAD52, RAD51, RAD54, XRCC2,
XRCC3, а в случае остановки клеточного цикла в точке G1-S, репарация проходит посредством не гомологичного соединения концов c участием таких факторов, как PRKDC, XRCC6, XRCC5, LIG4, XRCC4, DCLRE1C [20]. Также стоит отметить, что доступ участников репарации к поврежденной ДНК "облегчается" благодаря фосфорилированию гистона H2AX, которое также происходит при помощи киназы ATM [24].
При дефектах системы репарации, а также при серьезных повреждениях ДНК, ATM фосфорилирует белок p53, который будучи фактором транскрипции, активирует гены (GADD45, APAF1, BAX), белковые продукты которых принимают непосредственное участие в индукции клеточной смерти посредством апоптоза. Такой радиационно-индуцированный апоптоз, например, происходит в стволовых клетках базального слоя многослойного эпителия кожи, полости рта, пищевода [23, 14]. Данные стволовые клетки, во-первых, способны воспроизводить сами себя, являясь быстро пролифилирующими, и, как следствие, более радиочувствительными. Во-вторых, они способны дифференцироваться в зрелые клетки, т.е. являются основным источником пополнения эпителия новыми клетками. В связи с этим их повышенная гибель может привести к нехватке клеток поверхностных слоев эпителия, нарушению эпителиального барьера и, как результат, развитию таких распространенных реакций кожи, как эритема, дерматиты, язвы, а также развитие мукозитов полости рта различной степени тяжести. Радиационно-индуцированный апоптоз в гемопоэтических стволовых клетках может быть также причиной таких реакций крови как лейкопения и анемия [28].
Помимо этого, образование свободных радикалов стимулирует выработку хемокинов, ростовых факторов и провоспалительных цитокинов, что также способствует развитию лучевых реакций воспалительного характера. Для поздних лучевых реакций характерны такие процессы как фиброз, атрофия и сосудистые изменения, при которых
также важную роль играют цитокины, факторы роста и хемокины, такие как IL2, IL8, TGFb, EGF, FGF, TNF [29].
Таким образом, развитие лучевых реакций на молекулярно-клеточном уровне может быть следствием нарушения работы множества механизмов (регуляции клеточного цикла, репарации ДНК, апоптоза, антиоксидантной защиты, воспаления и др.), а индивидуальная радиочувствительность пациентов, вероятнее всего, определяется изменчивостью одновременно большого количества генов. Поиск наследственных маркеров радиочувствительности. Радиогеномика
За последние 10 лет опубликовано более 60 публикаций, посвященных идентификации генетических маркеров радиочувствительности [2]. Основной подход, используемый в ранних работах, связан с анализом ассоциаций, т.е. исследованием двух групп сравнения по определенным генетическим маркерам (в основном SNP). Сравнивают контрольные группы и группы пациентов с интересующем фенотипом (в данном случае это группы пациентов с умеренными лучевыми реакциями и группы пациентов с выраженными лучевыми повреждениями соответственно) и затем оценивают различия в распределении частот аллелей между этими группами. Основным параметром, характеризующим различия, является "отношение шансов" - OR (англ. Odds Ratio). Отношение шансов - это отношение двух значений: шанса того, что индивид, имеющий данный аллель проявляет данный признак, к шансу того, что индивид проявляющий признак, не имеет исследуемого аллеля. Аллель ассоциируется с данным признаком, если частота этого аллеля гораздо выше в исследуемой выборке, чем в контрольной группе, и тогда отношение шансов будет больше 1. С помощью критерия х2 рассчитывается P-значение, характеризующее значимость отношения шансов [6].
В ряде исследований выявлены ассоциации отдельных SNP в генах, белковые продукты которых участвуют в процессах репарации, с развитием радиационных повреждений [7, 8, 18]. Однако полученные результаты считаются спорными, так как по
многим из них не проводились повторные, подтверждающие исследования в других исследуемых группах и популяциях, а также объемы некоторых исследуемых выборок были небольшими и поэтому не удовлетворяли в полной мере требованиям к сравнительным генетическим исследованиям.
Новые технологии генетического анализа, такие как ДНК-микрочипы и секвенирование нового поколения (NGS), позволяющие анализировать одновременно большое количество SNP в большом количестве генов, изменили формат анализа ассоциаций, превратив его в полногеномный (GWAS - genome-wide association studies). Учитывая, что патогенез лучевых реакций это сложный многофакторный процесс -результат изменчивости множества генов, использование такого подхода для поиска маркеров радиочувствительности становится вполне оправданным и рождает новое исследовательское направление именуемое "радиогеномикой" [21].
