CC BY
43
УДК 630*232.311.3
МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ИЗМЕНЧИВОСТИ КЛОНОВ ПЛЮСОВЫХ ДЕРЕВЬЕВ PINUSSYLVESTRIS ПО ISSR-МАРКЕРАМ
Т.Н. Милютина, О.В. Шейкина, П.С. Новиков
Марийский государственный технический университет 424000 Йошкар-Ола, ул. пл. Ленина, 3 E-mail: milutina tanja@;mail.ru
Исследования выполнены в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы научно-исследовательские работы по лоту «Проведение научных исследований целевыми аспирантами по следующим областям:- общая биология и генетика;- физико-химическая молекулярная и клеточная биология;- фундаментальная медицина и физиология» шифр (2010-1.3.2-141-022_12).
Проведены исследования генетической изменчивости клоновых потомств плюсовых деревьев Pinus sylvestris на коллекционном участке. С использование 7 ISSR маркеров было обнаружено 152 полиморфных локуса, при этом количество локусов на праймер варьировало от 16 до 29. Среднее эффективное число аллелей составило 1,634. Параметры генетической изменчивости, измеренные как генное разнообразие по Нею и индекс разнообразия Шеннона, были 0,364 и 0,538 соответственно.
Ключевые слова: Pinus sylvestris, плюсовые деревья, генетическое разнообразие, ISSR маркеры
Research of genetic variation in clonal progeny of Pinus sylvestris plus trees ON the collection stand was performed. A total 152 polymorphic loci were found using 7 ISSR-markers and the number loci per primers was varied from 16 to 29. The mean effective number of allele was 1.634. The parameters of genetic variation measured as Nei's gene diversity and Shannon's index of diversity were found to be 0.364 and 0.538 respectively.
Key words: Pinus sylvestris, plus trees, genetic variety, ISSR markers
ВВЕДЕНИЕ
Лес - основное достояние Республики Марий Эл. По данным Министерства лесного хозяйства Республики Марий Эл хвойные леса занимают 49,1 % от покрытой лесной растительностью площади, и одной из главных лесообразующих пород является сосна обыкновенная. Одним из главных принципов неистощительного природопользования должно быть максимальное сохранение генетического разнообразия в процессе их использования и искусственного воспроизводства (Алтухов, 2003; Коропачинский, 1997; Андреев, Горбунов, 2003). Организация лесного семеноводства в Российской Федерации проводится в основном на основе отбора лучших по фенотипу деревьев. Такие деревья получили название «плюсовые». Вся селекционная работа идет на базе материала, полученного от плюсовых деревьев, количество которых ограничено, в следствие чего может наблюдаться снижение генетического разнообразия искусственно создаваемых лесов. Поэтому изучение генетического разнообразия основных лесообразующих пород крайне важно для обоснования долгосрочных программ неистощительного пользования лесными биологическими ресурсами и воспроизводства ценного генофонда при выполнении селекционных мероприятий. В настоящее время трудно переоценить значение генетических исследований для сохранения биологического разнообразия и его воспроизводства при хозяйственном использовании (Алтухов, 2003).
Одним из эффективных методов познания биологического разнообразия является изучение из-
менчивости видов на основе молекулярных маркеров, что является необходимым инструментом для количественной оценки, контроля и мониторинга генетических показателей.
Молекулярно-генетические исследования растений с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) ведутся с середины 80-х годов (Saiki, 1985). ДНК-маркеры, зарекомендовали себя как очень полезный инструмент в лесном хозяйстве ведущих стран Европы, США, Китая, Кореи и Японии. (Alden, 1987; Rajora, 1998; Nguyen, 2011; Chang, 2007; Jingjie, 2003). При изучении генетического разнообразия, филогенетических исследований, картировании генома и эволюционной биологии положительно зарекомендовали себя ISSR-маркеры. Система маркеров под названием InterSimple Sequence Repeats (ISSR) была сравнительно недавно разработана как анонимный, RAPD-подобный подход, с использованием которого анализируется полиморфизм ДНК в многочисленных областях рассеянных по различным регионам ДНК (особенно в ядерном геноме), и который не дает характеристики индивидуальных последовательностей, но вместе с тем - малозатратный и хорошо воспроизводимый метод (Gupta, 1994; Zietkiewicz, 1994; Харченко, 2006).
