CC BY-ND
21
ЦШШ №12 (261) ЗНиСО
39
I.H
6.
Graigie J. Application and control of ethyl-ether-walter interface effect to separation of rickettsia from yolk sac/ Graigie J.// Canad. Res., E. 1945. 8. 23. 104—114. Шпынов С.Н. и др. Новые данные о распространении риккетсий RpA4 и R.aeschlimannii в Северной Азии / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, М.А. Танкибаев [и др.] //Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2002. Т. 2. №4. С. 136-138. Samoylenko I.E., Rudakov N.V., Shpynov S.N., et al. Study of biological characteristics of spotted fever group rickettsial genotypes RpA4, DnS14 and DnS28 // Ann. NY Acad. Sci. 2003. Vol.990. P. 612-616.
Mediannikov O. et al. Rickettsia raoultii sp.nov., a spotted fever group rickettsia associated with Dermacentor ticks in Europe and Russia / O. Mediannikov, K. Matsumoto, I. Samoylenko [et al] //Int .J.Syst.Evol. Microbiol. 2008. №58. P. 1635—1639.
Контактная информация: Contact information:
Кумпан Людмила Валерьевна, Kumpan Lyudmila, тел.: 8 (923) 685-32-93, '
е-mail: Ludmilavirus@mail.ru
V-
phone: тел.: 8 (923) 685-32-93, e-mail: Ludmilavirus@mail.ru
616.98:578.833.6:577.21
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, ВЫДЕЛЕННЫХ В 1958-1960 ГОДАХ В ПРИМОРСКОМ КРАЕ
И.Г. Кондратов1, Т.Н. Леонова2, О.С. Майстровская2, С.И. Беликов1 'Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск 2НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г. Владивосток
Материалы серии статей доложены на научной конференции с международным участием «Актуальные аспекты природной очаговости болезней» (г. Омск, 12—13 ноября 2014 г.), организованной при частичной поддержке гранта РФФИ № 14-04-20351
Охарактеризованы геномы 8 штаммов вируса клещевого энцефалита (КЭ), выделенные в период с 1958 по 1960 год из различных источников. Предсказанные аминокислотные последовательности полипротеина характерны для дальневосточного субтипа вируса КЭ. Филогенетический анализ штаммов по предсказанным аминокислотным последовательностям позиционирует все штаммы в ветвь Софьино-подобных штаммов. У трех штаммов ВКЭ обнаружена обширная делеция в гене NS4 протяженностью 30 аминокислотных остатков. Кроме того, у трех штаммов вируса КЭ обнаружена гетерогенность в 3' нетранслируемой области генома.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, геном, репликация, патогенность.
I.G. Kondratov, G.N. Leonova, O.S. Maistrovskaya, S.I. Belikov □ MOLECULAR-GENETIC CHARACTERISTIC TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS STRAINS, ISOLATED ON RUSSIAN FAR-EAST REGION IN 1958—1960 □ Limnological Institute of the SB RAS, Irkutsk; Institute of Epidemiology and Microbiology of the SB RAMS, Vladivostok.
In this work we describe molecular-genetic properties 9 full genomes of tick-borne encephalitis virus strains, isolated in Far East region during period 1958 to 1960from various sources. The predicted amino acid sequences of the polyprotein gene are similar of the Far Eastern subtype tick-borne encephalitis virus. Phylogenetic analysis predicted amino acid sequences shown are highly homology to Sofjin-like trains. Three strains detected extensive deletion length 30 amino acid residues in the NS4B ' gene, without loss ofpathogenicity. Additionally, the heterogeneity found in the 3 'untranslated region in the three strains.
Key words: tick-borne encephalitis virus, genome, replication, pathogenicity.
Клещевой энцефалит (КЭ) является наиболее значимой трансмиссивной природно-очаговой вирусной инфекцией лесной зоны Евразийского континента. Заболеваемость КЭ регистрируют более чем в 25 странах Европы и 7 странах Азии, в Российской Федерации (РФ) — на 46 административных территориях, в том числе на 18 территориях Сибири и Дальнего Востока. В Российской Федерации в 1990-х гг. ежегодно регистрировали более 10 тысяч случаев КЭ. В 2000-х гг. интенсивный показатель заболеваемости КЭ по РФ стал заметно снижаться
[1]. Несмотря на его снижение в 2006 г. до 2.44 на 100 тыс. населения, по мнению Г.Г. Онищенко
[2], эпидемическая ситуация по КЭ в РФ остается напряженной.