С целью повышения точности и достоверности результатов, в радиогеномике полногеномный анализ ассоциаций принято проводить в два этапа. На первом этапе исследуемая когорта случайным образом разбивается на две группы и с помощью готового коммерческого набора (ДНК-микрочип и NGS - панель) проводится анализ ассоциаций и сравнение первой группы пациентов с контрольной. Далее по SNP, которые показали четкие различия в частотах аллелей в первой группе по сравнению с контрольной, проводятся такие же сравнения, но уже второй группы и той же контрольной группы. Ассоциированными считаются те SNP, которые демонстрировали одинаковые частоты аллелей в обеих группах, и при этом наблюдались четкие и достоверные различия в частотах аллелей между исследуемой и контрольной группами [16].
Развитие радиогеномики, как нового направления, требует совместного участия многих исследовательских коллективов из разных научных центров. Это облегчит создание более качественных и больших по численности исследуемых когорт для GWAS
исследований. Также появится возможность (как уже отмечалось выше) проводить подтверждающие исследования на других популяциях. В 2009 году несколькими ведущими исследовательскими группами был создан "Международный радиогеномный консорциум", задача которого способствовать сотрудничеству и объединению усилий исследователей разных лабораторий и исследовательских центров, с целью повышения качества полученных результатов [26, 27].
Первыми результатами таких объединенных GWAS исследований было выявление выраженной ассоциации SNP ге2268363 (OR = 7, Р = 5.4*
10-8) в гене Р8ИЯ с побочной реакцией от лучевой терапии в виде эректильной дисфункции у афроамериканских пациентов с раком простаты. Ген кодирует рецептор фоликулостимулирующего
гормона, нарушение сигнального пути которого может приводить к нарушению сперматогенеза и бесплодию [15].
В результате трехстадийного GWAS исследования испанской, британской и североамериканской когорт пациентов с раком простаты было обнаружено, что ге104972703 в гене ТЛЫС1 имеет четкую ассоциацию (OR = 6.6, Р = 4.6* 10-11) с лучевыми реакциями общего характера. Белковый продукт гена ТЛЫС1 участвует в образовании миобластов при формировании миотубов, т.е. важен для регенерации мышечных волокон [10].
При исследовании когорты, насчитывающей около 800 пациентов с раком простаты, лучевые реакции в виде ректальных кровотечений были ассоциированы с полиморфизмами ге7120482 ^=3.1, Р=4.6 * 10-11) и ^17630638 ДО = 2.9, Р = 6.9 * 10-7) в регуляторном регионе гена 8ЬС36Л4 [17]. Белковый продукт гена 8ЬС36Л4 - переносчик аминокислот влияет на активность mTOR-сигнального пути, основная функция которого - регуляция роста и пролиферации клеток. В другом аналогичном исследовании была обнаружена строгая ассоциация полиморфизма ге2788612 (OR = 9.9, Р = 1.1 х 10-11) гена КСЫБЗ с такой поздней реакцией, как ректальное недержание у пациентов с раком
простаты. Ген КСЫВЗ кодирует белок - ионный канал, который обильно экспрессируется в клетках гладкой мускулатуры прямого кишечника [3].
Естественно, что большие усилия радиогеномных исследователей направлены на поиск генетических вариантов, ассоциированных с развитием лучевых реакций, возникающих при радиотерапии больных раком молочной железы. Одним из таких исследований был анализ ассоциаций на когорте, состоящей из 2000 пациенток, у которых наблюдались поздние реакции, такие как фиброз и телеангиэктазия. В результате выявлены ассоциации с полиморфизмами в гене Т^¥а [25]. В другом подобном исследовании обнаружены ассоциации (OR = 3.2, Р = 0.012) полиморфизма ге1139793 в гене ТХЫЕВ2 с подкожными фиброзами. Ген ТХЫЯВ2 кодирует фермент тиоредоксин редуктазу-2, который играет важную роль в защите клеток от оксидативных стрессов [29].
