CC BY
83
YAK 616.858+575+577.1
МАДЖИАОВА E.H., ХАЛИМОВА Х.М., РАИМОВА М.М, MATMYPAAOB Р.Ж., ФАХАРГАЛИЕВА С.Р., ЖМЫРКО Е.В. Кафедра нервных болезней Ташкентской медицинской академии
Институт генетики и экспериментальной биологии растений АН PYз, г. Ташкент, Yзбекистан
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
Резюме. Проведен молекулярно-генетический анализ на наличие ассоциаций с болезнью Паркинсона (БП) полиморфизмов генов GSTM1 (нулевая аллель), GSTT1 (нулевая аллель) у представителей узбекской национальности и определение содержания нейронспецифической енолазы (НСЕ) в сыворотке крови больных болезнью Паркинсона. Всего исследовано 190 образцов ДНК, в том числе 140 образцов ДНК больных БП и 50 образцов ДНК здоровых лиц из группы контроля. Биохимическое исследование проведено у 35 пациентов с длительностью заболевания от 1 года до 15 лет. Анализ полиморфизма генов GSTT1 и GSTM1 выявил значительную гетерогенность по частотам нулевых и ненулевых генотипов у больных БП и здоровых лиц: у больных доля нуль-генотипов гена GSTT1 на 52 % выше, и по гену GSTM1 на 45,1 % выше, чем у здоровых лиц. Повышенный уровень НСЕ отмечался в 69% случаев БП, чаще у больных со смешанной и акинетико-ригидной формой заболевания.
Ключевые слова: болезнь Паркинсона, гены детоксикации, GSTT1, GSTM1, нейронспецифическая енолаза.
Болезнь Паркинсона (БП) — одно из наиболее часто встречающихся нейродегенеративных заболеваний пожилого и старческого возраста. В связи с увеличением средней продолжительности жизни населения болезнь Паркинсона, несомненно, оказывает влияние на показатели качества жизни населения и приводит к значительным социально-экономическим потерям [1—3].
Предположения о причине возникновения этой болезни различны. Согласно современным взглядам, около 10 % всех случаев болезни Паркинсона имеют наследственную моногенную основу, тогда как абсолютное большинство пациентов представлены спорадической формой БП мультифакториальной природы [4—10]. Определен целый ряд генов предрасположенности к болезни Паркинсона (гены систем клеточной детоксикации и антиоксидантной защиты GSTT1, GSTM1, GSTP1, гены транспорта и метаболизма дофамина, митохондриальный геном и другие), носительство неблагоприятных аллельных вариантов которых достоверно повышает риск заболевания [11 — 15]. Результаты вышеописанных исследований показывают высокую вариабельность частоты встречаемости полиморфизма генов-кандидатов в развитии болезни Паркинсона у представителей разных популяций.
В последние годы появились научные исследования по изучению нейрон-специфической енолазы (НСЕ) при заболеваниях, сопряженных с вовлечением в патологический процесс нервной ткани, где количественное определение белка в сыворотке крови дает ценную
информацию о степени выраженности повреждения нейронов и нарушении общей целостности гематоэн-цефалического барьера (ГЭБ). В их числе инсульты, эпилепсия, травмы головного мозга. НСЕ может быть индикатором гибели нейронов, и определение его в крови больных паркинсонизмом может быть дополнительным диагностическим маркером. С этих позиций представляет интерес изучение диагностической значимости НСЕ у больных с болезнью Паркинсона.
Учитывая немаловажную роль системы детоксика-ции в нейтрализации вредных веществ, поступающих в организм, поиск генетических маркеров индивидуальной чувствительности людей, подвергающихся воздействию вредных веществ, на основе анализа полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков представляется актуальным.
Цель исследования: при помощи комплексного анализа клинических, молекулярно-генетических и биохимических данных изучить факторы, определяющие развитие болезни Паркинсона.
Методы исследования
Исследования проведены на кафедре нервных болезней Ташкентской медицинской академии (ТМА) и в Центре геномных технологий ИГиЭБ растений.
