Научная статья на тему 'Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редкого вида растений Пермского края Adenophora lilifolia (L. ) А. DC'

Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редкого вида растений Пермского края Adenophora lilifolia (L. ) А. DC Текст научной статьи по специальности «Биология»

CC BY
247
59
Поделиться
Ключевые слова
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ / ПОЛИМОРФИЗМ / ИДЕНТИФИКАЦИЯ / ПАСПОРТИЗАЦИЯ / ISSR И IRAP-МАРКЕРЫ / РЕДКИЙ ВИД

Аннотация научной статьи по биологии, автор научной работы — Боронникова Светлана Витальевна, Нечаева Юлия Сергеевна

Технология молекулярно-генетической идентификации и сертификации была апробирована на четырех популяциях редкого реликтового вида растений Пермского края Adenophora lilifolia (L.) А. DC. Молекулярно-генетический анализ с использованием двух типов молекулярных маркеров на основе ПЦР позволил выявить сочетания специфических фрагментов ДНК. Составлены молекулярно-генетической формулы, штриxкоды и генетические паспорта популяций, даны рекомендации по сохранению популяционных генофондов этого вида.

Похожие темы научных работ по биологии , автор научной работы — Боронникова Светлана Витальевна, Нечаева Юлия Сергеевна,

The molecular-genetic identification and sertification of rare species of plants of Perm krai Adenophora lilifolia (L.)

The technology of the molecular-genetic identification and certification was tested on four populations of rare relict species of plants of Perm krai Adenophora lilifolia (L.) А. DC. Molecular-genetic analysis used two types of molecular markers based on PCR revealed a combinations of specific fragments of DNA. Moleculargenetic formula, barcodes and genetic passport of populations were composed, recommendation for the conservation of the gene pool of this species were given.

Текст научной работы на тему «Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редкого вида растений Пермского края Adenophora lilifolia (L. ) А. DC»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2012 БИОЛОГИЯ Вып. 1

ЭКОЛОГИЯ

УДК 575.174.015.3:582.992

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ПАСПОРТИЗАЦИЯ РЕДКОГО ВИДА РАСТЕНИЙ ПЕРМСКОГО КРАЯ ADENOPHORA LILIFOLIA (Ь.) А. DC.

С. В. Боронникова, Ю. С. Нечаева

Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; SVBoronnikova@yandex.ru; (342)2396229

Технология молекулярно-генетической идентификации и сертификации была апробирована на четырех популяциях редкого реликтового вида растений Пермского края Adenophora Шifolia (Ь.) А. DC. Молекулярно-генетический анализ с использованием двух типов молекулярных маркеров на основе ПЦР позволил выявить сочетания специфических фрагментов ДНК. Составлены молекулярно-генетической формулы, штрихкоды и генетические паспорта популяций, даны рекомендации по сохранению популяционных генофондов этого вида.

Ключевые слова: генетическое разнообразие; полиморфизм; идентификация; паспортизация; ISSR и ГЯАР-маркеры; редкий вид.

Введение

В настоящее время весьма актуальна проблема выбора объектов для сохранения популяционных генофондов редких видов растений, которая может быть решена с использованием молекулярных маркеров и технологии молекулярно-генетической идентификации и паспортизации. К числу редких декоративных, имеющих лекарственное значение, видов растений Урала относится Adenophora Шifolia (Ъ.) А. DC. - бубенчик лилиелистный из семейства Сат-рапиіасеае Juss. Вид внесен с категорией 3 (Я, редкий вид) в Красную книгу Пермского края [2008]. Является реликтом [Камелин, Овеснов, Шилова, 1999]. А. ШірНа в Пермском крае находится на границе ареала. В связи с хозяйственным освоением территорий общая численность ценопопуляций А. Шifolia на территории Пермского края за последние 10 лет в среднем сократилась на 15-20% [Красная книга ..., 2008].

Цель работы - провести молекулярно-генетическую идентификацию и паспортизацию четырех ценопопуляций А. Шifolia в Пермском крае и провести отбор ценопопуляций для сохранения генофонда этого вида.

Материалы и методы

Первая ценопопуляция (Ad1) расположена в травяном сосняке на территории историко-

природного памятника (г. Подкаменная) в Кунгур-ском районе Пермского края, вторая ценопопуляция (Ad2) - в березовом редколесье в 2 км на север от с. Енапаево Октябрьского района, третья (Ad3) - в смешанном лесу в 2,5 км на северо-запад от с. Усть-Турка Кунгурского района, а четвертая (Ad4) - на территории парка «Кузьминка» пос. Ильинский Ильинского р-на, являющегося историкоприродным комплексом. Наименьшее географическое расстояние между изученными ценопопуля-циями - 63 км, а наибольшее - 174 км.