Таким образом, развитие лучевых реакций и повреждений может быть ассоциировано не только с изменениями в генах, белковые продукты которых активируются в ответ на действие ионизирующего излучения или других агентов (гены репарации, апоптоза, антиоксидантной защиты и пр.), а также в генах, белковые продукты которых постоянно выполняют свои функции в клетке, находящейся в нормальном состоянии. Представленные результаты лишний раз указывает на сложность патогенеза побочных лучевых проявлений и оправдывает целесообразность использования высокопроизводительных полногеномных методов исследования.
Стоит отметить, что при формировании выборок, исследователям приходится преодолевать некоторые проблемы, которые могут затруднить поиск ассоциаций. Во-первых, важно четко различать лучевые реакции и симптомы осложнений сопутствующих заболеваний. Например, у пациентов с раком простаты симптомы нижних мочевых путей и эректильная дисфункция могут быть как побочным эффектом химиолучевого лечения, так и сопутствующими осложнениями данного заболевания. В связи с этим, важно
исключать из сравнительного исследования пациентов, у которых были выявлены данные симптомы еще до начала лечения.
Другой важной проблемой радиогеномных исследований является присутствие в исследуемых выборках пациентов, у которых различия в характере и степени выраженности лучевых реакций обусловлены различиями в химиотерапевтических протоколах, используемых для их лечения. Такие показатели как доза, мощность дозы, объем облучаемого участка, тип источника излучения, тип модификаторов являются очень важными и от них непосредственно зависит степень лучевых реакций. Поэтому необходимо, чтобы пациенты, привлеченные к радиогеномным исследованиям, находились в одинаковых клинических условиях и получали максимально идентичное химиолучевое лечение. Определенные затруднения в выявлении ассоциированных полиморфизмов возникают также в связи с тем, что разные исследовательские учреждения используют различные способы оценки токсичности одних и тех же реакций. Кроме того, не всегда удается проводить долгосрочное наблюдение пациентов (как исследуемой группы, так и контрольной группы), что необходимо для поиска молекулярных маркеров - предикторов поздних реакций, которые могут возникать спустя несколько месяцев и даже несколько лет после лечения [14]. Заключение
Радиогеномика на сегодняшний день является актуальным и перспективным направлением, так как использование в клинической практике новых генетических маркеров, прогнозирующих развитие радиационных повреждений, позволит значительно повысить эффективность персонифицированного химиолучевого лечения. Однако, многие аспекты, касающиеся патогенеза различных лучевых реакций и повреждений, еще требуют более детального изучения. Для этого необходимо участие еще большего количества исследовательских коллективов со всего мира и привлечение самых современных и высокопроизводительных методов генетического анализа.
Список литературы
1. Климанов В.А.радиобиологическое и дози-метрическое планирование лучевой и радионуклидной терапии. Часть 2. Лучевая терапия пучками протонов, ионов, нейтронов и пучками с модулированной интенсивностью, стереотаксис, брахитерапия, радионуклидная терапия, оптимизация, гарантия качества: учебное пособие. М.: НИЯУМИФИ, 2011. 604 с.
2. Andreassen C.N., Alsner J. Genetic variants and normal tissue toxicity after radiotherapy: a systematic review. Radiother Oncol. 2009. V. 92. No. 3. P. 299-309.
3. Barnett G.C., Thompson D., Fachal L. A genome wide association study (GWAS) providing evidence of an association between common genetic variants and late radiotherapy toxicity. Radiother Oncol. 2014. V. 111. No. 2. P. 178-185.
4. Bentzen S.M., Overgaard M. Relationship between early and late normal-tissue injury after postmastectomy radiotherapy. Radiother Oncol. 1991. V. 20. No. 3. P. 159-165.
5. Burnet N.G., Nyman J., Turesson I., et al. Improving radiotherapy cure rates by predicting normal tissue tolerance from in vitro cellular radiation sensitivity. Radiother Oncol. 1994. V. 33. P. 228-238.
6. Clarke G.M., Anderson C.A., Pettersson F.H., et al. Basic statistical analysis in genetic case-control studies. Nat Protoc. 2011. V. 6. No. 2. P. 121-133.
7. Damaraju S., Murray D., Dufour J., et al. Association of DNA repair and steroid metabolism gene polymorphisms with clinical late toxicity in patients treated with conformal radiotherapy for prostate cancer. Clin Cancer Res. 2006. V. 12. No. 8. P. 2545-2554.