Проведен тщательный клинико-анамнестический и молекулярно-генетический анализ данных 140 больных болезнью Паркинсона. В качестве контрольной группы молекулярно-генетический анализ был проведен
у 50 больных хронической ишемией мозга без признаков паркинсонизма сопоставимого возраста. При отборе конкретных лиц учитывали их национальную принадлежность — все пациенты являются лицами узбекской национальности в возрасте от 30 до 80 лет, с клинической картиной болезни Паркинсона. Коллекция материалов была проведена у неродственных лиц. Группу сравнения составили 50 лиц, не страдающих данной патологией.
Диагностика паркинсонизма и его нозологической формы проведена согласно критериям банка головного мозга общества болезни Паркинсона Великобритании (Gibb, Lees, 1988). В случае необходимости для окончательной дифференциальной диагностики нозологической формы паркинсонизма проведено нейровизуализационное (КТ, МРТ) исследование.
Клиническая оценка состояния больных включала исследование неврологического и соматического статуса с объективизацией имеющихся неврологических нарушений с помощью шкалы Hoehn & Yahr в модификации Lindvall (1988), Tetrud & Langston (1989), I-III подшкал унифицированной шкалы оценки проявлений паркинсонизма UPDRS (S. Fahn et al., 1987).
Молекулярно-генетические исследования
Данная часть исследований проведена в Центре геномных технологий (ЦГТ) при Институте генетики и экспериментальной биологии растений (ИГиЭБР) Академии наук Республики Узбекистан (АН РУз). В рамках исследования был проведен анализ на наличие ассоциаций с болезнью Паркинсона: полиморфизма генов GSTM1 (нулевая аллель), GSTT1 (нулевая аллель) у представителей узбекской национальности (сравнение состояний генотипа по исследуемым полиморфизмам больных и здоровых по болезни Паркинсона). Материалом для ДНК служила венозная кровь из локтевой вены объемом 1 мл.
Выделение ДНК проводилось по стандартному протоколу выделения ДНК с использованием набора реагентов Diatom™ DNA Prep 200 (производство ООО «Лаборатория ИзоГен»).
Супернатант с ДНК далее подвергался непосредственно генотипированию путем ПЦР-амплификации. Типирование образцов ДНК по генам GSTM1 и GSTT1 проводили с использованием двух пар специфических олигонуклеотидных праймеров с участками генов GSTM1 (F: 5'-tgs-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc; R: 3'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g) и GSTT1 (F: 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg; R: 3'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg). ПЦР-анализ проводили с использованием набора реагентов для ПЦР-амплификации ДНК GenePak™ PCR Core (производство ООО «Лаборатория ИзоГен»).
Гомозиготность по нулевым аллелям (0/0) генов GSTM1 и GSTT1 определяли по отсутствию на электрофореграммах фрагментов размером 131 и 114 п.н. соответственно. Наличие этих фрагментов свидетельствовало о присутствии по крайней мере одной нормальной (без делеции) копии генов (гомо-
%
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
92,0
Z
88,0%
40,0
60,П%
42,9 °
а
12,0 5
z^r
GSTT1 +
GSTT1 0/0 GSTM1 + GSTM1 0/0
■ Больные БП □ Здоровые люди
Рисунок 1. Частота генотипов по нулевым аллелям (0/0) и ненулевым аллелям (+) генов GST у больных болезнью Паркинсона и здоровых лиц (в процентном отношении)
и гетерозиготы, +/+ и +/0). Нулевые аллели генов GSTM1 и GSTT1 свидетельствовали, в свою очередь, о предрасположенности объекта к БП. Для определения размера фрагментов ДНК использовался маркер с начальной отметкой 100 п.н.
Содержание НСЕ в сыворотке крови больных определялось методом иммуноферментного анализа, выполняемого с помощью специфических тест-систем, разработанных на основе соответствующих моноклональных антител, на анализаторе «ALISA» согласно инструкции, прилагаемой к набору. Забор пробы крови осуществлялся из локтевой вены утром натощак в лаборатории ЦП № 2 МСО при МЗ РУз. Данное исследование проведено у 35 пациентов, в том числе у 17 (48,57 %) женщин и 18 (51,42 %) мужчин с длительностью заболевания от 1 года до 15 лет.