Для анализа генетического полиморфизма ДНК A. lilifolia были собраны листья с 35 случайно выбранных особей в каждой популяции на расстоянии от 30 до 50 м друг от друга. Выделение ДНК проводили по методике A.M. Torres, N.F. Weeden, A. Martin [1993]. Анализ полиморфизма ДНК проведен у 720 проб ДНК посредством полимеразной цепной реакции [Молекулярная генетика, 2007] с использованием ISSR-метода (Inter Simple Sequence Repeats) [Zietkiewicz, Rafalski, Labuda, 1994] и IRAP-метода (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) [Kalendar et al., 1999]. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация проведена по методике С.В. Боронниковой [2008]. Для выявления фрагментов ДНК, общих для видов рода Adenophora, выделили ДНК из проростков A. triphylla и провели молекулярногенетический анализ с использованием ISSR- и IRAP-маркеров.

© Боронникова С. В., Нечаева Ю. С., 2012

Результаты и их обсуждение

На первом этапе технологии молекулярногенетической идентификации и паспортизации в избранных для изучениях ценопопуляциях А. Шifolia были собраны фрагменты листьев, из которых выделена ДНК и проведен ПЦР-анализ. Кроме этого, геномная ДНК была выделена из проростков двух видов рода Adenophora (А. Шifolia и А. triphylla). На втором этапе разработки технологии в изученных ценопопуляциях А. Шifolia выявлено 56 ISSR- и 149 ШАР-маркеров. Один ISSR

праймер в среднем выявлял 11 маркеров, а один ШАР-праймер - 23,5 маркеров. На третьем этапе технологии были отобраны наиболее информативные для рода Adenohpora ISSR- и ГЯАР-праймеры. На четвертом этапе для особей двух видов рода Adenohpora (А. Шifolia, А. triphylla) выделены четко воспроизводимые 11 мономорфных и 11 полиморфных фрагментов ДНК. На пятом этапе идентификационные маркеры ДНК, сочетания которых характерны для ценопопуляций, были представлены в виде молекулярно-генетических формул (таблица).

Молекулярно-генетические формулы популяций А. иЩойа

Популяция Тип фрагментов ДНК Молекулярно-генетическая формула

Adi rod Ad r1610iR59; Adr840xio; Adr400^s; Adr370iR96

vid Adlilv1220iR96; Adlilvi050M8; Adlilv920xii; Adlilv440iR56

polimorph Adlilp1100iR57; Adlilp920Mi; Adlilp760iR59; Adlilp670iR56

Ad2 rod Adr840xi0; Adr400M8; Adr500Mi; Adr420x9

vid Adlilv1050M8; Adlilv920xii; Adlilv 800x9

polimorph Adlilp850Mi; Adlip330Mi; Adlilp500x9

Ad3 rod Adr840xi0; Adr400M8; Adr500Mi; Adr420x9

vid Adlilvi050M8; Adlilv920xii; Adlilv800x9

polimorph Adlilp700Mi; Adlilp 400xii

Ad4 rod Adr 840xi0; Adr400M8; Adr500Mi; ; Adr420x9

vid Adlilvi050M8; Adlilv920xii; Adliv800x9

polimorph Adlilp750M8; Adlilp600xii

Для паспортизации рода Adenohpora отобрали по 4 фрагмента ДНК, общих и специфических для двух видов этого рода. Запись фрагмента ДНК в соответствии с предложенной нами ранее методикой молекулярно-генетической паспортизации [Борон-никова, 2008] проводилась с указанием типа фрагмента (родовой, видовой, полиморфный), длины фрагмента и указания нижним индексом праймера. Выявленные фрагменты ДНК, общие для особей двух видов рода Adenohpora, названы «родовыми» и обозначены первыми буквами названия рода Ad с указателем «г» от «го&> нижним индексом. Полиморфные фрагменты ДНК обозначены индексом «р» от «роИтогрЬ»

На шестом этапе помимо буквенно-цифровой записи молекулярно-генетического паспорта популяций использовалась графическая запись в виде штрих-кода (рисунок).

На седьмом этапе рекомендуется составление генетического паспорта популяции. Нами разработана форма генетического паспорта популяции редкого вида растений, избраны общепринятые показатели состояния популяций и генетического разнообразия.

Среди изученных ценопопуляций А. Шifolia типичным генофондом обладает третья ценопопуля-ция (Ad3), так как содержит типичные для региона исследований аллели. К объектам сохранения со специфичными характеристиками генофондов относится ценопопуляция А. Шifolia, расположенная на горе Подкаменной (Ad1), так как содержит наи-

большее число редких, нетипичных для изучаемого региона аллелей. Первая и третья ценопопуля-ции А. Шifolia рекомендуются в качестве объектов для сохранения генетического разнообразия этого вида в Пермском крае.

