CC BY
224
КАРДИОЛОГИЯ
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК 616.12-008.331.1-056.7
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БОЛЬНЫХ ЭССЕНЦИАЛЬНОЙ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ
О.В. Шевченко1, А.А. Свистунов2, Е.Н. Бычков1, В.Б. Бородулин3,
ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет»1,
Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова2, ООО «Геночип»3, г. Саратов
Шевченко Ольга Валерьевна - e-mail: shevchenkoov@inbox.ru
Важным направлением современной кардиологии является разработка принципов эффективной индивидуализированной антигипертензивной терапии на основе комплексного изучения молекулярно-генетических и биохимических маркеров артериальной гипертензии (АГ). В большинстве случаев мультифакториальная природа эссенциальной АГ обусловлена генетическим полиморфизмом генов, продукты которых участвуют в регуляции артериального давления - ренин-ангиотензин-альдостероновой, брадикининовой и гомоцистеиновой систем. Представлены данные по выявлению полиморфизмов генов ACE, AGTR1, AGTR2, AGT, REN, BKR2, MTHFR, ADRB2 с использованием методики гидрогелевых биочипов у больных с разной стадией АГ.
Ключевые слова: артериальная гипертензия, полиморфизм генов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, ДНК-биочипы.
An important tendency of the modern cardiology is to develop principles of effective, individualized antihypertensive therapy on the basis of a integrated study of molecular genetic and biochemical markers of arterial hypertension (AH). In most cases, multifactorial nature of essential hypertension is caused by genetic polymorphism of genes whose products are involved in regulating blood pressure - renin-angiotensin-aldoste-rone, and bradikinin and gomotsistein systems. It provides data to identify gene polymorphisms ACE, AGTR1, AGTR2, AGT, REN, BKR2, MTHFR, ADRB2 using the technique of hydrogel microarray in patients with different stages of hypertension.
Key words: hypertension, gene polymorphisms of the renin-angiotensin-aldosterone system,
DNA- biochips.
Введение
Распространенность АГ в мире увеличивается в среднем на 3-4% в год, что соответствует масштабам эпидемии [1]. Установлено, что АГ при остром инфаркте миокарда встречается в 85% случаев, при постинфарктном кардиосклерозе
- в 67%, при остром нарушении мозгового кровообращения
- в 95%, а при сочетании инфаркта и инсульта - в 91% [2]. Несмотря на открытие новых классов антигипертензивных препаратов, разработку национальных и международных рекомендаций, число пациентов, страдающих от эссенци-альной АГ и погибающих от ее осложнений, продолжает нарастать. Артериальной гипертензией страдает около миллиарда людей по всему миру, ежегодно она становится причиной 7 млн смертей. Возможность изучения молекулярногенетических основ патогенеза и индивидуализированной диагностики эссенциальной АГ явилась бы чрезвычайно важным шагом на пути к персонализированной терапии данного заболевания. Технология с использованием ДНК-биочипов позволяет выявлять определенные генетические маркеры на большой выборке больных АГ. Кроме того, методика изучения биологического материала на основе ДНК-биочипов удобна в работе, высокоинформативна и, что немаловажно, - экономически выгодна.
Целью исследования явилась разработка и выявление оптимального набора молекулярно-генетических этиопато-генетических маркеров эссенциальной АГ.
Материалы и методы
Проведено исследование образцов ДНК 65 больных эссенциальной АГ 1-111 стадий (35 женщин и 30 мужчин) в возрасте от 23 до 60 лет, проходящих клиникоинструментальное обследование и лечение в кардиологическом стационаре г. Саратова. Пациенты были разделены на 3 группы: 1-я группа - больные I стадии АГ (20 человек);
2-я группа - больные II стадии АГ (23 человек); 3-я группа -больные III стадии АГ (22 человека).
