CC BY
26УДК 575.2:575.22:574.3 AGRIS: F30
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ В ЛЕСНОМ ХОЗЯЙСТВЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНОМНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
©Боронникова С. В., ORCID: 0000-0002-5498-8160, д-р биол. наук, Пермский государственный национальный исследовательский университет, г. Пермь, Россия, SVBoronnikova@yandex.ru ©Календарь Р. Н., ORCID: 0000-0003-3986-2460, канд. биол. наук, Республиканское государственное предприятие «Национальный центр биотехнологии» г. Астана, Казахстан, ruslan.kalendar@mail.ru ©Пришнивская Я. В., ORCID: 0000-0003-1513-2682, Пермский государственный национальный исследовательский университет, г. Пермь, Россия, yana_prishnivskaya@mail.ru ©Васильева Ю. С., 0RCID:0000-0002-2255-2434, канд. биол. наук, Пермский государственный национальный исследовательский университет, г. Пермь, Россия, Yulianechaeva@mail.ru ©Нассонова Е. С., ORCID: 0000-0002-7589-4913, Пермский государственный национальный исследовательский университет, г. Пермь, Россия, lena.nassonova@mail.ru ©Красильников В. П., ORCID: 0000-0003-0776-0339, Пермский государственный национальный исследовательский университет, г. Пермь, Россия, trait969@gmail.com
MOLECULAR-GENETIC IDENTIFICATION IN FORESTRY WITH USING
OF GENOMIC TECHNOLOGIES
©Boronnikova S., ORCID: 0000-0002-5498-8160, Dr. habil., Perm State University, Perm, Russia, SVBoronnikova@yandex.ru ©Kalendar R., ORCID: 0000-0003-3986-2460, Ph.D., RSE "National Center for Biotechnology ", Astana, Kazakhstan, ruslan.kalendar@mail.ru ©Prishnivskaya YaORCID: 0000-0003-1513-2682, Perm State University,
Perm, Russia, yana_prishnivskaya@mail.ru ©Vasileva Yu., ORCID:0000-0002-2255-2434, Ph.D., Perm State University, Perm, Russia, Yulianechaeva@mail.ru ©Nassonova E., ORCID: 0000-0002-7589-4913, Perm State University,
Perm, Russia, lena.nassonova@mail.ru ©Krasilnikov V., ORCID: 0000-0003-0776-0339, Perm State University, Perm, Russia, trait969@gmail.com
Аннотация. Проведены молекулярно-генетический анализ и идентификация шести популяций Pinus sylvestris L., которые расположены на востоке Русской равнины с использованием ISSR-метода анализа полиморфизма ДНК. У шести изученных популяций Р. sylvestris выявлены 135 ISSR-PCR маркеров, из которых 128 были полиморфными (P95= 0,948). В изученных популяциях выявлено 9 редких ISSR-PCR маркеров. Выявлены идентификационные мономорфные видовые и полиморфные ISSR-PCR маркеры, а также их сочетания для молекулярно-генетической идентификации изученных популяций.
Составлены молекулярно-генетические формулы и штрих-коды шести популяций P. sylvestris.
Abstract. Molecular-genetic analysis and identification of six populations of Pinus sylvestris L. located in East of Russian plain with using of ISSR-method DNA polymorphism analysis was held. 135 ISSP-PCR markers of six researched P. sylvestris populations was identified, 128 of which were polymorphic (P95= 0.948). In researched populations 9 rare ISSR-PCR markers were identified. Identification monomorphic species and polymorphic ISSR-PCR markers and their combinations for molecular-genetic identification of researched populations were detected. Molecular-genetic formulas and barcodes of six populations of P. sylvestris were prepared.
Ключевые слова: молекулярно-генетическая идентификация, ISSR-PCR маркер, штрих-код, P. sylvestris.
Keywords: Molecular-genetic identification, ISSR-PCR marker, barcode, P. sylvestris.