Очень высокая изменчивость и большая "картографическая плотность" по сравнению с RFLP- и RAPD-маркерами делают этот доминантный, основанный на микросателлитах, молекулярный комплекс идеальным для проведения генетического картирования видов (Nagaoka, Ogihara, 1997). Эти особенности, комбинированные с большей надежностью и повторяемостью в экспериментах и
меньшая склонность к полиморфизму, вызванному условиями эксперимента или различной концентрацией ДНК между исследованными образцами, делают возможность их широкого использования в исследованиях генетического изменения среди очень близко связанных индивидов и в классификации сортов культурных растений (Fanget Roose, 1997; Nagaoka, 1997). С помощью ISSR-маркеров было изучено множество сельскохозяйственных культур, которые включают рис (Joshi, 2000), пшеницу (Nagaoka, Ogihara, 1997), просо (Salimath, 1995), виноград (Ajibade, 2000), картофель (Huang, Sun, 2000) и подорожник (Wolff, Morgan-Richards, 1998). Преимущества ISSR анализа по сравнению с другими маркерами было подчеркнуто в исследованиях разных ученых. Было установлено, что ISSR анализ более информативен и воспроизводим, чем изоферментный анализ, RFLP и RAPD в изучении генетического разнообразия (Fang, 1997; Salimath, 1995). Необходимо отметить, что для изучения древесных растений применение ISSR маркеров ограничено (Li Hui-yu, 2005; Quack, 2004 и др.). В России изменчивости сосны по ISSR маркерам пока не изучена.
Цель работы заключалась в изучении генетической изменчивости клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной на коллекционно - маточном участке на основе проведения полимеразной цепной реакции с ISSR праймерами. Для реализации сформулированной цели требовалось решить сле-
дующие задачи:
1) Сбор образцов и выделение нативной ДНК;
2) Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР);
3) Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР;
4) Обработка полученных электрофореграмм и расчет основных параметров характеризующих уровень генетической изменчивости: эффективное число аллелей, генетическое разнообразие по Нею, индекс Шеннона.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектом исследования являлись клоновые потомства плюсовых деревьев сосны обыкновенной, растущие на коллекционно-маточном участке (КМУ) в Республике Марий - Эл. Было отобрано и проанализировано 36 потомств плюсовых деревьев сосны обыкновенной.
В качестве исходного материала для экстракции ДНК использовалась свежая хвоя. За основу бралась методика с применением 2*СТАВ-буфера (модификация методики Doyle J.J., Doyle J.L., 1991).
Для изучения генетической изменчивости клонов плюсовых деревьев использовали 7 ISSR прай-меров, характеризующиеся высоким полиморфизмом и отличающиеся отчетливыми идентифицируемыми полосами (табл. 1).
Таблица 1 - Характеристика К8К-праймеров использованных для изучения генетической изменчивости клонов
плюсовых деревьев
Праймер Секвиенс (5'-3') Рекомендуемая температура отжига, °С
(СА)бАУТ CACACACACACAAGCT 60
(CA)6AG2 CACACACACACAAGG 60
(CA)6GT CACACACACACAGT 60
(СА)бАС CACACACACACAAC 60
(AG)8T AGAGAGAGAGAGAGAGT 60
(GA)8T GAGAGAGAGAGAGAGAT 65
(AG)8YT AGAGAGAGAGAGAGAGGC T 65
Полимеразную цепную реакцию проводили в следующих условиях: реакционная смесь объемом 10 мкл содержала: 0,1 мкл Taq полимеразы; 1 мкл ДНК-матрицы; 0,1 мкл праймера; 0,2 мкл dNTPs; 1 мкл буфера и добавляли стерильную воду 7,6 мкл. Для проведения ПЦР был использован набор реактивов Encyclo PCR kit («Евроген», Россия). Режим амплификации: 5 мин денатурация при 94 °С, 0,5 мин. Денатурация при 94°С, 45 сек. Отжиг (60-65°С), 2 мин. элонгация при 72°С, и 7 мин. Достройка при 72°С , 45 циклов амплификации. ПЦР проводили в тонкостенных пробирках на амплифи-каторе MJ Mini™ Gradient Thermal Cycler (BIORAD).
Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводилось в электрофоретической камере (Power PacTM Universal (BIO-RAD)). Электрофорез ДНК проводили в 1,5 % агарозном геле, с добавлением этидия бромида при напряжении 70 mV в течение 2-3 часов.
Визуализацию ДНК, обработку и анализ полученных изображений проводили с помощью системы гель-документации GelDoc 2000 (BIO-RAD) с использованием программного пакета Quantity One® Version 4.6.3. Математическую обработку данных проводили в среде POPGENE Version 1.32.