На данный момент существует ряд работ, посвященных поиску взаимосвязи между структурой вирусного генома и тяжестью заболевания [3, 4]. Между тем, все имеющиеся работы опираются на достаточно современный материал. Самый «старый» геном вируса КЭ датируется 1938 годом (штамм Софьин), а далее имеется перерыв в несколько десятилетий. Для понимания механизмов эволюции вируса КЭ наиболее актуальным
на сегодняшний день является анализ материала, отражающего динамику накопления изменений в вирусном геноме. Целью данной работы является анализ структуры геномов более «ранних» штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа, датируемых 1958-1960 гг.
Материалы и методы. Суммарную РНК выделяли реагентом Trizol (Life Technology) согласно протоколу фирмы-производителя. Синтез первой цепи кДНК осуществляли с помощью набора Maxima Reverse Transcriptase (Thermo Scientific) с использованием четырнадцатичленного олигонукле-отидного праймера 5'-GGAAAAACACCCGC-3', комплементарного 3'нетранслируемому участку генома. Амплификацию проводили с использованием набора High Fidelity PCR Enzyme Mix (Thermo Scientific). Ампликоны фрагментов геномов, содержащих 3' нетранслируемую область, клонировали в вектор pTZ-57R, анализ рекомбинантов осуществляли посредством амплификации с использованием стандартных универсальных плаз-мидных олигонуклеотидных праймеров. Анализ ампликонов осуществляли в агарозном геле по общепринятым методикам. Секвенирование полученных ампликонов осуществляли с использо-
40
ЗНиСО pm №12 (261)
ванием BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technology). Анализ первичных нуклеотид-ных и предсказанных аминокислотных последовательностей осуществляли с использованием пакета программ BioEdit и программ онлайн-сервиса expasy.org.
Результаты и обсуждение. В ходе работы были культивированы 6 штаммов вируса КЭ из коллекции 1958 года и по одному штамму 1959 и 1960 годов, которые были изолированы Л.Г. Татариновой [5]. Все штаммы до настоящего времени в сублимированном состоянии сохранялись при температуре -20 °С в лаборатории КЭ НИИЭМ СО РАМН. Первичный пассаж осуществляли путем внутримозгового заражения неинбредных белых мышей 2-суточного возраста. Типичные симптомы заболевания появлялись на 7—15 сутки. Продолжительность инкубационного периода, очевидно, была связана с разной степенью сохранности коллекционного вируссодержаще-го материала, что требовало проведение дополнительных 1—2-внутримозговых пассажей на мышах-сосунках. Список штаммов, а также их краткая характеристика представлены в таблице.
При проведении полногеномного секвени-рования у трех штаммов (1285, 1056 и 1001) обнаружена обширная делеция в гене полипротеина, которая ранее никем не была описана. В участке полипротеина, соответствующем неструктурному гену NS4, протяженная делеция в 30 аминокислотных остатков затрагивает гидрофильный участок петли белка. Небольшие гидрофобные белки NS4A и NS4B имеют размеры 16 и 27 кДа соответственно, их точные функции пока не известны. Наиболее вероятно то, что они принимают участие в формировании репликативного комплекса [6, 7] и обеспечивают закрепление репликазы вируса на мембране посредством образования комплекса с геликазным доменом белка NS3. На данный момент мы не можем с уверенностью сказать, что именно приводит к такой существенной делеции. Но тот факт, что мутация не затрагивает ни один трансмембранный домен белка, свидетельствует о том, что конформационные изменения в белке не являются фатальными для вируса. Кроме того, способность к накоплению штаммов вируса с делецией в гене NS4B не отличаются от титров штаммов без этой мутации, что опять-же говорит о способности вируса к репродукции как in vivo, так и на культуре клеток.
Нуклеотидные последовательности всех восьми анализируемых штаммов вируса являются "— высоко консервативными. Процент гомологии с прототипным штаммом Sofjin_HO составляет ^ 95 %, с незначительными вариациями от штамма к штамму. Длины 5' нетранслируемых участков геномов вируса содержат 131 нуклеотид и явля- ^^ ются консервативными. Имеется лишь несколько е единичных мутаций, не коррелирующих с вирулентностью. Протяжённость 3' нетранслируемых участков генома среди штаммов существенно отличается. Кроме того выявлены штаммы, у которых существует гетерогенность 5' нетранслируе-мых областей генома.