8. Edvardsen H., Tefre T., Jansen L., et al. Linkage disequilibrium pattern of the ATM gene in breast cancer patients and controls; association of SNPs and haplotypes to radio-sensitivity and post-lumpectomy local recurrence. Radiat Oncol. 2007.V. 2. No. 2. P. 25.
9. Erichsen H.C., Chanock S.J. SNPs in cancer research and treatment. Br J Cancer. 2004 V. 90. No. 4. P. 747-751.
10. Fachal L., Gomez-Caamano A., Barnett G.C. A three-stage genome-wide association study identifies a susceptibility locus for late radiotherapy toxicity at 2q24.1. Nat Genet. 2014. V. 46. No. 8. P. 891-894.
11. Gatti R.A., Berkel I., Boder E., et al. Localization of an ataxia-telangiectasia gene to chromosome 11q22-23. Nature. 1988. V. 336. No. 6199. P. 577-580.
12. Hayden E.C. Technology: The $1,000genome. Nature. 2014. V. 507. No. 7492. P. 294295.
13. Jackson S.P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 2002. V. 23. No. 5. P. 687-696.
14. Kerns S.L., Ostrer H., Rosenstein B.S. Radiogenomics: using genetics to identify cancer patients at risk for development of adverse effects following radiotherapy. Cancer Discov. 2014 V. 4. No. 2. P. 155-165.
15. Kerns S.L., Ostrer H., Stock R. Genome-wide association study to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with the development of erectile dysfunction in African-American men after radiotherapy for prostate cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2010. V. 78. No. 5. P. 1292-1300.
16. Kerns S.L., Stock R., Stone N., et al. A 2-stage genome-wide association study to identify single nucleotide polymorphisms associated with development of erectile dysfunction following radiation therapy for prostate cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2010. V. 85. No. 1. P. e21-28.
17. Kerns S.L., StockR.G., Stone N.N. Genome-wide association study identifies a region on chromosome 11q14.3 associated with late rectal bleeding following radiation therapy for prostate cancer. Radiother Oncol. 2013. V. 107. No. 3. P. 372-376.
18. Mangoni M., Bisanzi S., Carozzi F., et al. Association between genetic polymorphisms in the XRCC1, XRCC3, XPD, GSTM1, GSTT1, MSH2, MLH1, MSH3, and MGMT genes and radiosensitivity in breast cancer patients. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2011. V. 81. No. 1. P. 5258.
19. Pollard J.M., Gatti R.A. Clinical radiation sensitivity with DNA repair disorders: an overview. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2009. V. 74. No. 5. P. 1323-1331.
20. Polo S.E., Jackson S.P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes Dev. 2011. V. 25. No. 5. P. 409-433.
21. Rosenstein B.S. Radiogenomics: Identification of Genomic Predictors for Radiation Toxicity. Semin Radiat Oncol. 2017. V. 27. No. 4. P. 300-309.
22. Scaife J.E., Barnett G.C., Noble D.J. Exploiting biological and physical determinants of radiotherapy toxicity to individualize treatment. Br J Radiol. 2015. V. 88. No. 1051. Article ID 20150172.
23. Schmitz A., Bayer J., Dechamps N., et al. Heritability of susceptibility to ionizing radiation-induced apoptosis of human lymphocyte subpopulations. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2007. V. 68. No. 4. P. 1169-1177.
24. Surowy H., Rinckleb A., Luedeke M., et al. Heritability of baseline and induced micronucleus frequencies. Mutagenesis. 2011. V. 26. No. 1. P. 111-117.
25. Talbot C.J., Tanteles G.A., Barnett G.C. A replicated association between polymorphisms near TNF alpha and risk for adverse reactions to radiotherapy. Br J Cancer. 2012. V. 107. No. 4. P. 748-753.
26. West C., Rosenstein B.S. Establishment of a radiogenomics consortium. Radiother Oncol. V. 94. No. 1. P. 117-118.
27. West C., Rosenstein B.S., Alsner J., et al. Establishment of a Radiogenomics Consortium. Int J Radiat Oncol Biol Phys. V. 76. No. 5. P. 1295-1296.
28. West C.M., Barnett G.C. Genetics and genomics of radiotherapy toxicity: towards prediction. Genome Med. 2011. V. 3. No. 8. P. 52.
29. Zhao W., Diz D.I., Robbins M.E. Oxidative damage pathways in relation to normal tissue injury. Br J Radiol. 2007. V. 80. Spec No. 1. S23-31.