ISSR фрагменты рассматривали как доминантные маркеры, отмечая присутствие или отсутствие каждого маркера, соответственно как 1 или 0. Оценивали только четкие и воспроизводимые полосы, независимо от их интенсивности на геле, соответствующих определенным в таблице 2 фрагментам и математически обрабатывались в среде POPGEN (Yeh, 1997). На основании полученных данных рассчитывались относительные частоты фрагментов. Полученные частоты ISSR фрагментов использовались для оценки основных параметров генетической изменчивости клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной. Для этого были рассчитаны следующие параметры оценки генетической измен-
чивости: наблюдаемое число аллелей - па, эффективное число аллелей - п., общее генетическое разнообразие - И (индекс Нея) и индекс Шеннона - I.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
По результатом 188Я анализа ДНК, выделенной
из хвои клонов плюсовых деревьев сосны, было установлено, что 7 188Я праймеров позволяют определить 152 амплифицируемых фрагмента, из которых 29 фрагментов приходится на (ЛО)8УТ, 20 на (СЛ)6АС, 24 фрагмента приходиться на (вЛ)8Т и (СЛ)6ЯУ, 22 на (СЛ)6ЯО, 16 на (СЛ)6(вТ), 17 на (Лв)8Т (табл. 2).
Таблица 2 - Результаты ПЦР ДНК клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной
№ п.п. Праймер Количество полиморфных фрагментов Размеры амплифицируемых фрагментов, Ьр
1 2 3 4 5 6 7 (ЛО)8УТ (СЛ)6АС (ОЛ)8Т (СЛ)6ЯУ (СЛ)6ЯО (СЛ)6(ОТ) (ЛО)8Т 29 20 24 24 22 16 17 130 - 1800 200 - 1700 250 - 2050 160 - 1360 200 - 2150 190 - 1250 170 - 1300
Все использованные праймеры оказались высоко изменчивыми, так как все обнаруженные фрагмент ДНК были полиморфными. Длина амплифи-цированных фрагментов ДНК у разных праймеров варьировала от 130 до 2150 пар нуклеотидов. Пример электрофореграммы продуктов ПЦР с прайме-ром (Лв)8УТ приведен на рисунке 1.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 М
Таблица 3 - Основные показатели уровня генетической изменчивости сосны обыкновенной по маркерам
Рисунок 1 - Результат ПЦР-анализа ДНК сосны обыкновенной с праймером (ЛС)8УТ: 1-18 - номера образцов ДНК, М - маркер молекулярных размеров (СибЭнзим, 100 Ьр + 3,0 кЬ)
После обработки полученных электрофоре-грамм были рассчитаны частоты встречаемости аллелей обнаруженных локусов. Полученные частоты 188Я фрагментов использовались для оценки основных параметров генетической изменчивости клонов плюсовых деревьев сосны обыкновенной. Расчеты показали, что в исследуемой группе потомства плюсовых деревьев эффективное число аллелей (п.) составило - 1,634, общее генетическое разнообразие (И) - 0,364, а индекс Шеннона (I) составил - 0,538 (табл. 3).
Показатели генетической изменчивости В среднем по всем праймерам
Полиморфизм (Р), % 100,0
Эффективное число аллелей (пе) 1,634
Генетическое разнообразие по Нею (И) 0,364
Индекс Шеннона (I) 0,538
Таким образом, экспериментальные исследования показали, что потомство плюсовых деревьев сосны обыкновенной, представленное на коллекционно - маточном участке в Республике Марий Эл, характеризуется достаточно высоким уровнем генетической изменчивости по 188Я маркерам. Выполненная работа позволят внести определенный задел в исследования биоразнообразия сосны обыкновенной в данной Республике.
ВЫВОДЫ
В результате приведенных исследований с использованием 7 188Я праймеров было выявлено 152 полиморфных фрагментов ДНК. Длина амплифи-цированных фрагментов ДНК у разных праймеров варьировала от 2150 до 130 пар нуклеотидов, а количество фрагментов у праймеров варьировало от 16 до 29.
На основании лабораторных опытов по изучению изменчивости сосны обыкновенной установлено, что в изучаемой группе потомства плюсовых деревьев эффективное число аллелей (Пе) составило - 1,634, общее генетическое разнообразие (И) -0,364, а индекс Шеннона (I) составил - 0,538. Полученные результаты свидетельствуют о высоком уровне генетической изменчивости, потомства плюсовых деревьев сосны обыкновенной на коллекционно - маточном участке.