Популяции древесных растений занимают большие площади и, как правило, генотипы их растений более однотипны при сопоставлении с популяциями травянистых растений. Древесные растения имеют большую продолжительность жизни. Эти особенности древесных растений необходимо учитывать при характеристике генофондов, в том числе при описании их специфичности. Несмотря на то, что лес — возобновляемый ресурс, количество вырубок превышает количество новых посадок (возобновлений) [1]. Древесина является высококачественным энергетическим и трудно заменимым материалом, использующимся в строительстве, мебельной промышленности и других сферах деятельности [2, с. 115-119].
В современный период широкое распространение получило такое преступление, как незаконная рубка лесных насаждений (1). Неконтролируемая вырубка лесов приводит к уничтожению среды обитания живых организмов, эрозии почв, а в глобальном масштабе — к изменению климата (2). Согласно данным Министерства природных ресурсов и экологии РФ ущерб от незаконных рубок в 2014 г. составил 14 млрд руб. [3].
Существуют разнообразные технологии, направленные на идентификацию места происхождения древесины после ее вырубки [4].
Материалы и методы исследований
Молекулярно-генетическая идентификация проведена у шести популяций P. sylvestris, которые расположены на востоке Русской равнины: Ps1 — около п. Мордино Республики Коми, Ps2 — около п. Визинга Республики Коми, Ps3 — из Шабалинского лесничества Кировской области, Ps4 — из Ежихинского лесничества Кировской области, Ps5 — из Даровского лесничества, Кировской области; Ps6 — из Юрьянского лесничества, Кировской области. Молекулярно-генетический анализ и выявление идентификационных молекулярных маркеров проводилось по результатам ПЦР с пробами ДНК, выделенными как из хвои, так и из древесины.
Для проведения исследований собраны свежие вегетативные почки латеральных побегов индивидуально с 46 деревьев каждой популяции расположенных на расстоянии не менее 100 м. друг от друга. Тотальная ДНК выделена из хвои 276 деревьев с использованием модифицированной нами методики выделения ДНК С. O. Роджерса и Э. Дж. Бендича в котором в качестве сорбента использовался PVPP, то есть поливинилполипирролидон [5, с. 69-76].
Качество и характеристики ДНК определяли на приборе Spectrofotometr™ NanoDrop 2000 («Thermo scientific», USA). Молекулярно-генетическое анализ был проведены с применением ISSR (Inter Simple Sequence Repeats [7]) — метода полиморфизма ДНК. Смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала: 2 единицы Taq-полимеразы; 2,5 мкл 10х буфера + MgCl2 («Силекс М», Россия); 25 пМ праймера («Синтол», Россия); 0,25 мМ dNTP («Fermentas», Литва); 5 мкл ДНК. Амплификацию ДНК проводили в термоциклере GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA) с пятью ISSR-праймерами, эффективными для P sylvestris: ISSR-1 ((AC)gT), CR-212 ((CT)gTG), CR-215 ((CA)eGT), M27 ((GA)gC), X10 ((AGC>C).
В процессе ПЦР пробы ДНК амплифицировались по общепринятой для ISSR-метода программе: начальная денатурация 94 C, 2 мин.; первые 5 циклов 94 С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72 С, 10 сек.; в дальнейших 35 циклах 94 С, 5 сек.; t° отжига, 5 сек.; 72 °С, 5 сек. Температура отжига в зависимости от G/C состава праймеров изменялась от 54°С до 64°С. Для определения чистоты реактивов в качестве К — в реакционную смесь добавляли взамен ДНК 5 мкл деионизированной воды. Ампликоны разъединяли электрофорезом в 1,7% агарозном геле в 1* TBE буфере, окрашивали бромистым этидием. Для определения длин амликонов выбрали маркер молекулярной массы (100 bp + 1.5 + 3 КЬ DNA Ladder, (ООО «СибЭнзим-М», Москва).