В последующем проводилась сравнительная оценка результатов анализов НСЕ у больных по полу, возрасту, а также в зависимости от формы, стадии, темпа про-грессирования заболевания.
Результаты и их обсуждение
Был проведен анализ на наличие ассоциаций БП с нулевыми аллелями генов системы детоксикации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1, кодирующих две формы фермента глутатионтрасферазы — m и q соответственно. rST являются важным компонентом системы биотрансформации, и их дефицит может привести к накоплению веществ, стимулирующих развитие заболевания и участвующих в реализации патогенеза БП.
В группе больных БП частота встречаемости 0/0 полиморфизма для гена GSTM1 составила 57,1 % (80 больных); а для гена GSTT1 — 60 % (84 больных); частота встречаемости «+» полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 — 42,9 и 40 % соответственно, тогда как в группе здоровых лиц частота встречаемости 0/0 полиморфизма составила для гена GSTM1 — 12 % (6 больных); для гена GSTT1 — 8 % (4 больных); частота встречаемости «+» полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 — 88 и 92 % соответственно (рис. 1).
Анализ полиморфизма генов GSTT1 и GSTM1 выявил значительную гетерогенность по частотам нулевых и ненулевых генотипов у больных БП и здоровых лиц (рис. 2). Так, у больных доля нуль-генотипов гена GSTT1 на 52 % выше, чем у здоровых лиц; и по гену GSTM1 на 45,1 % выше, чем у здоровых лиц.
Поскольку ферменты GST играют важную роль в системе детоксикации, можно предполагать, что гено-токсические промежуточные метаболиты, возникающие на первой стадии детоксикации, из-за отсутствия ферментов второй фазы (GST) не утилизируются, а воздействуют непосредственно на дофаминпродуци-рующие клетки черной субстанции, провоцируя или ускоряя их дегенерацию.
Таким образом, независимо от того, какие именно патогенетические механизмы развития БП связаны с ферментами системы детоксикации, нет сомнения в том, что мутации в обоих генах GST, приводящие к потере активности соответствующих ферментов, можно рассматривать как фактор генетического риска развития БП.
Следующей задачей нашего исследования являлось сопоставление результатов анкетирования с данными молекулярно-генетического исследования. Данные сопоставления показали, что нулевые генотипы вы-шеизученных генов по сравнению с ненулевыми чаще встречались у лиц с более ранним дебютом заболевания, характеризовались более быстрыми темпами прогрессирования и развернутой картиной заболевания. Однако проведенное на данном этапе исследование является еще незавершенным. Нами проведено санитарно-гигиеническое исследование с использованием анкетного опросника по типу случай-контроль, где в качестве контрольной группы выступают лица, сопоставимые по возрасту и полу, не имеющие болезни Паркинсона. Также проводится рандомизация больных и здоровых по факту наличия или отсутствия воздействия неблагоприятных средо-вых факторов с последующим генофенотипическим сопоставлением. Результаты данных исследований будут представлены позже.
Результаты проведенного исследования содержания НСЕ в сыворотке крови больных с БП показали повышение уровня НСЕ у 24 (68,5 %) из 35 больных (> 25 нг/мл). Повышенное содержание НСЕ отмечалось у 58,3 % мужчин и 41,7 % женщин. Наиболее высокие показатели НСЕ определялись на начальных этапах заболевания. Были выявлены более высокие показатели уровня нейронспецифической енолазы у больных с быстрым темпом развития заболевания по сравнению с медленным и умеренным темпами развития. Как было описано выше, нейронспецифическая енолаза является основным маркером повреждения нервной ткани. В связи с этим более высокие показатели содержания нейронспецифической енолазы в сыворотке крови на начальных этапах заболевания и при более быстрых темпах прогрессирования, по-видимому, показывают большую степень выраженности повреждения клеток черной субстанции.