Анализ 3' нетранслируемых участков выявил существенную гетерогенность как среди штаммов, так и внутри одного штамма. Подобная гетерогенность в 3' нетранслируемой области была отмечена ранее [8]. Анализ ампликонов, фланкированных последними нуклеотидами кодирующей последовательности и 3' консервативным участком конца геномной РНК, показал у некоторых штаммов помимо основного ампликона имеются несколько минорных компонентов меньшей молекулярной массы. Фрагменты меньшей массы, поначалу воспринимавшиеся как неспецифические в ходе амплификации, были клонированы в плазмид-ный вектор и секвенированы. Полученные первичные нуклеотидные последовательности в ходе выравнивания оказались фрагментами вирусного генома со значительными делециями. Интересен тот факт, что наличие такого рода гетерогенности в пределах одного штамма, полученного, например, из пула клещей, имеет достаточно логическое объяснение, заключающееся в том, что мы имеем в данном случае дело со «смесью» штаммов. С другой стороны, не менее интересен тот факт, что среди восьми проаналазарованных штаммов присутствует один, выделенный из крови больного пациента с укусом клеща и имеющий в 3' нетранслируемой области гетерогенную структуру. Объяснение этому может иметь несколько вариантов. Во-первых, так называемый процесс кофидинга, при котором несколько клещей, присосавшихся достаточно близко друг к другу на одном носителе, могут помимо уже имеющегося варианта вируса приобрести новый вариант. В подобных работах [9] утверждается, что такой опосредованный способ передачи (по сути от клеща к клещу) является основным механизмом под-
Таблица. Характеристика штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в 1958—1960 гг. в Приморском крае
№ п/п Наименование штамма Год Источник Титр вируса lgLD50 /1мл Индекс инвазивности (И.И.) Титр вируса на СПЭВ (1&БОЕ)
в/м п/к
1 696 1960 Мозг умершего 10 8,3 1,7 2,1 х 109
2 1035 1958 Мозг умершего 8,8 6,2 2,6 4,9 х 109
3 1284 1958 Кровь на 9-й день болезни 8,8 4,5 4,3 -
4 1285 1958 Кровь на 5-й день болезни 9,5 7,1 2,4 2,5 х 109
5 1001 1958 I. persulcatus 33 самок+15 самцов 9,3 9,0 0,3 2,1 х 109
6 1056 1958 I. persulcatus 19 самок 9,0 6,4 2,6 3,2 х 109
7 949 1958 И. japonica 50 экз. 10 8,2 1,8 4,3 х 104
8 512 1959 Мозг лесной мыши 10 9,0 1,0 2,4 х 109
ЦШШ №12 (261) ЗНиСО
41
г-Ь
держания циркуляции вируса среди переносчиков. Другой механизм появления гетерогенности в 3' нетранслируемой области генома вируса КЭ может объяснятся процессами приспособления вируса к новому хозяину. Известно, что вирус КЭ циркулирует в природе посредством циклической передачи от клеща к мелким млекопитающим и возвращением в клещей, где вирус сохраняется и размножается длительное время. Стадия выживания вируса в клетках млекопитающих является необходимой, но несущественной по времени [10, 11]. Удаленный в клетках млекопитающих фрагмент вирусного генома не может вновь появиться в клетках клеща в чередующихся циклах передачи вируса от клеща к млекопитающим и вновь к клещам. Этот факт может означать, что удаление фрагмента 3' нетранслируемеого участка генома не является количественным, поэтому часть вирусной популяции в клетках млекопитающих имеет полноразмерный 3' нетранслируемый участок.
ЛИТЕРАТУРА
Онищенко Г.Г. Клещевой и другие вирусные энцефалиты //Материалы конференции Эпидемиологическая обстановка и стратегия борьбы с клещевым энцефалитом на современном этапе. М., 2003. С. 5—8 Онищенко Г.Г. и др. Организация надзора за клещевым вирусным энцефалитом и меры по его профилактике в Российской Федерации / Г.Г. Онищенко, Ю.М. Федоров, Н.Д. Пакскина //Вопросы вирусологии. 2007. 5. С. 8—10. Беликов С.И. и др. Кодирующие нуклеотидные последовательности штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных из крови людей без клинических проявлений
1.
инфекции / С.И. Беликов, Г.Н. Леонова, И.Г. Кондратов, Е.В. Романова, Е.В. Павленко Генетика. 2010. 46 (№ 3). С. 356—363.
4. Belikov S.I., Kondratov I.G., Potapova U.V., Leonova G.N. The relationship between the structure of the tick-borne encephalitis virus strains and their pathogenic properties. PLoS One 2014. 9 (4): e94946. doi:10.1371/journal.pone.0094946
5. Татаринова Л.Г. Характеристика очагов клещевого энцефалита в Приморском крае /Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Л., 1962.