Фотографирование и подсчет длин ампликонов проводили с помощью системы гель-документации GelDoc, а также программы Quantity One («Bio-Rad», USA). Проведено молекулярно-генетическое тестирование 135 ISSR-PСR маркеров у 276 деревьев Р. sylvestris, в матрице рассмотрены 37 260 позиций.
Генетическая идентификация была проведена по методике, предложенной С. В. Боронниковой с соавтором на примере природных популяций двух видов Populus tremula L. и Populus balsamifera L. [6].
Результаты и их обсуждение
При молекулярно-генетическом анализе Р. sylvestris выявлено 135 ISSR-PCR маркеров, из которых 128 были полиморфными (P95=0,948). Число ISSR-PCR маркеров Р. sylvestris варьировало в зависимости от праймера от 13 (праймер М27) до 31 (праймер X10) а их размеры — от 150 до 1650 п. н. В среднем один ISSR-праймер инициировал у Р. sylvestris синтез 16,7 ISSR-PCR маркеров. Число полиморфных маркеров в общей выборке Р. sylvestris варьировало от 23 до 28, а доля полиморфных локусов в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 0,903 до 1,000 (Таблица 1).
Для характеристики генетической структуры популяций важны редкие, то есть встречающиеся с частотой менее 5%, маркеры. В изученных популяциях Р. sylvestris выявлено 9 редких ISSR-PCR маркеров, из которых в популяциях Ps1, Ps2 и Ps6 по одному ISSR-PCR маркеру, в популяциях Ps3 и Ps4 — по 3 уникальных ISSR-PCR маркеров, а в популяции Ps5 уникальных ISSR-PCR маркеров не обнаружено. Для молекулярно-генетической идентификации отобраны наиболее информативные ISSR-праймеры, с помощью которых выявлены видовые и полиморфные ISSR-маркеры и проведен отбор идентификационных молекулярных маркеров, а также определены их сочетания для идентификации популяций (Таблица 2).
Таблица 1.
ХАРАКТЕРИСТИКА ISSR-PCR МАРКЕРОВ В ЧЕТЫРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ P. sylvestris
ISSR-прай-меры
Нуклео-тидная последовательность (5'^ 3')
Длина маркеров, п. н.
Ps1
Число полиморфных ISSR-PCR маркеров в популяциях
На общую выборку
Ps2
Ps3
Ps4
Ps5
Ps6
всего
полиморф-ных
ISSR-1
CR-212
CR-215
M27
X10
(АС)*Т
(CT)8TG
(CA)6GT
(GA)8C
(AGC)6C
220-1350
2301550 1501200 1501020 2101650
11 12 9 8 18 15
(0,733) (0,857) (0,563) (0,533) (0,857) (0,714)
12 12 6 8 21 20
(0,706) (0,750) (0,462) (0,500) (1,000) (0,952)
18 18 8 8 17 14
(0,857) (0,900) (0,533) (0,533) (0,850) (0,700)
11 9 7 6 16 15
(0,647) (0,642) (0,438) (0,400) (0,727) (0,682)
13 21 9 10 19 22
(0,722) (0,913) (0,529) (0,588) (0,826) (0,917)
65 72 39 40 90 86
24
27
26
27
31
23 (0,958) 26 (0,963) 26 (1,000)
25 (0,926) 28 (0,903)
Всего ISSR-маркеров (в скобках дана их частота)
(0,739) (0,827) (0,506) (0,513) (0,841) (0,796)
135
128 (0,948)
Примечание: Ps1 — популяция, расположенная около п. Мордино Республики Коми, Ps2 — популяция, расположенная около п. Визинга Республики Коми, Ps3 — популяция, из Шабалинского лесничества Кировской области, Ps4 — популяция, из Ежихинского лесничества Кировской области, Ps5 — из Даровского лесничества, Кировской области; Ps6 — из Юрьянского лесничества, Кировской области
Таблица 2.