Больные были разделены на 3 подгруппы в зависимости от формы заболевания: больные со смешанной формой — 28 (80 %) человек, с дрожательной формой — 4 (11,4 %) человека, и с акинетико-ригидной формой — 3 (8,6 %) человека. Из 3 подгрупп только у больных с дрожательной формой БП колебание уровня НСЕ было в пределах нормы — от 11 до 15,3 нг/мл. Полученные результаты также подтверждают мнение многих исследователей (Галиева Г.Ю., 2008, Каря-кина Г.М., 2007 и др.) о том, что концентрация НСЕ может служить маркером более распространенных повреждений нервных клеток, что имеет место при акинетико-ригидной и смешанной формах, по сравнению с дрожательной. Таким образом, выявленное в данном исследовании повышение концентрации нейронспецифической енолазы в сыворотке крови у больных болезнью Паркинсона свидетельствует о патогенетической роли данного фермента в течении заболевания.
Выводы
1. Тестирование полиморфных вариантов генов детоксикации GSTM1, GSTT1 позволяет достаточно объективно оценить индивидуальный риск БП и, таким образом, внести серьезный вклад в предиктивное тестирование этого тяжелого, распространенного заболевания.
2. «Нулевые» генотипы генов GSTM1, GSTT1 ассоциируются с более ранним дебютом заболевания, более быстрыми темпами прогрессирования и развернутой картиной заболевания.
3. Повышенный уровень НСЕ отмечается в 69 % случаев у больных с БП, чаще встречается у больных со смешанной и акинетико-ригидной формой заболевания, и у больных с быстрыми темпами прогрессиро-вания заболевания.
4. Показатель НСЕ может использоваться как один из дополнительных методов диагностики и прогноза клинического течения БП.
Список литературы
1. Артемьев Д.В., Яхно Н.Н. Этиология и патогенез болезни Паркинсона//Рус. мед. журнал. — 2001. — № 9. — С. 4-9.
2. Багыева Г.Х. Клинико-генетический и биохимический анализ болезни Паркинсона: механизмы предрасположенности, экспериментальные модели, подходы к терапии: Автореф. дис... д-ра мед. наук. — Москва, 2009. — 48 с.
3. Байтимеров А.Р. Эпидемиологическое и клинико-генетиче-ское изучение болезни Паркинсона в Республике Башкортостан: Автореф. дис... канд. мед. наук. Уфа, 2007. — 22с.
4. Гилязова И.Р. Молекулярно-генетическое изучение болезни Паркинсона в Башкортостане // Автореф. дис... канд. биол. наук. — Уфа, 2004. — 24 с.
5. Джурич Г., Иллариошкин С.Н., Светел М. и др. Влияние комбинированных полиморфизмов в генах CYP2D6, PON1 и apoE на риск развития болезни Паркинсона// Сборник I Национального конгресса по болезни Паркинсона и расстройствам движений. — Москва, 2008. — С. 357.
6. Иллариошкин С.Н. Молекулярные основы болезни Паркинсона // Сборник I Национального конгресса по болезни Паркинсона и расстройствам движений. — Москва, 2008 — С. 8-17.
7. Иллариошкин С.Н., Джурич Г.М., Багыева Г.Х. и др. Генетическая предрасположенность к болезни Паркинсона// Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков, часть II// Мед. генетика. — 2005. — № 5. — С. 196.
8. Загоровская Т.Б., Иллариошкин С.Н., Слонимская П.А. и др. Клинико-генетический анализ ювенильного паркинсонизма в России // Журнал неврол. и психиатр. — 2004. — № 8. — С. 66-72.
9. Якимовский А.В., Пушнова Е.А., Ахмедова С.Н., Автономов В.В. Молекулярно-генетические и токсико-экологические основы этиологии и патогенеза болезни Паркинсона (паркинсонизма) //Журнал невропатол. и психиатр. — 1997. — № 4. — С. 69-73.
10. Пчелина С.Н., Якимовский А.Ф., Шварц Е.И. Наследственные основы болезни Паркинсона (обзор) // Медицинская генетика. — 2003. — № 9. — С. 411-425.
11. Chan D.K.Y., Woo J., Ho S.C. et al. Genetic and environmental risk factors for Parkinson's disease in a Chinese population //J. Neurol. Neurosurg Psychiatry. — 1998. — 65. — 781-784.