6. MillerS., Kastner S., Krijnse-Locker J. et al. The nonstructural protein 4A of dengue virus is an integral membrane protein inducing membrane alterations in a 2K-regulated manner. The Journal of Biological Chemistry. 2007. 282 (12): 8873-8882
7. Umareddy I., Chao A., Sampath A., Gu F., Vasudevan S.G. Dengue virus NS4B interacts with NS3 and dissociates it from single-stranded RNA. Journal of General Virology. 2006. 87 (9): 2605-2614.
8. Wallner G., Mandl C.W., Kunz C., Heinz F.X. The flavivirus 3 -noncoding region: extensive size heterogeneity independent of evolutionary relationships among strains of tick-borne encephalitis virus. Virology. 1995. 213 (1): 169-178
9. KhasnatinovM.A., Katarina Ustanikova, Frolova T.V., Pogodina V.V., Bochkova N.G., Levina L.S. et al. Non-Hemagglutinating Flaviviruses: Molecular Mechanisms for the Emergence of New Strains via Adaptation to European Ticks. PLoS ONE 2009. 4(10): e7295. doi:10.1371/journal.pone.0007295
10. Nuttall P.A., Dynamics of infection in tick vectors and at the tick-host interface. Advances in Virus Research. 2003. 60: 233-272.
11. Robertson S.J., Mitzel D.N., Taylor R.T., Best S.M., Bloom M.E. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures. Immunologic Research. 2009. 43 (1-3): 17
Контактная информация: Contact Information:
Кондратов Илья Геннадьевич, Kondratov Ilya, тел.: 8 (3952) 51-18-74, е-mail: igkondratov@rambler.ru
V-
phone: 8 (3952) 51-18-74, e-mail: igkondratov@rambler.ru
УДК 579.61: 616.993-002.942.1
ВЫЯВЛЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА МИКРООРГАНИЗМОВ В КЛЕЩАХ, ОТЛОВЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ В СЕЗОН 2014 ГОДА
О.Р. Князева, А.Г. Красько
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии
и микробиологии, г. Минск, Республика Беларусь
Материалы серии статей доложены на научной конференции с международным участием «Актуальные аспекты природной очаговости болезней» (г. Омск, 12—13 ноября 2014 г.), организованной при частичной поддержке гранта РФФИ № 14-04-20351
Изучено присутствие в клещах, снятых с людей в различных регионах Республики Беларусь в сезон 2014 г., наиболее актуальных патогенов, таких как Borrelia burgdorferi sensu lato, вирус клещевого энцефалита, Anaplasma phagocytophylum, Ehrlichia chaffeensis/ Ehrlichia muris. В результате исследований выявлены ДНК Borrelia burgdorferi sensu lato (37,33 % случаев), Anaplasma phagocytophylum(4%), РНК вируса клещевого энцефалита(11,33 %). ДНК Ehrlichia chaffeensis/Ehrlichia muris в исследуемых образцах не выявлена.
Ключевые слова: Borrelia burgdorferi sensu lato, вирус клещевого энцефалита, Anaplasma phagocytophylum, Ehrlichia chaffeensis/Ehrlichia muris, ПЦР.
O.R. Kniazeva, A.G. Krasko □ INVESTIGATION OF TICK-BORNE PATHOGENS IN TICKS REMOVED FROM PATIENTS IN BELARUS □ Republican Research and Practical Center for Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus.
To investigate the presence ofpathogens Borrelia burgdorferi sensu lato, Tick-borne encephalitis virus, Anaplasma phagocytophylum, Ehrlichia chaffeensis/Ehrlichia muris, in ticks removed from patients in Belarus. The studies revealed the presence of DNA Borrelia burgdorferi sensu lato (37,33 %), Anaplasma phagocytophylum (4%) and RNA of the tick-borne encephalitis virus (11,33 %). DNA of Ehrlichia chaffeensis /Ehrlichia muris in the samples was not detected.
Key words: tick borne pathogens, Borrelia burgdorferi sensu lato, Tick-borne encephalitis virus, Anaplasma phagocytophylum, Ehrlichia chaffeensis/Ehrlichia muris, PCR.
Клещи являются основными переносчиками инфекционных заболеваний человека и животных в природных условиях Беларуси и способны передавать больше патогенов, чем любые другие членистоногие (болезнь Лайма, клещевой эн-
цефалит, анаплазмоз, риккетсиозы, туляремия, Ку-лихорадка и др.) [1]. Циркуляция патогенных микроорганизмов поддерживается, как правило, в стабильных природных циклах, связанных с клещами, дикими животными и/или домашними