ХАРАКТЕРИСТИКА ИДЕНТИФИКАЦИОННЫХ ISSR-PCR МАРКЕРОВ ПОПУЛЯЦИЙ
P. sylvestris
Обозначение праймера Нуклеотидная Размеры последовательность ISSR-PCR ISSR-PCR маркеры, избранные для идентификации
(5'^ 3') маркеров, п. н.
Мономорфные ISSR-PCR маркеры
CR-212 (CT)8TG 1550-2530 psv670cr212 psv450cr212 psv390cr212
M27 (GA)8C 1020-150 psv500m27 psv460m27
X10 (AGC)6C 1650-210 PSv440X10
Полиморфные ISSR-PCR маркеры
ISSR-1 (АС)*Т 1350-220 Ps6p 1115is1 Ps1p930IS1 Ps5p800IS1
CR-212 (CT)8TG 1550-230 Ps6p 880CR212 Ps6p420CR212 Ps4p290CR212 Ps1p260CR212 Ps4p250CR212
CR-215 (CA)6GT 1200-150 Ps3p1400CR215 Ps5p1250CR215 Ps3p1200CR215
M27 X10 (GA)8C (AGC)6C 1020-150 1650-210 Ps1p210M27 Ps1p180M27 Ps1p170M27 Ps2p350M27 Ps4p1650X10 Ps4p900X10 Ps6p770X10 Ps6p720X10 Ps3p410X10 Ps5p300X10 Ps2p250X10 Ps5p230^ Ps2p200X10
Примечание: PSv — ISSR-PCR маркеры, характерные для всех популяций; Ps1p, Ps2p, Ps3p и Ps4p — полиморфные ISSR-PCR маркеры, характерные для отдельных популяций.
Молекулярные маркеры, избранные для идентификации четырех популяций Р. sylvestris, представлены в виде молекулярно-генетической формулы, при составлении которой использовались так называемые «видовые» и «полиморфные» ISSR-PCR маркеры.
«Родовые» ISSR-PCR маркеры использованы не были, так как для их обнаружения необходимо исследовать еще один вид рода Pinus. Мономорфные ISSR-PCR маркеры, характерные для вида, обозначены как PSv, а полиморфные как: Pslp — для популяции Ps1, Ps2p — для популяции Ps2, Ps3p — для популяции Ps3, Ps4p — для популяции Ps4. Основная характеристика молекулярного маркера (его длина) указана большими буквами после указания типа маркера — Ps1p260cR2i2. В молекулярно-генетической формуле приведены тип и номер праймера нижним индексом. Так, молекулярный маркер Ps3p1200cR2i5 выявлен ISSR-методом c использованием праймера CR215. В случае, когда праймер возможно записать в виде короткой формулы как при ISSR-анализе, запись молекулярного маркера можно представить в следующем виде Ps3p1200(CA)6GT. Данная форма записи молекулярного маркера является самой информативной.
Таким образом, в предлагаемой записи молекулярно-генетической формулы указан вид растения, тип амплифицированного ISSR-PCR маркера, его размер и дана характеристика исследуемой части генома посредством указания метода анализа полиморфизма ДНК и номера или последовательности праймера.
Для изученных популяций Р. sylvestris установлены шесть видовых ISSR-PCR маркеров, выявленные у всех изученных популяций: PSv670cR2i2, PSv500M2, PSv460m27, PSv450cr212, PSv440xio, PSv390cR2i2. На основе ISSR-спектров удалось установить идентификационные ISSR-PcR маркеры или их сочетания для популяций, с достаточно высокой частотой встречаемости в популяции. Для популяции Psi идентификационными маркерами являются Ps1p930iSi, Ps1p260cR2i2, Ps1p210M27, Ps1p180M27, Ps1p170M27; для популяции Ps2 — Ps2p350M27 Ps2p250xio Ps2p200xio; для Ps3 — Ps3p1400cR2i5 Ps3p1200cR2i5 Ps3p410xio; для Ps4 — Ps4p1650xio Ps4p900xio Ps4p290cR2i2 Ps4p250cR2i2; для популяции Ps5 — Ps5p1250cR2i5; Ps5p800iSi; Ps5p300xio; Ps5p230xio; для популяции Ps5 — Ps6p1115iSi; Ps6p 880cr212; Ps6p770xio; Ps6p720xio; Ps6p420cR2i2. На основании полученных данных были составлены молекулярно-генетические формулы для изученных популяций Р. sylvestris (Таблица 3).