Заключение

Основным результатом технологии молекулярно-генетической идентификации и паспортизации редких видов растений является механизм обобщения данных молекулярно-генетического анализа посредством выявления идентификационных маркеров. Результаты кластеризации представляются в обобщенном виде молекулярногенетической формулы и штрихкода, вносятся наряду с общепринятыми показателями состояния ценопопуляции и характеристикой ее генетического разнообразия в генетический паспорт. Новый способ записи содержит полную информацию об идентификационном молекулярном маркере, включая вид растения, тип молекулярного маркера, его размер и характеристику исследуемой части генома посредством указания метода анализа полиморфизма ДНК и номера или последовательности праймера. Методика генетической паспортизации на основе ISSR- и ГЯАР-маркеров имеет высокую разрешающую способность, дает стабильно воспроизводимые результаты, характеризуется высоким уровнем стандартизации как набора маркеров, так и техники выполнения анализа.

Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация ... Adenophora lilifolia

43

Данная методика может найти применение как при разработке мер охраны и восстановления природных ценопопуляций, так и при идентификации растительного сырья лекарственных растений, яв-Маркер

молекулярной Штрихкод

массы, пн

ляется относительно недорогой и при наличии эффективных 1ЯАР-праймеров пригодна для массового анализа.

1600

1500

1400

1300

1200

1100

1000

900

800

№ фрагмента ДНК 1

Обозначение фрагмента Adr 1610ir59

Ad.li.v1220n

Ad.lilp1110iR57

Ad.lilv1050M8

Ad.lilv 930x11 Ad.lilp 920mi Adr 840xi0 Ad. lilp760iR59

700

600

500

400

10

11

12

Ad.lilp670iR56

Ad.lilv 440ir56

Adr 400m8 Adr 370ir96

Штрих-код первой популяции А. Шifolia (Ad1):

Adг - родовые, А(!ШУ- видовые фрагменты ДНК, Ad.lilp - полиморфные фрагменты ДНК

2

9

Для сохранения популяционных генофондов A. lilifolia в Пермском крае рекомендованы третья ценопопуляция (Ad3) с типичным генофондом и первая ценопопуляция (Ad1), обладающая специфическим генофондом.

Работа выполнена в рамках государственного задания на оказание услуг, финансируемых Министерством образования и науки РФ из средств федерального бюджета.

Библиографический список

Боронникова С.В. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редких и находящихся под угрозой уничтожения видов растений / Перм. ун-т. Пермь, 2008. 120с. Боронникова С.В. Изучение генетической изменчивости популяций редкого вида Урала Adenophora lilifolia (L.) DC на основе ISSR-маркеров // Генетика. 2009. Т. 45, № 5. С. 652-655.

Красная книга Пермского края / под общ. науч. ред. А.И. Шепеля. Пермь: Кн. мир, 2008. 256 с.

Камелин Р.П., Овеснов С.А., Шилова С.И. Неморальные элементы во флорах Урала и Сибири. Пермь: Изд-во Перм. ун-та, 1999. 83c.

Молекулярная генетика: учеб.-метод. пособие / под ред. С.В. Боронниковой. Пермь, 2007. 150 с.

Kalendar R. et al. IRAP and REMAP: two new retro-transposon-based DNA fingerprinting techniques // Theor. and Applied Genetics. 1999. Vol. 98. P. 704-711.

Torres A.M., Weeden N.F., Martin A. Linkage among sozyme, RFLP and RAPD markers in Vicia faba // Theor Appl. Genet. 1993. Vol. 5. P. 937-945.

Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. Vol. 20. P. 176-183.

Поступила в редакцию 14.02.2012

The molecular-genetic identification and sertification of rare species of plants of Perm krai Adenophora lilifolia (L.) А. DC.

S. V. Boronnikova, doctor of biology, professor; SVBoronnikova@yandex.ru; (342)2396229 Y. S. Nechaeva, post-graduate student;Yulianechaeva@yandex.ru Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia,614990

The technology of the molecular-genetic identification and certification was tested on four populations of rare relict species of plants of Perm krai Adenophora lilifolia (L.) А. DC. Molecular-genetic analysis used two types of molecular markers based on PCR revealed a combinations of specific fragments of DNA. Molecular-genetic formula, barcodes and genetic passport of populations were composed, recommendation for the conservation of the gene pool of this species were given.

Key words: genetic diversity; polymorphism; identification; sertification; ISSR and IRAP-markers; rare species.

Боронникова Светлана Витальевна, доктор биологических наук, профессор

Нечаева Юлия Сергеевна, аспирант

ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»