12. De Michele G., Filla A., Volpe G. et al. Environmental and genetic risk factors in Parkinson's disease: a case-control study in southern Italy//Mov. Disord. — 1996 Jan. — 11 (1). — 17-23.
13. Dick F.D., De Palma G, Ahmadi A. Geoparkinson study group. Environmental risk factors for Parkinson's disease and parkinsonism: the Geoparkinson study // Occup. Environ. Med. — 2007 Oct. — 64 (10). — 666-72.
14. Evangelou E., Maraganore D.M., Ioannidis J.P. Meta-analysis in genome-wide association datasets: strategies and application in Parkinson disease // PLoS ONE. — 2007. — 2:e196.
15. Gasser T. Genetics ofParkinson's disease// J. Neurol. — 2001 Oct. — 248 (10). — 833-40.
Получено 22.09.10 □
Маджидова Й.Н., ХаМмова Х.М., Ра!мова М.М., Матмурадов Р.Ж., Фахаргал!ева С.Р., Жмирко Е.В. Кафедра нервових хвороб Ташкентсько'1 медично! академй
!нститут генетики й експериментально! бюлогн рослин АН РУз, м. Ташкент, Узбекистан
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧН Й ДЕЯК BioxiMiHHi АСПЕКТИ ХВОРОБИ ПАРЮНСОНА
Резюме. Проведено молекулярно-генетичний анатз на наяв-шсть асощацш i3 хворобою Паркшсона (ХП) полiморфiзмiв генш GSTM1 (нульова аллель), GSTT1 (нульова аллель) у представниюв узбецько! нацюнальносп й визначення вмiсту нейронспецифiчноl енолази (НС6) у сироватщ кровi хворих на хворобу Паркшсона. Усього дослщжено 190 зразюв ДНК, у тому числi 140 зразюв ДНК хворих на БП i 50 зразив ДНК здорових осб i3 групи контролю. Бюхмчне дослщження проведене в 35 пащентш iз тривалгстю захворювання вщ 1 до 15 роюв. Аналiз полiморфiзму генш GSTT1 i GSTM1 виявив значну гетерогеншсть по частотах нульових i ненульових генотитв у хворих на БП i здорових оаб: у хворих частка нуль-генотитв гена GSTT1 на 52 % вище, i по гену GSTM1 на 45,1 % вище, н1ж у здорових оаб. Пщвищений рiвень НС6 вщзначався в 69 % випадив БП, частше у хворих зi змшаною й аюнетико-рипдною формою захворювання.
Kro40Bi слова: хвороба Паркшсона, гени детоксикаци, GSTT1, GSTM1, нейронспецифiчна енолаза.
Madzhidova Yo.N., Khalimova Kh.M., Raimova M.M., MatmurodovR.Zh., FakhargaliyevaS.R., Zhmyrko Ye.V. Chair of Nervous System Diseases of the Tashkent Medical Academy
Institute of Genetics and Experimental Plant Biology of AS of Republic of Uzbekistan, Tashkent, Uzbekistan
MOLECULAR GENETIC AND SOME BIOCHEMICAL ASPECTS OF PARKINSON'S DISEASE
Summary. In Uzbek population there was carried a molecular-genetic analysis of the polymorphisms of genes GSTM1 (null allele), GSTT1 (null allele) for associations with Parkinson's disease and determined the serum neuron-specific enolase (NSE) in patients with Parkinson's disease. There were examined 190 DNA samples in all, including 140 DNA samples of patients with PD and 50 DNA samples of healthy individuals from the control group. Biochemical studies were conducted in 35 patients with disease duration from 1 year to 15 years. Analysis of genetic polymorphism of GSTT1 and GSTM1 showed significant heterogeneity in prevalence of null and non-null genotypes in patients with PD and healthy subjects: the proportion of null genotypes of GSTT1 gene and GSTM1 gene is 52 % and 45,1 % higher respectively in patients with PD than in healthy individuals. The increased level of NSE was observed in 69 % of PD, most often in patients with mixed and akinetico-rigid form of the disease.
Key words: Parkinson's disease, detoxication genes, GSTT1, GSTM1, neuron-specific enolase.