Таблица 3.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФОРМУЛЫ ЧЕТЫРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ P. sylvestris
Ps1 vid psv670cr212 psv500m27 psv460m27 psv450cr212 psv440x10 sv390cr212
polymorph Ps1p930lS1Ps1p260CR212Ps1p210M27 Ps1p180M27 Ps1p170M27
Ps2 vid psv670cr212psv500m27psv460m27 psv450cr212psv440x10 sv390cr212
polymorph Ps2p350M27 Ps2p250X10 Ps2p200X10
Ps3 vid psv670cr212psv500m27psv460m27 psv450cr212psv440x10 sv390cr212
polymorph Ps3p1400CR215 Ps3p1200CR215 Ps3p410X10
Ps4 vid psv670cr212psv500m27psv460m27 psv450cr212psv440x10 sv390cr212
polymorph Ps4p1650X10 Ps4p900X10 Ps4p290CR212 Ps4p250CR212
Ps5 vid psv670cr212psv500m27psv460m27 psv450cr212psv440x10 sv390cr212
polymorph Ps5p1250CR215; Ps5p800iS1; Ps5p300X10; Ps5p230X10
Ps6 vid psv670cr212psv500m27psv460m27 psv450cr212psv440x10 sv390cr212
polymorph Ps6p1115IS1; Ps6p 880cr212; Ps6p770^; Ps6p720X10; Ps6p420CR212
Примечание: PSv — . SSR-PCR маркеры, характерные для всех популяций; Ps1p, Ps2p, Ps3p, Ps4p,
Ps5p и Ps6p — полиморфные ISSR-PCR маркеры, характерные для отдельной популяции.
На основании полученных молекулярно-генетических формул рекомендуется составлять штрихкоды [7]. Как молекулярно-генетическая формула, так и штрихкод позволят
идентифицировать принадлежность особей не только к роду и виду, но и к определенной популяции.
Родовые маркеры предлагается обозначить толстой линией, видовые — линией средней толщины, а полиморфные маркеры — тонкой линией. Для штрихкода предлагается использовать от 9 до 12 штрихов. КВЯ-РСЯ маркеры в штрихкоде располагаются в зависимости от их длины от большего к меньшему (Рисунок).
Маркер мол. массы, п. н.
Штрихкод
№ ISSR-PCR маркера
Обозначение маркера
1500
1000
900
800
700
600
500
400
1 2
4
5
6
7
8 9
Ps3p1400CR215 Ps3p1200CR215
PSv670CR212
PSv500M27 PSv460M27 PSv440X10
Ps3p410X10 PSv390CR212
PSv450CR212
Рисунок. Штрих-код популяции Ps3, расположенной в Шабалинском лесничестве Кировской области.
Заключение
Таким образом, в основу методики молекулярно-генетической идентификации популяций заложен молекулярный анализ высоко полиморфных областей геномов изучаемых видов. Молекулярно-генетическая идентификация популяций включает в себя молекулярно-генетический анализ на основании полиморфизма КВЯ-РСЯ маркеров, выявление идентификационных маркеров, редких и уникальных аллелей, составление для каждой популяции молекулярно-генетической формулы и штрихкода.
Источники:
(1). Статья 260 УК РФ, в ред. Федерального закона от 04.12.2006. №201-ФЗ.