В настоящее время разработаны и внедрены в клиническую медицину фармакогенетические анализы, позволяющие считывать и обрабатывать большие объемы биологической информации. В работе использовалась методика, разработанная в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, основанная на гибридизации в микроячейках биологического чипа. Технология анализа генетического полиморфизма предполагает предварительную мультиплексную амплификацию фрагментов ДНК с использованием флуоресцентно меченых праймеров и добавление меченого продукта на микрочип, где происходит его гибридизация с иммобилизированными в геле зондами. Ячейки с иммобилизованными зондами на планшете располагаются упорядоченными рядами, причем каждая ячейка содержит уникальный зонд и является индивидуальной пробиркой для проведения реакции. Специальное программное обеспечение вычисляет интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках, определяет, в каких ячейках образовались устойчивые комплексы, и выдает отчет о наличии в исследуемом образце специфичной мишени. Описанный метод позволяет анализировать до 50 полиморфных вариантов с точностью более 99%. Использование биологических микрочипов как метода анализа генома имеет преимущества при изучении патогенетических механизмов эссенциальной АГ, а также дает возможность изу-
чать метаболизм антигипертензивных препаратов (возможность изучения полиморфизмов генов на чипах в ходе исследования предоставлена ООО «Геночип», г. Саратов).
В исследовании использовался «Кардио» биочип, позволяющий изучать полиморфизмы генов ангиотензинпревра-щающего фермента (ACE), рецепторов I-II типов ангиотензина II (AGTR1, AGTR2), ангиотензиногена (AGT), ренина (REN), брадикининовых рецепторов 2-го типа (BKR2), мети-лентетрагидрофолатредуктазы (MTH FR).
Результаты и их обсуждение
Изучены полиморфизмы генов REN (-83G>A), AGT (M235T), AGTR1 (А1166С), AGTR2 (C3123A), BKR2 (-58T>C), MTHFR (C677T), ACE (Del/Del) на «Кардио» биочипе. Представлены примеры гибридизационных картин (рис. 1). Интенсивность свечения гидрогелевых ячеек биочипа отражается в виде информационного окна, в котором величина «столбцов» прямо пропорциональна интенсивности свече-
®&Н || П+> + Ч X X SB 9 • о Пух , Еп^?
* 0 • 0 • 0 0 * at В*5»о< Chw. От-*т П I«6w QnOfWWM 0 30 ю/идак 020 оо«** □ ««•И«**
• о • ©*оо* • • Оо*•ООО • ■ оо • « ООО
итчет (uaraio-cnip) л.ив.лшу 19:из:ю - Группы не определены: 48A>G, 81C>G Группы определены: REN -83G>A (G/A)| AGT М235Т (Т/Г) AGTR1 1166А>С (А/А) AGTR2 3123С>А (С/С) BKR2 -58Т>С (С/С) MTHFR 677С>Т (М/Т) АСЕ (Del/Del) / <v\rlnrnmf>nts and $еМтл«\аНтт\Рабпиий лтлп\В\№1 К «па • Н Саеом>к«с<*г 0Тв<т 0Снмж □ *аст«м
DV'»JiVr%»>WaicV'A<tf(C«<ixto) cWximMi ard vilnjiwttrtptto+i) crciWm&jp«
L.8L.SaCJ' nwa ч ЙИ
ния.
РИС. 1.
Примеры гибридизационных картин, полученных на «Кардио» биочипе.
Мультифакториальная природа эссенциальной АГ нередко обусловлена генетическим полиморфизмом генов, продукты которых обеспечивают различные звенья близко сопряженных патогенетических путей, участвуя в регуляции артериального давления (АД) - ренин-ангиотензин-
альдостероновой, гомоцистеиновой и брадикининовой систем (рис. 2).
РИС. 2.
Молекулярно-генетические маркеры, лежащие в основе развития эссенциальной артериальной гипертензии.