Полученные результаты показывают, что применение метода ISSR анализа позволяет судить, о уровне генетической изменчивости потомства плюсовых деревьев сосны обыкновенной.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Алтухов, Ю.П. Генетические процессы в популяци-ях:3-е издание, перераб. и доп.-ИКЦ «Академкнига», 2003.-431с. Харченко, П.Н.; Глазко, В.И. ДНК-технологии в развитии агробиологии. - М.: Воскресенье, 2006, - 480 с. Ajibade, S.R. Inter-simple sequence repeat analysis of genetic relationships in the genus Vigna / Ajibade, S.R., N.F. Weeden & S.M. Chite // Euphytica. - 2000. - 111: 47-55.
Alden, J. Genetic diversity and population structure of Picea glauca on an altitudinal gradient in interior Alaska. / Alden, J., Loopstra // Can J Forest Res -1987. - 17: 1519-1526. Chang, C.S. Mating system and genetic diversity in the threatened plant, Kirengeshoma palmata (Saxifra-gaceae) in Korea / Chang C. S., Choi D. Y., Kim H., Kim Y. S., Park T. Y. // Journal of Plant Research. -2007. - 120: 149-156. Doyle, J.J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue /Doyle J.J., Doyle J.L. // Phytochemical Bulletin.-1991.-№ 19.-Р. 11-15. Fang, D.Q & M.L. Roose, 1997. Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeat markers. Theor Appl Genet 95: 408-417. Gupta, M. Amplification of DNA markers from evolution-arily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats / Gupta, M., Y-S. Chyi, J. Romero-Severson & J.L. Owen // Theor Appl Genet. - 1994. -89: 998-1006.
Huang, J. Genetic diversity and relationships of sweet potato and its wild relatives in Ipomoea series Batatas (Convolvulaceae) as revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) and restriction analysis of chlo-roplast DNA / Huang, J. & S.M. Sun // Theor Appl Genet. - 2000. - 100: 1050-1060. Jingjie, H. Genetic Analysis of Sweetpotato and Wild Relatives using Inter-simple Sequence Repeats (ISSRs) / Jingjie H., Makoto N., Antonio G.L., Toshikazu K., Ta-tsuhito F. // Breed. Sci. - 2003. - 53: 297-304.
Joshi, S.P. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza / Joshi, S.P., V.S. Gupta, R.K. Aggarwal, P.K. Ranjekar & D.S. Brar // Theor Appl Genet. - 2000. - 100: 1311-1320.
Li Hui-yu Genetic variation and division of Pinus sylvestris provenances by ISSR markers /Li Hui-yu, Jing Jing, Liu Gui-frng, Ma Xu-jun, Dong Jing-xiang, Lin Shi-jie// Journal of Forest Research.- 2005.-16(3).- P. 216-218.
Nagaoka, T. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers / Nagaoka, T. & Y. Ogihara // Theor Appl Genet. - 1997. - 94: 597-602.
Nguyen, M.T. Genetic diversity of an endangered species, Fokienia hodginsii (Cupressaceae) / Nguyen M.T., Nguyen T. Phuong Trang, Nguyen T.H. // African Journal of Biotechnology - 2011. - 10(71): 1583815844.
Quack, M. Molekular geneische Untersuchungen zur Vari-abiliter der Fichte (Picea abies [L.] Karst.) in Deutschland / M. Quack.-Trier, 2004.-279P.
Rajora, O.P. Genetic diversity and population structure of disjunct Newfoundland and central Ontario populations of eastern white pine (Pinus strobus). / Rajora O.P., DeVerno L., Mosseler A., Innes DJ Am. // J. Bot. - 1998. - 76: 500-508.
Saiki, R. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia / R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona and al. // Science. - 1985. - V. 230. P. - 1350-1354.
Salimath, S.S. Assessment of genome origins and genetic diversity in the genus Eleusine with DNA markers / Salimath, S.S., A.C. de Oliveira, I.D. Godwin & J.L. Bennetzen // Genome. - 1995. - 38: 757-763.
Wolff, K. PCR markers distinguish Plantago major subspecies / Wolff, K. & M. Morgan-Richards // Theor Appl Genet. - 1998. - 96: 282-286.
Yeh, F.C. POPGENE Version 1.32. Ag/For Molecular Biology and Biotechnology Centre / F.C. Yeh, R. Yang, T. Boyle // University of Alberta and Center for International Forestry Research 1997.
Zietkiewicz, E. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) - anchored polymerase chain reaction amplification / Zietkiewicz, E., A. Rafalski & D. La-buda // Genomics. - 1994. - 20: 176-183.
Поступила в редакцию 23 декабря 2011 г. Принята к печати 16 мая 2013 г.