(2). Основные положения по лесовосстановлению и лесоразведению в лесном фонде Российской Федерации // Утверждены приказом Федеральной службы лесного хозяйства России от 27 декабря 1993. №344.
Sources:
(1). Article 260 of the Criminal Code, in red. Federal Law of 04.12.2006. no. 201-FZ.
(2). Main provisions on reforestation and afforestation in the forest fund of the Russian Federation. Approved by Order of the Federal Forest Service of Russia of December 27, 1993. No. 344.
3
Список литературы:
1. Ветчинникова Л. В., Титов А. Ф., Кузнецова Т. Ю. Карельская береза: биологические особенности, динамика ресурсов и воспроизводство. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2013. 312 с.
2. Боронникова С. В. Молекулярно-генетический анализ и оценка состояния генофондов ресурсных видов растений Пермского края. Пермь: Перм. гос. нац. исслед. ун-т. 2013. 223 с.
3. Клейнхоф И. А. Глобальные аспекты развития лесного сектора экономики // Лесной вестник. 2008. №5. С. 115-119.
4. Rogers S. O., Bendich A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biology. 1985. V. l. №19. P. 69-76.
5. Zietkiewicz E. Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. V. 20. P. 176-183.
6. Боронникова С. В., Календарь Р. Н. Использование IRAP-метода для анализа генетической изменчивости популяций ресурсных и редких видов растений // Генетика. 2010. Т. 46. №1 С. 44-50.
7. Пат. 2012119341 Российская Федерация A01H1/00. Способ молекулярно-генетической идентификации популяций древесных видов растений / Боронникова С. В., Бобошина И. В., заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет» №2012119341; заявл.11.05.2012; опубл. 10.02.2014.
References:
1. Vetchinnikova, L. V., Titov, A. F., & Kuznetsova, T. Yu. (2013). Karelian birch: biological features, resource dynamics and reproduction. Petrozavodsk: Karelian Research Center of the Russian Academy of Sciences, 312.
2. Boronnikova, S. V. (2013). Molecular genetic analysis and assessment of the state of gene pools of resource species of plants in the Perm Krai. Perm: Perm. state. nat. Issled. un-t. 223.
3. Kleinhof, I. A. (2008). Global aspects of the development of the forest sector of the economy. Forest Herald, (5). 115-119.
4. Rogers, S. O., & Bendich, A. J. (1985). Extraction of DNA from milligram quantities of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology, l (19). 69-76.
5. Zietkiewicz, E. Rafalski, A., & Labuda, D. (1994). Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, (20). 176-183.
6. Boronnikova, S. V., & Calendar, R. N. (2010). Using the IRAP-method for analysis of genetic variability of populations of resource and rare plant species. Genetika, 46 (1). 44-50.
7. Pat. 2012119341 Russian Federation A01H1/00. Method for molecular genetic identification of populations of woody plant species. Boronnikova, S. V., & Boboshina, I. V., applicant and patent holder Federal State Budget Educational Institution of Higher Professional Education "Perm State National Research University" №2012119341; Application 11.05.2012; publ. 10/02/2014.
Работа поступила Принята к публикации
в редакцию 15.06.2018 г. 18.06.2018 г.
Ссылка для цитирования:
Боронникова С. В., Календарь Р. Н., Пришнивская Я. В., Васильева Ю. С., Нассонова Е. С., Красильников В. П. Молекулярно-генетическая идентификация в лесном хозяйстве с использованием геномных технологий // Бюллетень науки и практики. 2018. Т. 4. №7. С. 2633. Режим доступа: http://www.bulletennauki.com/boronnikova-sv (дата обращения 15.07.2018).
Cite as (APA):
Boronnikova, S., Kalendar, R., Prishnivskaya, Ya., Vasileva, Yu., Nassonova, E., & Krasilnikov, V. (2018). Molecular-genetic identification in forestry with using of genomic technologies. Bulletin of Science and Practice, 4(7), 26-33.