КАРДИОЛОГИЯ
КАРДИОЛОГИЯ
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Повышенная активность ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, как циркулирующей в крови, так и тканевой, считается важнейшим фактором патогенеза АГ и атеросклероза [3, 4]. Значимым патогенетическим фактором эссенциальной АГ является дисбаланс, который происходит внутри симпато-адреналовой системы [5, 6]. В развитии гиперактивности симпатической нервной системы имеют значение также стрессовые факторы, гиподинамия, курение. Высокая активность симпатической нервной системы способствует высвобождению в почках ренина и вызывает активацию всей ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, что приводит к росту общего периферического сопротивления сосудов, задержке ионов натрия и молекул воды и, в конечном итоге, повышению АД. Ангио-тензинпревращающий фермент гидролизует ангиотензин-! в вазопрессор ангиотензин-И, играет важную роль в регуляции кровяного давления и поддержании баланса электролитов, также влияет на фибринолиз, активацию и агрегацию тромбоцитов. В патогенезе эссенциальной АГ не исключена роль калликреин-кининовой системы, главным эффектор-ным компонентом которой является брадикинин. Эффекты кининов опосредуются их связыванием с рецепторами бра-дикинина, которые, в свою очередь, способствуют синтезу коллагена, сокращению или расслаблению гладкой мускулатуры, повышению сосудистой проницаемости, а также стимуляции высвобождения основного эндотелиального фактора релаксации - оксида азота (N0). N0 образуется из 1_-аргинина с помощью семейства ферментов N0-синтаз путем окисления терминального атома азота гуанидина. Эндотелиальная N0-синтаза 3-го типа, участвуя в синтезе N0 эндотелием, обеспечивает регуляцию сосудистого тонуса, а, следовательно, артериального давления [7]. Гипергомоцистеинемия может способствовать оксидатив-ному стрессу за счет того, что перекисные радикалы, образующиеся при аутоокислении гомоцистеина, могут переводить N0 в форму пероксинитритов, не обладающую вазоди-латирующими совйствами [8]. К увеличению концентрации гомоцистеина в плазме крови ведет мутация гена 5,10-мети-лентетрагидрофолатредуктазы, которая обусловливает дефект витамин В12-зависимого реметилирования гомоцистеина в метионин [9]. Таким образом, адренергическая, ренин-ангиотензин-альдостероновая, брадикининовая и гомоцистеиновая системы тесно сопряжены последовательными и параллельными химическими реакциями. С помо-^ щью методов генетического тестирования появилась возможность определить состояние всей системы в целом.
Представлен анализ распределения частот гомозигот по мутантному аллелю некоторых исследуемых полиморфизмов генов у больных НИ стадий эссенциальной АГ (таблица).
Стадия АГ Поли- морфизм гена AGT 235М—T REN -83G>A AGTR1 1166A—C AGTR2 3123C—A BKR2 -58T>C ACE I / D MTHFR 677C—>T
I стадия, n=20 3% 16% 12% 6% 7%
II стадия, n=23 - 1,5% 10% 6% 6,3% 9,7%
III стадия, n=22 15,3% 2% 10,7% 14% 10% 27,6% 8,5%
ТАБЛИЦА.
Распределение частот гомозигот по мутантному аллелю полиморфизмов генов у больных с разной стадией АГ (п=65)
Различные варианты гена ангиотензиногена обуславлива-
ют различную физиологическую активность ангиотензина-II. Полиморфизм 235T гена ангиотензиногена (AGT) встречается в европейской популяции с частотой 15-20%. Многие из доступных литературных источников демонстрируют ассоциацию генотипа Т/Т с артериальной гипертензией. В нашем исследовании из 65 изученных образцов ДНК по полиморфизму M235T гена AGT генотип Т/Т обнаружен в двенадцати образцах, причем десять из них принадлежали больным
3-й группы (III стадия АГ), два образца - больным 1-й группы (I стадии АГ).
Наиболее изученный полиморфизм гена AGTR1 представляет собой замену аденина на цитозин в позиции 1166 (А1166С). В исследовании из всех изученных образцов ДНК по полиморфизму А1166С гена AGTR1 в восьми образцах обнаружен генотип С/С. Причем семь образцов ДНК принадлежали больным 3-й группы (III стадия АГ), один образец - больному 2-й группы (II стадия АГ). Существуют работы, показывающие ассоциацию С-аллеля и генотипа С/С гена AGTR1 с предрасположенностью к АГ [10], однако есть исследования, не подтверждающие такую зависимость.
Активность ангиотензинпревращающего фермента в крови связана с наличием варианта D - делеции Alu-последовательности внутри интрона гена АСЕ. Существуют данные, что носители I/I генотипа имеют самый низкий уровень фермента, у людей с D/D генотипом он максимален, генотип I/D характеризуется промежуточными уровнями фермента [11]. Ряд крупных исследований демонстрирует, что наличие генотипа D/D является фактором риска развития сердечно-сосудистой патологии. Из изученных образцов ДНК двадцать шесть имели полиморфизм D/D, причем восемнадцать принадлежали больным 3-й группы (III стадия АГ).
При мутации гена 5-, 10-метилентетрагидрофолатредук-тазы происходит замена цитозина на тимин в 677 нуклеотиде (С677Т). Это приводит к изменению в структуре и снижению активности фермента метилентетрагидрофолатредук-тазы. При этой патологии наблюдается стойкая гипергомо-цистеинемия, повышается риск развития сердечнососудистых заболеваний [12]. При изучении полиморфизмов гена 5-, 10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) четких закономерностей в распределении мутации 677С—Т нам выявить не удалось. Гомозиготы по мутантному аллелю Т/Т встречались примерно с одинаковой частотой во всех образцах ДНК.
Таким образом, среди больных III стадией АГ по ряду полиморфизмов генов, участвующих в регуляции артериального давления, достоверно чаще встречаются гомозиготы по мутантным аллелям, что может служить причиной признания этих мутаций генетическими маркерами эссенциаль-ной АГ.
Заключение
Проведенный анализ распределения частот некоторых исследуемых полиморфизмов генов у больных эссенциальной АГ свидетельствует о значимости указанных мутантных аллелей в определении патогенетического дизайна заболевания. Использованная в исследовании методика биологических микрочипов имеет существенные преимущества при изучении патогенетических механизмов АГ, высокоинформативна, удобна в работе. Дальнейший многофакторный молекулярно-генетический анализ АГ позволит определить, с одной стороны, роль каждого из патогенетических факта-
ров АГ в формировании заболевания, а с другой стороны, наметить выбор антигипертензивного препарата для каждого больного.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kearney P.M., Whelton M., Renoylds K. et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide. Lancet. 2005. № 365. Р. 217-223.
2. Верткин А.Л., Скотников А.С. Жизнь - театр, а люди в нем - актеры: место антагонистов рецептора ангиотензина в терапии артериальной гипертензии. Consilium Medicum. 2010. № 1.
3. Rupert J.L., Kidd K.K., Norman L.E. Genetic polimorphisms in the Renin-Angiotensin system in high-altitude and low-altitude Native American population. Ann. Hum. Genet. 2003. № 67. Р. 17-25.
4. Naber C.K., Siffer W. Genetics of human arterial hypertension. Minerva. Med.
2004. № 95. Р. 347-356.
5. Глотов А.С., Иващенко Т.Э., Образцова Г.И. и др. Зависимость между возникновением стабильной артериальной гипертензией у детей и полиморфизмом генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем. Молекулярная биология. 2007. № 41. С. 18-25.
6. Dufour C., Casane D., Denton D. Human-chimpanzee DNA sequence variation
in the four major genes of the rennin angiotensin system. Genomics. 2000. № 1. Р. 14-26.
7. Минушкина Л.О. Гены ангиотензинпревращающего фермента, NO-синтетазы и эндотелина-1 и гипертрофия миокарда левого желудочка у больных гипертонической болезнью коренных жителей Якутии. Кардиология.
2005. № 1. С. 41-45.
8. Loscalzo J. The oxidant stress of hyperhomocysteinemia. J. Clin. Invest. 1996. № 98. С. 5.
9. Heux S., Morin F., Lea R.A. The methylentetrahydrofolate reductase gene variant (C677T) as a risk factor for essential hypertension in Caucasians. Hypertens. Res. 2004. № 27. Р. 663-667.
10. Henskens L.H., Spiering W., Stoffers H.E. Effects of ACE I/D and AT1R-A1166C polymorphisms on blood pressure in a healthy normotensive primary care population: first results of the Hippocates study. J. Hypertens. 2003. № 21. Р. 81-86.
11. Бражников В.А. Полиморфные маркеры I/D и G7831A гена фермента, превращающего ангиотензин I, и гипертрофия миокарда у больных артериальной гипертонией. Кардиология. 2003. № 2. С. 44-49.
12. Хубутия М.Ш., Шевченко О.П. Гомоцистеин при коронарной болезни сердца и сердечного трансплантата. М.: Реафарм, 2004. С. 43.
КАРДИОЛОГИЯ
